有機(jī)分離分析技術(shù)分離技術(shù)詳解

有機(jī)分離分析技術(shù)分離技術(shù)詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有103頁\編于星期四\1點優(yōu)選有機(jī)分離分析技術(shù)分離技術(shù)當(dāng)前第2頁\共有103頁\編于星期四\1點任課教師許世超：副教授，碩導(dǎo)聯(lián)系方式：Email:xsc_tjpu@163.com研究方向：微納米材料，環(huán)境微生物，DNA檢測當(dāng)前第3頁\共有103頁\編于星期四\1點課程目的以科研及實際工作常用的實際分析程序為主線，綜和運用各種近現(xiàn)代方法和手段，對一些復(fù)雜化學(xué)品進(jìn)行分離、富集、分析結(jié)合實驗使同學(xué)了解并掌握這一領(lǐng)域的概況、基礎(chǔ)知識和常用方法。了解前沿的技術(shù)和應(yīng)用，掌握新的分離、富集、分析的基本步驟和程序。當(dāng)前第4頁\共有103頁\編于星期四\1點主要內(nèi)容經(jīng)典分離與提純方法介紹:

萃取法,蒸餾，重結(jié)晶,透析，升華，分餾，柱色譜（離子交換，常規(guī)硅膠柱色譜等），TLC等近現(xiàn)代儀器分離方法：

GC，HPLC，GPC(Depends)裝置與操作、實例膜技術(shù)介紹及應(yīng)用課程實驗：GC應(yīng)用，HPLC應(yīng)用，膜技術(shù)的應(yīng)用，TLC應(yīng)用，F(xiàn)PLC應(yīng)用.重點是介紹分離方法的原理（如果時間足夠），以及鍛煉實驗操作技術(shù)當(dāng)前第5頁\共有103頁\編于星期四\1點課時分配1傳統(tǒng)分離分析方法介紹2氣相色譜法-原理、色譜柱介紹3氣相色譜法-實際應(yīng)用、儀器介紹4經(jīng)典柱色譜、離子交換、TLC應(yīng)用5高效液相色譜-原理、色譜柱介紹6高效液相色譜-儀器介紹、應(yīng)用7吸附分離技術(shù)8膜分離技術(shù)9纖維狀分離材料及其性能研究10氣相色譜應(yīng)用實驗1112液相色譜應(yīng)用實驗1314中空纖維膜組件分離蛋白質(zhì)溶液1516薄層色譜應(yīng)用1718經(jīng)典柱色譜應(yīng)用1920考試當(dāng)前第6頁\共有103頁\編于星期四\1點本課程主要參考文獻(xiàn)(Chinese)

當(dāng)前第7頁\共有103頁\編于星期四\1點預(yù)測（in20min）姓名，專業(yè)，方向，畢業(yè)院校，本科所學(xué)專業(yè)，現(xiàn)在導(dǎo)師題目：你了解哪些分離、富集技術(shù)，嘗試舉例有一個液、固混合物，請設(shè)計簡單方案進(jìn)行分離、純化。一個未知液狀、透明的樣品中可能含有，陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑、染料、其他添加劑，可否設(shè)計方案將其一一分離并鑒定，嘗試列出流程圖。能否利用TLC，HPLC進(jìn)行未知物的定性分析？依據(jù)？當(dāng)前第8頁\共有103頁\編于星期四\1點第一季傳統(tǒng)分離方法介紹主要內(nèi)容概述傳統(tǒng)分離方法近代色譜分離方法其他方法當(dāng)前第9頁\共有103頁\編于星期四\1點1.1概述當(dāng)前第10頁\共有103頁\編于星期四\1點1.1概述在實際分析工作中，遇到的樣品往往含有多種組分，進(jìn)行測定時彼此發(fā)生干擾，不僅影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度，甚至無法進(jìn)行測定。欲測組分的含量極微,測定方法的靈敏度不夠.怎么辦？？？當(dāng)前第11頁\共有103頁\編于星期四\1點充分利用有機(jī)分離分析技術(shù)有機(jī)分離分析技術(shù)是一門涉及了物理分離、化學(xué)分離、色譜分離等分離、純化、富集的技術(shù)，并通過利用傳統(tǒng)或現(xiàn)代化手段對所獲得的產(chǎn)品進(jìn)行分析、表征、解釋的一門綜合性很強的課程?，F(xiàn)代分離分析技術(shù)的特點：充分利用色譜等現(xiàn)代化分離手段，例如FPLC，HPLC，AGE，對未知物進(jìn)行分離、純化-富集、分析。1.1概述當(dāng)前第12頁\共有103頁\編于星期四\1點1.1概述-常用（傳統(tǒng)）分離方法沉淀分離法溶劑萃取分離法色譜分離法揮發(fā)和蒸餾分離法PrecipitationSolventextractionChromatographyVolatilizationanddistillation其他分離方法Theothers當(dāng)前第13頁\共有103頁\編于星期四\1點色譜法液相色譜法氣相色譜法平板色譜法柱色譜法薄層色譜法紙色譜法氣液色譜法氣固色譜法分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法排阻色譜法超臨界流體色譜法親和色譜法經(jīng)典高效當(dāng)前第14頁\共有103頁\編于星期四\1點1.2傳統(tǒng)分離方法介紹當(dāng)前第15頁\共有103頁\編于星期四\1點1.2傳統(tǒng)分離方法介紹沉淀分離和共沉淀分離依據(jù)溶度積規(guī)則(溶度積小的先沉淀，大的后沉淀)沉淀分離法:

在樣品溶液中加入有機(jī)(草酸、銅鐵試劑，etc.)或者無機(jī)(NaOH,SO42-,X-,etc.)沉淀劑,有選擇地沉淀某些離子，而與其它離子分離開來的方法。共沉淀分離:利用共沉淀現(xiàn)象，以加入有機(jī)(動物膠、丹寧甲基紫)或者無機(jī)(Fe(OH)3,Al(OH)3,硫酸鉛-硫酸鋇，磷酸銨鎂-砷酸銨鎂)沉淀試劑，將痕量組分定量地沉淀下來，溶解在少量溶劑中，達(dá)到分離與富集的目的，。當(dāng)前第16頁\共有103頁\編于星期四\1點狹義的講：在含有被分離物質(zhì)的水溶液中，加入萃取劑和與水不相混溶的有機(jī)溶劑，震蕩，利用物質(zhì)在兩相中的分配不同的性質(zhì)，使一些組分進(jìn)入有機(jī)相中，使另一些組分仍留在水相中，從而達(dá)到分離的目的。1.2.2萃取分離法例如：乙酰基-β-萘酚的合成，需用二氯甲烷萃取純化當(dāng)前第17頁\共有103頁\編于星期四\1點1.2.2萃取分離法ChloroformH2O上層？：下層？：當(dāng)前第18頁\共有103頁\編于星期四\1點萃取體系螯合物萃取體系離子締合物萃取體系溶劑化合物萃取體系共價化合物(簡單分子)萃取體系1.2.2萃取分離法（不做重點）原理介紹：參考相關(guān)文獻(xiàn)Chinese當(dāng)前第19頁\共有103頁\編于星期四\1點1.3近代色譜分離法當(dāng)前第20頁\共有103頁\編于星期四\1點1.3.1紙色譜(簡單介紹)紙色譜(Paperchromatography)以濾紙條為固定相，在紙條上點上待分離的混合溶液的樣點，將紙條下端浸入流動相溶劑中懸掛，溶劑因為毛細(xì)作用沿濾紙條上升，樣點中的溶質(zhì)從而被分離。氨基酸的紙色譜分離演示（準(zhǔn)備及操作過程）當(dāng)前第21頁\共有103頁\編于星期四\1點紙色譜paperchromatography以分配色譜為例進(jìn)行討論取一大小適宜的濾紙條在濾紙條的下端點上標(biāo)準(zhǔn)和樣品放在色譜筒中展開取出，標(biāo)記前沿，涼干著色，分析固定相濾紙上的H2O流動相展開劑當(dāng)前第22頁\共有103頁\編于星期四\1點1.3.3薄層色譜當(dāng)前第23頁\共有103頁\編于星期四\1點薄層色譜薄層色譜理論的提出：1938年由Izmailov,和Shraiber最早使用薄層色譜法，直到1958年stahl發(fā)明了薄層板的涂層裝置，可以制得均勻的薄層板，對吸附劑和色譜使用條件進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，這使得薄層色譜快速發(fā)展，并得到了大規(guī)模的應(yīng)用。當(dāng)前第24頁\共有103頁\編于星期四\1點（一）概述：薄層色譜：是一種微量、快速的分離分析方法。它是把吸附劑或載體均勻地涂在玻璃板上使成一層，將欲分離的樣品點加在薄層板上，然后用合適的溶劑展開，以達(dá)到分離和鑒定的目的。吸附劑或載體：與柱色譜用的相同，有硅膠、氧化鋁、纖維素等。200目以下160－200目薄層色譜當(dāng)前第25頁\共有103頁\編于星期四\1點適用范圍：適用于少量樣品（幾微克）的分離，也適用于量較大樣品的精制、純化。如將薄層面積加寬涂層厚度加厚，樣品點成一條線，可以分離幾百毫克的樣品。特點：設(shè)備簡單，制板、顯色及實際操作都不復(fù)雜；分離速度快，一般幾十分鐘就可達(dá)到分離的目的，比紙色譜和經(jīng)典柱色譜要快很多，后者長大數(shù)小時，甚至數(shù)天；分辨率高，比經(jīng)典柱色譜及紙色譜分離得更加清晰，拖尾小，分辨率更高，可達(dá)400～3000理論板數(shù)；靈敏度高。鑒定的低限約為紙色譜的1/10~1/100；采用惰性載體，使得在鑒定無色化合物時，可能采用像硫酸之類的強腐蝕性試劑和較高溫度；不僅便于微量分離和鑒定，而且也能同柱色譜一樣用于大量制備的目的。當(dāng)前第26頁\共有103頁\編于星期四\1點（二）基本原理：薄層色譜吸附色譜（硅膠、氧化鋁為吸附劑）分配色譜（纖維素作為固定相）離子交換色譜一般吸附色譜用得較多，在這里重點討論。吸附：一般指氣相或溶解于溶液中的溶質(zhì)在相邊界（即固體表面）上的濃縮。因此，溶質(zhì)分離的關(guān)鍵在于吸附劑的表面性質(zhì)。溶質(zhì)在固定相和移動相中的狀態(tài)以下圖表示：S－吸附劑M－移動相…－溶質(zhì)、溶劑分子一般講，影響溶液中溶質(zhì)的系數(shù)的因素比氣體狀態(tài)下復(fù)雜。因為溶劑分子在固體表面能與溶質(zhì)分產(chǎn)生競爭吸附作用。當(dāng)前第27頁\共有103頁\編于星期四\1點2.吸附平衡：在單位時間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動態(tài)平衡，稱為吸附平衡。對于氣-固相的吸附解析受溫度與濃度明顯，但是對于液-固相的吸附解析影響較小，在常壓、室溫下，則液體在固體表面的吸附等溫線接近直線關(guān)系，吸附系數(shù)K是常數(shù)。K=溶質(zhì)在吸附劑中的濃度溶質(zhì)在展開劑中的濃度當(dāng)前第28頁\共有103頁\編于星期四\1點3.擴(kuò)展：薄層色譜斑點面積隨著展開時間延長而逐漸變大，這稱為斑點的擴(kuò)展。擴(kuò)展原因擴(kuò)散擴(kuò)展慢平衡流動模型當(dāng)前第29頁\共有103頁\編于星期四\1點бdбeбfбб2＝бd2＋бe2＋бf2бd——擴(kuò)散擴(kuò)展引起斑點擴(kuò)展的流出曲線偏差бe——慢平衡引起斑點擴(kuò)展的流出曲線偏差бf——流動模型引起斑點擴(kuò)展的流出曲線偏差б——斑點總擴(kuò)展，在色譜上稱為流出曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其為相應(yīng)的峰高0.607倍時流出峰寬度的一半。當(dāng)前第30頁\共有103頁\編于星期四\1點擴(kuò)散擴(kuò)展：慢平衡：斑點擴(kuò)展бe2直接比例于移動相的速度，即展開劑的移動速度愈快，斑點擴(kuò)散愈嚴(yán)重(未充分平衡)，反之就愈輕。流動模型：引起的擴(kuò)展是因為溶質(zhì)從一端展開到另一端所走過的路徑不同，有的比平均值大，有的比平均值小，各分子到達(dá)終點的時間有差別，造成了斑點面積逐漸擴(kuò)展變大。бd2

＝2DtD——移動相分子和溶質(zhì)分子相互擴(kuò)散的擴(kuò)散系數(shù)t——擴(kuò)散時間因此，D增大擴(kuò)展增大；

t延長擴(kuò)散增大；

ν增大擴(kuò)展減小。t＝L/ν（t-時間；L-展開距離；v-展開劑速度）由于固體吸附劑擋住去路的程度不同所致當(dāng)前第31頁\共有103頁\編于星期四\1點（三）裝置和操作技術(shù)裝置:玻璃板涂布器干燥器微量滴管色層槽紫外燈噴霧器當(dāng)前第32頁\共有103頁\編于星期四\1點固定相、粘合劑和移動相

建立一個比較理想的薄層色譜條件必須考慮三方面問題：樣品的性質(zhì)固定相移動相決定因素，選擇固定相和移動相的依據(jù)。固定相：常用的有a.硅膠

b.氧化鋁

c.纖維素；其它固定相有：硅藻土、醋酸纖維素、聚酯胺。粘合劑：濕法涂層都要加粘合劑，最常用的是火段石膏、羧酸基纖維素鈉（CMC）、淀粉。移動相：在薄層色譜中稱為展開劑。薄層色譜分離的好壞取決于對展開劑的選擇。當(dāng)前第33頁\共有103頁\編于星期四\1點展開劑的選擇：

展開劑對樣品應(yīng)有足夠的溶解度，并且能夠使樣品在固定相移動中。樣品中化合物的移動速度及Rf值，與溶劑的極性有關(guān)，溶劑的極性可以用介電常數(shù)來衡量。

一般可按下面的辦法選擇合理的展開劑：見右圖。即在薄層板上點若干同樣的混合樣品，待溶劑蒸發(fā)干后，用充滿各種展開劑的毛細(xì)管接觸每個點中心，這時溶劑呈圓形向外擴(kuò)散。合適的展開劑會使混和燃料的成分各自分開。右圖中苯最好。當(dāng)前第34頁\共有103頁\編于星期四\1點操作技術(shù)操作步驟制備薄層板點樣展開斑點定位定性分析定量分析當(dāng)前第35頁\共有103頁\編于星期四\1點演示薄層板的制備可以參考《復(fù)雜物質(zhì)剖析課程講義》或者其他相關(guān)資料當(dāng)前第36頁\共有103頁\編于星期四\1點定性分析：比移值Rf：表示樣品化合物的薄層色譜的特性。外界影響因素：薄層厚度；吸附劑的吸附力及顆粒大??；酸堿性；含水量；展開劑的極性、純度、揮發(fā)性；溫度；斑點上溶質(zhì)的含量；氣態(tài)組成的變化等等。相對比移值Rst：同一化合物的比移值Rf并不是非常恒定的，有時在一個很小的范圍內(nèi)變化，因此有時也用相對比移值Rst表示。當(dāng)前第37頁\共有103頁\編于星期四\1點定量分析常用方法：直接定量法目測測量色譜斑點面積法反射光密度法間接定量法分光光度法重量分析法極譜法等其他方法：放射活性法氣相色譜法當(dāng)前第38頁\共有103頁\編于星期四\1點薄層掃描（定性，定量）薄層掃描法系指用～定波長的光照射在經(jīng)薄層層析后的層析板上，對具有吸收或能產(chǎn)生熒光的層析斑點進(jìn)行掃描，用反射法或透射法測定吸收的強度，以檢測層析譜。通過軟件分析，作圖。（本學(xué)期開實驗，可咨詢陳智老師）X(cm)Y(sample)Z(density)當(dāng)前第39頁\共有103頁\編于星期四\1點小結(jié)：薄層色譜中，樣品、吸附劑、展開劑三者之間一般關(guān)系圖：極性小的待分離染料不易被薄層所吸附時，應(yīng)選用活性大的吸附劑和極性小的展開。分離PEG400當(dāng)前第40頁\共有103頁\編于星期四\1點1.3.3離子交換色譜當(dāng)前第41頁\共有103頁\編于星期四\1點離子交換色譜法分離：離子交換色譜法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。

。

經(jīng)典離子交換色譜IECIonexchange：

Achromatographicprocedurethatallowstheseparationofionsandpolarmoleculesbasedontheirchargeonastationaryphase,onwhichconsistingofion-exchangeresinswhichmaybeacidicorbasi.H

HChineseHChinese

當(dāng)前第42頁\共有103頁\編于星期四\1點根據(jù)離子交換樹脂基體種類分主要原料：苯乙烯和丙烯酸(酯)兩大類其他：酚醛系、環(huán)氧系、乙烯吡啶系、脲醛系凝膠型樹脂的在吸水時潤脹，在大分子鏈節(jié)間形成很微細(xì)的孔隙，通常平均孔徑為2～。適于吸附無機(jī)離子，它們的直徑較小，一般為0.3～0.6nm。蛋白質(zhì)分子直徑為5～20nm，不能進(jìn)入這類樹脂的顯微孔隙中。

大孔型樹脂是在聚合反應(yīng)時加入致孔劑，形成多孔海綿狀構(gòu)造的骨架，內(nèi)部有大量永久性的微孔，再導(dǎo)入交換基團(tuán)制成。它并存有微細(xì)孔和大網(wǎng)孔，潤濕樹脂的孔徑達(dá)100～500nm。根據(jù)離子交換樹脂物理結(jié)構(gòu)分

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第43頁\共有103頁\編于星期四\1點特種樹脂螯合樹脂大孔樹脂萃淋樹脂纖維素交換劑負(fù)載螯合劑樹脂陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂強酸性陽離子交換樹脂弱酸性陽離子交換樹脂強堿性陰離子交換樹脂弱堿性陰離子交換樹脂R-SO3H樹脂R-COOH,R-OH樹脂R4N+Cl-

樹脂-NH2,-NHR,-NR2樹脂

按基質(zhì)鏈接的活性基團(tuán)不同，離子交換樹脂可分類

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第44頁\共有103頁\編于星期四\1點對離子交換樹脂的要求：不溶于水，對酸堿氧化劑還原劑及加熱具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性具有較大的交換容量（有相關(guān)討論）對不同離子具有良好的交換選擇性（有相關(guān)討論）交換速率大（有相關(guān)討論）樹脂容易再生

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第45頁\共有103頁\編于星期四\1點離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)高分子聚合物，具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性好。在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架上連接有活性基團(tuán)，如-SO3H,-COOH,-N(CH3)3Cl等，它們可以與溶液中的離子進(jìn)行交換。

經(jīng)典離子交換色譜IECO,m,p當(dāng)前第46頁\共有103頁\編于星期四\1點交聯(lián)后、活化后，在樹脂表面發(fā)生的交換反應(yīng)形式R-SO3H+M+R-SO3M+H+RN+(CH3)3OH-

+X-RN+(CH3)3X-

+OH-R-NH2+H2OR-N+H3OH-

水合作用RN+H3OH-

+X-

RN+H3X-

+OH-R-L+M(R-L)nM陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂螯合交換樹脂

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第47頁\共有103頁\編于星期四\1點離子交換樹脂的性能參數(shù),交聯(lián)度:表征骨架性能的參數(shù)樹脂合成中，二乙烯苯為交聯(lián)劑，樹脂中含有二乙烯苯的百分率就是該樹脂的交聯(lián)度。交聯(lián)度大，樹脂孔隙，交換反應(yīng)速度，選擇性。小慢高交聯(lián)度小，樹脂孔隙，交換反應(yīng)速度，選擇性。大快低氨基酸的分離，交聯(lián)度8%，多肽的分離2~4%一般交聯(lián)度:4-14％適宜。交聯(lián)度小，適合分離無機(jī)物質(zhì)，交聯(lián)度大，適合做脫色

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第48頁\共有103頁\編于星期四\1點離子交換樹脂的性能參數(shù),

交換容量:表征活性基團(tuán)的性能參數(shù)決定于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中活性基團(tuán)的數(shù)目。交換容量由實驗測得定義：每克干樹脂所能交換的物質(zhì)的量(mmol)。一般樹脂的交換容量3~6mmol/g。稱取某R4N+OH-型陰離子交換樹脂2.00g，置于錐型瓶中，加入0.200mol/L標(biāo)準(zhǔn)HCl100mL浸泡一晝夜。用移液管吸取25.00mL,以甲基紅為指示劑，用0.100mol/LNaOH溶液滴定，消耗20.00mL。計算離子交換樹脂的交換容量。

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第49頁\共有103頁\編于星期四\1點性能參數(shù)，總交換量

（exchangecapacity）:

指離子交換劑所能提供交換離子的總量，又稱為總交換容量，它只和離子交換樹脂本身的性質(zhì)有關(guān)性能參數(shù)，有效交換容量：層析柱與樣品中各個待分離組分進(jìn)行交換時的交換容量，它與所用的樹脂及實驗條件有很大的關(guān)系。離子交換樹脂顆粒大小、顆粒內(nèi)孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。離子強度、pH值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)

（例如，小分子，可使用小孔徑的樹脂，提高比表面積，提高交換容量；對于大分子樣品，無法進(jìn)入孔徑，只能選小顆粒，在表面發(fā)生交換，顆粒越小的比表面越大，交換容量增加）

例如弱酸在pH<6時不容易發(fā)生解離，交換容量變??；弱堿，同理）

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第50頁\共有103頁\編于星期四\1點性能參數(shù)，離子交換親合力Affinity-

親和力的差異是離子交換分離的基礎(chǔ)離子交換樹脂與被分離溶液接觸時發(fā)生離子交換反應(yīng)時親和力的差異主要下列因素有關(guān)有關(guān)：水合離子的半徑離子的電荷半徑小電荷數(shù)親和力親和力理論依據(jù)及詳細(xì)討論參考：Http://

Http://

離子的極化程度極化度親和力

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第51頁\共有103頁\編于星期四\1點強酸性陽離子交換樹脂對下列陽離子親和力的順序Li+

＜H+

＜Na+

＜NH4+

＜K+

＜Rb+

＜Cs+

＜Ag+

＜Tl+（鉈）Mg2+＜Zn2+＜Co2+＜Cu2+＜Cd2+＜Ni2+＜Ca2+＜Sr2+＜Pb2+＜Ba2+＜Al3+

＜Fe3+Na+＜Ca2+＜Al3+＜Th4+（釷）對于弱酸性陽離子交換樹脂，H＋的親合力大于陽離子a陽離子交換樹脂b.陰離子交換樹脂強堿型陰離子交換樹脂F(xiàn)-＜OH-＜CH3COO-＜HCOO-＜Cl-＜NO2-＜CN-＜Br-＜C2O42-

＜NO3-

＜HSO4-

＜I-

＜CrO42-

＜SO42-

＜Cit(檸檬酸).弱堿型陰離子交換樹脂F(xiàn)-＜Cl-＜Br＜I-＜CH3COO-＜MoO42-＜PO43-＜AsO43-＜NO3-＜CrO42-

＜SO42-

＜OH-

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第52頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第53頁\共有103頁\編于星期四\1點MechanismofIEC(onAnionExchangeBeads)

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第54頁\共有103頁\編于星期四\1點操作（將在后面的經(jīng)典柱色譜中詳細(xì)介紹）離子交換分離操作與應(yīng)用應(yīng)用裝柱離子交換洗脫樹脂再生制備去離子水微量組分富集分離（Au,Pt,Re-錸）陰陽離子分離

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第55頁\共有103頁\編于星期四\1點水的凈化:純凈水的預(yù)處理，EDI等H+OH-陽離子交換陰離子交換R-SO3H+M+R-SO3M+H+RN+H3OH-+X-RN+H3X-+OH-H++OH-H2O除去水中的雜質(zhì)離子去離子水

de-ionizedwater

經(jīng)典離子交換色譜IEC當(dāng)前第56頁\共有103頁\編于星期四\1點1.3.4其他經(jīng)典柱色譜當(dāng)前第57頁\共有103頁\編于星期四\1點吸附柱色譜作用：分離各種類型的非離子組分區(qū)別：與離子交換色譜法相比，柱色譜分析是在中性條件下操作，樣品不會受到破壞；同時，它能有效地分離多種組分。分類：硅膠、氧化鋁為吸附劑的吸附色譜纖維素為載體的分配色譜吸附劑：市場供應(yīng)的硅膠、氧化鋁粒度為100－200目，使用前需進(jìn)行活化。一般吸附劑用量是被分離試樣的30－50倍，根據(jù)被分離試樣中組分分離的難易程度而定。當(dāng)前第58頁\共有103頁\編于星期四\1點柱色譜操作步驟：裝柱：柱的大小和粗細(xì)，根據(jù)被分離試樣的量而定。一般柱的高度為直徑的20－30倍?？啥ㄗ?，亦可用分析用滴定管代替。裝柱方法有濕法和干法兩種。濕法：洗凈玻璃管，底部塞子用石墨涂好，在底部鋪一層玻璃纖維位或脫脂棉，再將硅膠裝入管內(nèi)。在柱內(nèi)加入少量試劑，派出滴定管下部及棉花內(nèi)的氣泡。將用溶劑硅膠調(diào)成漿裝，緩慢、連續(xù)不斷地倒入柱中，此時應(yīng)打開柱下端活塞，使溶劑流出，吸附劑即漸漸沉于柱底。待沉降穩(wěn)定后，放出多余的溶劑，液面保持溶劑約0.5－1cm。當(dāng)前第59頁\共有103頁\編于星期四\1點加樣與洗脫加樣：溶解被分離試樣的溶劑體積要小，極性宜低，樣品輕輕加于柱頂部。洗脫劑的選擇：可根據(jù)被分離物質(zhì)各組分的極性、溶解度和吸附劑的極性大小等考慮。常用一系列極性漸次增大的溶劑，如：石油醚、苯、乙醚、氯仿及甲醇等順序洗脫。為了逐步提高洗脫劑的洗脫能力，亦可用溶劑作為過渡，順次用石油醚－苯、苯、苯－乙醚、乙醚、乙醚－氯仿、氯仿、氯仿－甲醇等洗脫。5.柱色譜操作步驟：1-5ml當(dāng)前第60頁\共有103頁\編于星期四\1點收集洗脫液用等分連續(xù)法收集流出的洗脫液，收集每份洗脫液的體積隨所用吸附劑的量，以及樣品的分離情況而定（Introducedpreviously）；可以手工收集也可以自動收集，自動收集可以節(jié)省時間和人力?？梢院銣兀ㄓ绕涫堑蜏兀槐。?.柱色譜操作步驟：當(dāng)前第61頁\共有103頁\編于星期四\1點吸附柱色譜操作實例當(dāng)前第62頁\共有103頁\編于星期四\1點色譜法液相色譜法氣相色譜法平板色譜法柱色譜法薄層色譜法紙色譜法氣液色譜法氣固色譜法分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法排阻色譜法超臨界流體色譜法親和色譜法當(dāng)前第63頁\共有103頁\編于星期四\1點除前面介紹的其他方法離心電泳透析（膜分離的一種）磁力膜分離（魏老師）簡要介紹，開拓眼界，為后面研究打基礎(chǔ)。當(dāng)前第64頁\共有103頁\編于星期四\1點離心技術(shù)

（centrifugaltechnique）

當(dāng)前第65頁\共有103頁\編于星期四\1點

離心技術(shù)（centrifugaltechnique）

是根據(jù)顆粒在勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為發(fā)展起來的一種分離分析技術(shù)。

當(dāng)前第66頁\共有103頁\編于星期四\1點離心技術(shù)的應(yīng)用

1.工業(yè)生產(chǎn)

化工、制藥、食品等

轉(zhuǎn)速<5000r/min

2.生物、醫(yī)學(xué)、化學(xué)

轉(zhuǎn)速從每分鐘幾千到幾萬轉(zhuǎn)以上

目的在于分離和純化樣品，以及對純

化的樣品有關(guān)性能進(jìn)行研究。當(dāng)前第67頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第68頁\共有103頁\編于星期四\1點二.離心設(shè)備

離心機(jī)

轉(zhuǎn)子

離心管

附件

當(dāng)前第69頁\共有103頁\編于星期四\1點（一）.離心機(jī)(Centrifugel)

1.低速離心機(jī)

轉(zhuǎn)子

電動機(jī)

轉(zhuǎn)子帶有放置離心管的孔

轉(zhuǎn)子的中央位于離心機(jī)的驅(qū)動軸上

離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和溫度控制不夠準(zhǔn)確

一般最高轉(zhuǎn)速在6,000rpm以下

實驗室中常用于分離制備。

當(dāng)前第70頁\共有103頁\編于星期四\1點2.高速離心機(jī)

制冷設(shè)備溫度控制在0-4℃范圍內(nèi)

制動器

實際速度和溫度可通過儀表顯示

配有一定類型及規(guī)格的轉(zhuǎn)子

最高轉(zhuǎn)速在25,000rpm以下

常用于生物大分子的分離制備當(dāng)前第71頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第72頁\共有103頁\編于星期四\1點

當(dāng)前第73頁\共有103頁\編于星期四\1點

當(dāng)前第74頁\共有103頁\編于星期四\1點3.超速離心機(jī)

驅(qū)動和速度控制

溫度控制

真空系統(tǒng)

轉(zhuǎn)子

常用于分離亞細(xì)胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白質(zhì)分子。

在分離時無須加入可能引起被分離物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的物質(zhì)。

當(dāng)前第75頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第76頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第77頁\共有103頁\編于星期四\1點（二）.轉(zhuǎn)子(Rotor)

固定角式轉(zhuǎn)子(fixed-anglerotor)

水平轉(zhuǎn)子(swing-outrotor)

垂直轉(zhuǎn)子(verticalrotor)

帶狀轉(zhuǎn)子(zonalrotor)

連續(xù)轉(zhuǎn)子(continuousrotor)

當(dāng)前第78頁\共有103頁\編于星期四\1點轉(zhuǎn)子的材質(zhì)：

鋁質(zhì)較輕,耐受強度較弱,適合在較低

的轉(zhuǎn)速下使用;

不銹鋼耐受強度最好,但材質(zhì)本身太重；

鈦合金耐受強度不錯,重量也比不銹鋼輕。

當(dāng)前第79頁\共有103頁\編于星期四\1點

1.固定角式轉(zhuǎn)子

離心管在離心機(jī)中放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形成一個固定的角度,角度變化在14-40°之間。

常見的角度

20°

28°

34°

40當(dāng)前第80頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第81頁\共有103頁\編于星期四\1點固定角式轉(zhuǎn)子當(dāng)前第82頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第83頁\共有103頁\編于星期四\1點三.離心分離方法

根據(jù)離心原理,按照實際工作的需要，目前已有可設(shè)計出各種離心方法綜合起來大致可分三類當(dāng)前第84頁\共有103頁\編于星期四\1點離心分離法

差速離心法沉降速度法速率區(qū)帶離心法等密度離心法沉降平衡法

經(jīng)典式沉降法當(dāng)前第85頁\共有103頁\編于星期四\1點

例用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份

已破碎的細(xì)胞

500g,10分鐘

沉淀上清液

(細(xì)胞核）10,000g,10分鐘

沉淀上清液

(細(xì)胞膜碎片,線粒體,)100,000g,3小時

溶酶體

沉淀上清液

(核糖核蛋白體）(可溶性成份)

當(dāng)前第86頁\共有103頁\編于星期四\1點電泳分離技術(shù)當(dāng)前第87頁\共有103頁\編于星期四\1點原理電泳技術(shù)就是利用在電場作用下，由于待分離樣品中各種分子帶點性質(zhì)以及分子本身大小、性狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純。遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的黏度成反比當(dāng)前第88頁\共有103頁\編于星期四\1點影響電泳的主要因素1、大分子的性質(zhì)2、電場強度3、溶液的pH4、溶液的離子強度5、電滲6、溫度7、支持物的影響當(dāng)前第89頁\共有103頁\編于星期四\1點（三）聚丙烯酰胺膠體的制備

制膠模1梳形樣品槽模板2長玻璃板（后面）3短玻璃板（前面）4U形橡膠框當(dāng)前第90頁\共有103頁\編于星期四\1點（二）SDS-聚丙烯酰胺凝膠膠體的制備當(dāng)前第91頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第92頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第93頁\共有103頁\編于星期四\1點選擇聚丙烯酰胺凝膠濃度參考值樣品分子量范圍適宜的凝膠濃度(T%)蛋白質(zhì)（酶）<104(1～4)×1044×104～1×1051×105～5×105>5×10520～3015～2010～155～102～5核酸（RNA）<104104～1051×105～2×10615～205～102～3.6當(dāng)前第94頁\共有103頁\編于星期四\1點當(dāng)前第95頁\共有103頁\編于星期四\1點本章要點1、對分離效果的評價：分離效果，回收率2、萃取分離種類：螯合，離子締合，簡單分子，溶劑配合，及萃取條件與過程基本理論：萃取的本質(zhì)，KD,D,E，及相互關(guān)系3、離子交換基本理論：樹脂的結(jié)構(gòu)性能及性能參數(shù)，交聯(lián)度，交換容量，始漏量，交換總?cè)萘?；親和力，選擇系數(shù)，等離子交換劑：種類，交換反應(yīng)應(yīng)用：4、色譜分離

分離原理：吸附、分配、排阻、離子交換、親和分離技術(shù)：流動相、固定相、定性與定量的方法等當(dāng)前第96頁\共有103頁\編于星期四\1點LC以及TLC的應(yīng)用舉例當(dāng)前第97頁\共有103頁\編于星期四\1點柱色譜法分離實例(0)準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備燒杯（試管），稱重，貼標(biāo)簽并編號準(zhǔn)備硅膠，烘干（同時準(zhǔn)備試樣）12