實(shí)驗(yàn)二凝集沉淀反應(yīng)演示文稿

實(shí)驗(yàn)二凝集沉淀反應(yīng)演示文稿當(dāng)前第1頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)的概念。2.了解單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的原理、方法及應(yīng)用。3.掌握直接凝集反應(yīng)玻片法的原理、方法及其用途。4.掌握雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果判斷。當(dāng)前第2頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)1.直接凝集反應(yīng)：顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后所呈現(xiàn)的肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

。2.沉淀反應(yīng)：可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第3頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)

傷寒桿菌診斷血清、傷寒桿菌菌液、生理鹽水、載玻片、接種環(huán)、記號筆、酒精燈；瓊脂板、打孔器、針頭、毛細(xì)滴管、待測血清、AFP陽性血清、AFP診斷血清（兔抗人AFP）等。實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.直接凝集反應(yīng)：玻片法（操作）2.沉淀反應(yīng)：（1）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（示教）（2）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（操作）當(dāng)前第4頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)又稱血清學(xué)反應(yīng)，主要有：1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、補(bǔ)體參與反應(yīng)4、中和反應(yīng)5、免疫標(biāo)記技術(shù)常見抗原抗體反應(yīng)的種類當(dāng)前第5頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)一、凝集反應(yīng)

(一)概念

顆粒性抗原(細(xì)菌、細(xì)胞等)與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，稱為凝集反應(yīng)。顆粒性Ag又稱凝集原相應(yīng)Ab又稱凝集素當(dāng)前第6頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)原理玻片凝集試驗(yàn)是一種快速簡便的檢測方法，即抗原抗體的反應(yīng)在玻片上進(jìn)行，是一種定性的試驗(yàn)。用已知抗體檢測未知抗原。本試驗(yàn)用已知的傷寒桿菌標(biāo)準(zhǔn)診斷血清鑒定未知細(xì)菌。直接凝集反應(yīng)玻片法--菌種鑒定

材料傷寒桿菌診斷血清、傷寒桿菌菌液、生理鹽水、載玻片、接種環(huán)、蠟筆、酒精燈等。當(dāng)前第7頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)取潔凈玻片1張，用蠟筆劃分2等份，如下圖所示；無菌操作，用接種環(huán)分別于一、二格內(nèi)各加2～3環(huán)傷寒桿菌診斷血清、生理鹽水；用接種環(huán)取待測菌液，分別涂布于生理鹽水和傷寒血清中，混勻；輕輕搖動玻片，1~2分鐘后觀察結(jié)果。操作步驟生理鹽水＋待測菌液陰性傷寒血清＋待測菌液？直接凝集反應(yīng)玻片法--菌種鑒定當(dāng)前第8頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)鹽水側(cè)無凝集顆粒；血清側(cè)出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊為陽性，仍為均勻一致乳濁液者為陰性。注意事項(xiàng)1、接種環(huán)在傷寒菌液取菌前后均需嚴(yán)格滅菌，以免出現(xiàn)假陽性。2、注意涂菌時，先涂生理鹽水側(cè)，以免污染血清產(chǎn)生錯誤結(jié)果。3、搖動玻片時不要把兩凹內(nèi)液體混在一起。結(jié)果及判斷直接凝集反應(yīng)玻片法--菌種鑒定當(dāng)前第9頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)經(jīng)典抗原抗體反應(yīng)的一種。

分類:瓊脂擴(kuò)散環(huán)狀沉淀反應(yīng)絮狀沉淀反應(yīng)免疫電泳二、沉淀反應(yīng):沉淀線或沉淀環(huán)可溶性抗原相應(yīng)抗體+當(dāng)前第10頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：

瓊脂是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時溶于水，冷卻后凝固，形成凝膠，呈多孔結(jié)構(gòu)，充滿水分，允許各種抗原抗體分子自由擴(kuò)散。二者于比例適當(dāng)處相遇，發(fā)生沉淀，形成可見的沉淀帶。單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn):僅抗原或抗體擴(kuò)散

——定量實(shí)驗(yàn)雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn):抗原和抗體同時擴(kuò)散

——定性實(shí)驗(yàn)分類：當(dāng)前第11頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)（一）單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（示教）原理:

適宜濃度的抗體預(yù)先在瓊脂中混勻后制成瓊脂板，以適當(dāng)距離打孔，將可溶性抗原至孔中，抗原向周圍擴(kuò)散，與瓊脂中抗體相遇，抗原與抗體比例適宜時，出現(xiàn)沉淀。沉淀環(huán)的直徑與孔中抗原濃度呈正相關(guān)，可根據(jù)沉淀環(huán)直徑大小從預(yù)先繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出待測標(biāo)本中抗原含量。本試驗(yàn)方法簡單，容易觀察結(jié)果，可測定抗原的靈敏度約為10～20μg／ml.

應(yīng)用:

人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量檢測。當(dāng)前第12頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)單向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn):抗原濃度沉淀環(huán)直徑平方AgAgAgAg瓊脂中含抗體1:101:201:401:80Ag未知當(dāng)前第13頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)（二）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（操作）原理:

將可溶性抗原與相應(yīng)抗體兩種溶液置于瓊脂糖凝膠的不同位置，使兩者在凝膠中各自向四周擴(kuò)散,抗原與抗體相遇并在比例合適處形成可見的乳白色沉淀線。應(yīng)用:

檢測AFP、HBsAg,協(xié)助疾病診斷.當(dāng)前第14頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)材料：待測血清、AFP陽性血清、AFP診斷血清（兔抗人AFP）、生理鹽水、瓊脂板、打孔器、針頭、毛細(xì)滴管、酒精燈。雙向瓊脂擴(kuò)散法測血清中AFP甲胎蛋白（AFP）：

是一種在胚胎期由肝細(xì)胞和卵黃囊合成的α球蛋白，存在于胎兒血清中，出生后血清中AFP幾乎消失。正常成人血清中僅含極微量的AFP，經(jīng)典的免疫學(xué)方法檢測不出。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時，AFP含量增高，測血清中AFP，可協(xié)助診斷原發(fā)性肝癌。當(dāng)前第15頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)1、制備瓊脂板：

1%鹽水瓊脂加熱溶化，取5ml均勻鋪與載玻片上。2、打孔：瓊脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，針頭取出孔中瓊脂。3、封底：用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂剛剛要熔化為止，封閉孔的底部，以防側(cè)漏。4、加樣：中間孔加抗AFP抗體，1、4孔加AFP陽性對照，2、3孔加待檢血清，5、6孔加生理鹽水。5、反應(yīng)：于濕盒，37C24h?？笰FP抗體123456123456雙向擴(kuò)散法測血清中AFP操作步驟AgAgAg?Ag?Ab當(dāng)前第16頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)3421561、4兩孔（陽性對照孔）與中心孔之間應(yīng)出現(xiàn)清晰的乳白色沉淀線，5、6（陰性對照孔）兩孔與中心孔之間無沉淀線。3421562、3兩孔（待測血清）如與中心孔之間也出現(xiàn)了沉淀線，且一端與相鄰的陽性對照血清形成的沉淀線相吻合，則該待測血清為陽性。如待測血清與中心孔出現(xiàn)了沉淀線，但與陽性對照血清的沉淀線相交叉，不判為陽性。如待測血清24h內(nèi)與中心孔間無沉淀線則為陰性。雙向擴(kuò)散法測血清中AFP實(shí)驗(yàn)結(jié)果當(dāng)前第17頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)1、瓊脂板一定平整、光滑(無氣泡)，瓊脂不可過厚；2、打孔不要劃破邊緣；3、加樣要加滿而不溢出為止；4、合理分配吸管，Ag、Ab吸管不能混淆。雙向擴(kuò)散法測血清中AFP注意事項(xiàng)當(dāng)前第18頁\共有21頁\編于星期三\22點(diǎn)凝集反應(yīng)與沉淀反應(yīng)的比較凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)抗原性質(zhì)顆粒性或可溶性抗原致敏顆粒可溶性反應(yīng)時間幾分鐘數(shù)小時至數(shù)天反應(yīng)產(chǎn)物凝集塊沉淀物