實(shí)驗(yàn)溶菌酶的粗提取分離純化及酶活力純及分子量測定演示文稿

實(shí)驗(yàn)溶菌酶的粗提取分離純化及酶活力純度及分子量測定演示文稿當(dāng)前第1頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)溶菌酶的粗提取分離純化及酶活力純度及分子量測定當(dāng)前第2頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.溶菌酶的粗提取2.溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測定3.溶菌酶純度鑒定與分子量測定3當(dāng)前第3頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)背景知識(shí)溶菌酶（lysozyme）：胞壁質(zhì)酶（muramidase）或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。生物學(xué)效應(yīng)：主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。該酶活性可被一些金屬離子Cu2+，F(xiàn)e2+，Zn2+以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+，Ca2+、NaCl所激活4當(dāng)前第4頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)5當(dāng)前第5頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)6溶菌酶理化性質(zhì)：相對(duì)分子質(zhì)量14700Da，由129個(gè)氨基酸殘基構(gòu)，pI:~10.8，最適溫度為50℃，最適pH為6～7左右。280nm的消光系數(shù)為13.0當(dāng)前第6頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)7背景知識(shí)：酶的提取、分離純化初步純化（roughfractionation）（提?。喊衙笍纳锝M織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。

高度純化（finefractionation）（精純化）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。純化方案評(píng)價(jià)：酶活力、蛋白濃度、純度當(dāng)前第7頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)8

粗純化（

提?。┠繕?biāo)：

a.將目的酶最大限度地溶解出來。

b.保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（0~10℃）操作。提取原則a.相似相溶。b.遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。當(dāng)前第8頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)9離心分離（一）基本原理1.離心力

Fc=mac

＝mr

ω2

＝mr

（2N/60）2

N為離心機(jī)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）；

Fc通常以相對(duì)離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字g）表示。RCF=mr

（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r

此公式描述了相對(duì)離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替

r平均=1/2（r大+r?。ヽm

當(dāng)前第9頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)10

通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對(duì)離心力（RCF）表示，如：65000g。兩者可換算或查測算圖。當(dāng)前第10頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)11名稱

轉(zhuǎn)速(r/min)

注意事項(xiàng)

低速離心機(jī)

6000

常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡

高速離心機(jī)

6000?25000冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡

超速離心機(jī)

>25000冷凍＋真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡

離心機(jī)的種類

當(dāng)前第11頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)12離心的形式角式及水平（外擺）式：水平式一般為低速。角式由低速到超速均有。當(dāng)前第12頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)13角式離心機(jī)和離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。當(dāng)前第13頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)14離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強(qiáng)度：和離心速度相配大?。汉娃D(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋當(dāng)前第14頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)15離心機(jī)操作平衡、定溫、定速、定時(shí)。當(dāng)前第15頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)16實(shí)驗(yàn)一、

溶菌酶的粗提取——略當(dāng)前第16頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)17酶精純化常用技術(shù)膜分離技術(shù)柱層析技術(shù)蛋白質(zhì)結(jié)晶透析超濾凝膠過濾（分子篩/排阻）層析離子交換層析疏水層析吸附層析親和層析反相層析當(dāng)前第17頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)18PrinciplesofOperationfor

ChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinity

ReversedPhase當(dāng)前第18頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)二、溶菌酶的分離純化及酶活力、蛋白濃度測定目的：1.掌握離子交換層析原理及層析操作所需的必須原件。2.掌握層析柱填裝方法及層析填料的保存3.掌握比色法測定溶菌酶的濃度與酶活19當(dāng)前第19頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)原理：

根據(jù)溶菌酶pI10.8，pH8.0

PBS中攜帶？電，與陰/陽離子層析填料可結(jié)合，通過吸附后，提高pH或離子強(qiáng)度將溶菌酶與其他蛋白進(jìn)行分離達(dá)到純化目的。溶菌酶對(duì)革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的酶解作用導(dǎo)致細(xì)菌完整性破壞，OD600值會(huì)下降，通過單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）OD600值的下降評(píng)價(jià)酶活性。溶菌酶的活力單位（U）：在室溫，pH8.0的條件下，OD600每分鐘降低0.001為1個(gè)活力單位。280nm的消光系數(shù)為13.0，根據(jù)A=ECL可粗略測定溶菌酶濃度，用于酶比活的評(píng)價(jià)。20當(dāng)前第20頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)21離子交換層析

（ionexchangechromatography，IEC）當(dāng)前第21頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)222.離子交換填料：離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。

纖維素瓊脂糖葡聚糖

載體電荷基團(tuán)—O—CH2—COO-—Na+反離子1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。當(dāng)前第22頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)23離子交換劑--帶有電荷基團(tuán)的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE)

陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì))

陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))當(dāng)前第23頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)24兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽離子交換劑：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3當(dāng)前第24頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)25

化學(xué)原料合成：sephadexsepharose載體

天然材料制成：cellulose

如：DEAE-Sepharose，CM-Sepharose當(dāng)前第25頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)26

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理利用不同的蛋白質(zhì)分子在溶液中所帶電荷不同，因而與離子交換劑有不同吸附力而分離。pH8.0pI>8.0蛋白質(zhì)帶正電pI<8.0蛋白質(zhì)帶負(fù)電溶菌酶pI:~10.8當(dāng)前第26頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)272.陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過程平衡吸附去吸附分離結(jié)束再生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-當(dāng)前第27頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)283.操作平衡上樣沖洗洗脫再生1）上樣：上樣體積不十分嚴(yán)格。2）洗脫:

增加溶液的離子強(qiáng)度

梯度洗脫法

（連續(xù)、不連續(xù)）改變?nèi)芤旱膒H值

3）再生：0.5-1mol/LNaCl溶液處理。4.應(yīng)用制備純化生物大分子當(dāng)前第28頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)29梯度洗脫方式當(dāng)前第29頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)30圖4-39梯度溶液的制備方法和洗脫曲線（a）線性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）編程梯度當(dāng)前第30頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)31

層析柱的制備與層析操作

柱層析的設(shè)備:

層析柱、蠕動(dòng)泵（恒流泵）、檢測儀、部分收集器、梯度洗脫器。當(dāng)前第31頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)32層析設(shè)備層析裝置：梯度混和器蠕動(dòng)泵層析柱監(jiān)測儀記錄儀收集器

當(dāng)前第32頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)33記錄儀當(dāng)前第33頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)現(xiàn)代化層析設(shè)備

——AKTA層析柱XKBPG當(dāng)前第34頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)2.1層析柱的填裝1.觀摩2.實(shí)驗(yàn)步驟1）測定酶濃度（S-2）C(mg/ml)=A280/132）若填料載量為20mg/ml，計(jì)算擬純化100mg蛋白需要的填料量和量取量。35當(dāng)前第35頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)3）裝柱要點(diǎn)：a.用純水將乙醇保存液置換b.柱頭及柱底適配器確保無氣泡，可用注射器推注趕氣泡，并確保連接管路密閉無泄漏。c.填料傾倒入柱管內(nèi)前先加入少量水覆蓋柱底d.柱拆卸后填料務(wù)必回收，并保存于20%乙醇中。36當(dāng)前第36頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)二、酶的活力單位及酶活測定：1.酶活單位：1961年國際生化協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)統(tǒng)一規(guī)定，酶的國際單位（IU）規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件（溫度25℃）下，每分鐘內(nèi)催化1微摩爾（μmol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量（或1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成1微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為1標(biāo)準(zhǔn)單位。

當(dāng)前第37頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)382.酶的比活力：

每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。對(duì)固體酶：用活力單位/mg酶蛋白、或活力單位/mg酶蛋白氮來表示；對(duì)液體酶：用活力單位/ml酶液來表示。很明顯，比活力越大，酶的活力越大。當(dāng)前第38頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)分光光度法：產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑生成有色物質(zhì)或產(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法。測壓法：產(chǎn)物中有氣體，測氣壓增加量。滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物可用此法。旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。

除了以上方法外，還可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)采用其它方法。3.具體測定方法

當(dāng)前第39頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)4.回收率和純化倍數(shù)回收率＝×100％提純后酶總活力提純前酶總活力純化倍數(shù)＝每次比活力第一次比活力當(dāng)前第40頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)41實(shí)驗(yàn)2.2溶菌酶的活性測定實(shí)驗(yàn)材料：1.枯草芽孢桿菌懸液2.S1，S23.PBS等4.分光光度計(jì)、比色皿、計(jì)時(shí)器、離心機(jī)等當(dāng)前第41頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)42實(shí)驗(yàn)步驟：1.取6ml菌懸液，3500rpm*5min，棄上清，沉淀6mlPBS重懸。2.測定OD600并記錄（吸光度0.5~1.0，若讀數(shù)過高可適當(dāng)稀釋）3.測定樣品準(zhǔn)備（酶液務(wù)必在儀器等條件準(zhǔn)備好，臨測定前加入）比色皿1234PBS緩沖液/ml5---細(xì)胞PBS懸液/ml-54.84.8酶液S1/ml--0.2酶液S2/ml0.2當(dāng)前第42頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)43實(shí)驗(yàn)步驟：4.酶活性測定，以①管（PBS）為對(duì)照，每隔30s測定2,3,4管的OD600并記錄5.酶活力及比活性計(jì)算：U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2C(mg/ml)=A280/136.純化回收率及純化倍數(shù)計(jì)算時(shí)間（s）03060901201501802號(hào)

3號(hào)

4號(hào)

回收率＝×100％US2*V2US1*V1純化倍數(shù)＝S2比活力S1比活力當(dāng)前第43頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)44樣品體積ml蛋白濃度mg/ml總蛋白

mg活力

u/ml比活力

u/mg總活力

U回收率%提純倍數(shù)S1V1＝

1001S2V2＝

7.完成下表當(dāng)前第44頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)45實(shí)驗(yàn)3溶菌酶的純度鑒定與分子量測定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、通過實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)與操作，在實(shí)驗(yàn)過程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）測定蛋白質(zhì)純度與分子量的原理與依據(jù)；2、掌握電泳原理以及SDS垂直板電泳分析蛋白質(zhì)技術(shù)；3、熟悉垂直板電泳操作原理和方法，凝膠染色與脫色方法，SDS分子量測定圖譜的繪制與計(jì)算；4、了解在電泳中分子量標(biāo)準(zhǔn)物的使用。當(dāng)前第45頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)46SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）簡稱SDS－PAGE。用于蛋白純度及蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量（relativemolecularmass,Mr）測定。1.原理當(dāng)前第46頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)471.原理

SDS是一種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。

SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm），長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。因此，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。當(dāng)前第47頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)48

SDSseparatesproteinsbyMW當(dāng)前第48頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)49

蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：遷移率；k、b均為常數(shù)將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)其相對(duì)遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。當(dāng)前第49頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)50當(dāng)前第50頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)512.分離效應(yīng)

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)

連續(xù)PAGE當(dāng)前第51頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳

凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。電荷效應(yīng):分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。

當(dāng)前第52頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)532.實(shí)驗(yàn)步驟：（SDS）1）母液配制2）制膠準(zhǔn)備:

玻璃板清洗、干燥制膠架的準(zhǔn)備：嚴(yán)格按說明書組裝制膠架注意：輕拿輕放文明操作，避免玻璃板破損制膠架松動(dòng)及其他設(shè)施偏離工作要求。當(dāng)前第53頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)542.實(shí)驗(yàn)步驟：（SDS）3）制膠:

分離膠、濃縮膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇15%的分離膠，如表配制當(dāng)前第54頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)55濃縮膠（10ml）雙蒸水0.5mol/LpH6.8Tris-HCl30%膠貯液10%SDSTEMED10%AP5%3.4ml0.63ml0.83ml50μl5μl50μl分離膠（20ml）雙蒸水1.5mol/LpH8.8Tris-HCl膠貯液10%SDSTEMED10%AP12%3.3ml2.8ml2.5ml2.0ml4ml5ml100μl4μl100μl當(dāng)前第55頁\共有60頁\編于星期三\22點(diǎn)563、按比例配好分離膠，用移液管快速加入，大約5cm左右，之后加少許蒸餾水，靜置30分鐘。凝膠配制過程要迅速，催化劑TEMED要在注膠前再加入，否則凝結(jié)無法注膠。注膠過程最好一次性完成，避免產(chǎn)生氣泡。水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。4、倒出水并用濾紙把剩余的水分吸干，按比例配好濃縮膠，連