微生物學(xué)重組與質(zhì)粒

微生物學(xué)重組與質(zhì)粒第一頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六第九講

原微核生物重組和質(zhì)粒AdvancedMicrobiology主講人：吳瑩瑩wuyingying@.c二頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六綱要細(xì)菌的重組：一般原理細(xì)菌的質(zhì)粒（應(yīng)用：質(zhì)粒載體）DNA轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌的結(jié)合轉(zhuǎn)座因子第三頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六原核微生物的遺傳物質(zhì)染色體DNA

環(huán)狀或線狀雙鏈DNA,，不與組蛋白結(jié)合；

單倍體；

決定主要性狀。2.染色體外DNA

較小的共價(jià)閉合環(huán)狀或線狀雙鏈DNA，如質(zhì)粒；

一般多拷貝；

決定次要性狀。3.基因一般連續(xù)排列，轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)第四頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六1.細(xì)菌的重組：一般原理基因重組（generecombination）：將兩個(gè)不同性狀個(gè)體的基因通過(guò)一定的方式轉(zhuǎn)移到一起，并發(fā)生重新組合，產(chǎn)生新的遺傳性狀的過(guò)程，稱為基因重組(generecombination)或遺傳重組。

不同的親本DNA---交換---重組重組：遺傳物質(zhì)在分子水平上發(fā)生的交換；雜交：在細(xì)胞水平上遺傳物質(zhì)的交換.

雜交必然包含著重組，但重組不僅限于雜交這一形式。第五頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六3.DNA轉(zhuǎn)化定義：受體細(xì)胞直接吸收供體細(xì)胞的DNA片段,并與其染色體同源片段進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換，從而使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子（transformant）：經(jīng)轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)了供體性狀的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子，即轉(zhuǎn)化成功的菌落。

目前已知有二十多個(gè)種的G+和G-細(xì)菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力，此過(guò)程可以發(fā)生在土壤和海洋環(huán)境中，可能是自然界遺傳交換的重要方式。第六頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六轉(zhuǎn)化的過(guò)程感受態(tài)階段

受體菌成為感受態(tài)

產(chǎn)生DNA受體位點(diǎn)（DNA結(jié)合蛋白）或局部原生質(zhì)體化

條件：

特殊遺傳類型

誘導(dǎo)因子：多肽類物質(zhì)、SSCS、CaCl2、低溫等第七頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六什么是感受態(tài)感受態(tài)：是指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。一個(gè)細(xì)菌能否出現(xiàn)感受態(tài)是由其遺傳性決定的，但受環(huán)境條件的影響也很大，因而表現(xiàn)差別很大。

感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）：具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞。自然感受態(tài)細(xì)胞人工感受態(tài)細(xì)胞第八頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六自然感受態(tài)與人工感受態(tài)人工感受態(tài)則是通過(guò)人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。該過(guò)程與細(xì)菌自身的遺傳控制無(wú)關(guān)自然感受態(tài)的出現(xiàn)是細(xì)胞一定生長(zhǎng)階段的生理特性（如肺炎鏈球菌的感受態(tài)出現(xiàn)在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）受細(xì)菌自身的基因控制第九頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六轉(zhuǎn)化因子

本質(zhì)是離體的DNA片斷或質(zhì)粒DNA。在不同的微生物中，轉(zhuǎn)化因子的形式不同，dsDNA或ssDNA。其中最易與細(xì)胞表面結(jié)合的仍是dsDNA。

由于每個(gè)細(xì)胞表面能與轉(zhuǎn)化因子相結(jié)合的位點(diǎn)有限（如肺炎鏈球菌約10個(gè)），因此，從外界加入無(wú)關(guān)的dsDNA就可競(jìng)爭(zhēng)并干擾轉(zhuǎn)化作用。

質(zhì)粒DNA也是良好的轉(zhuǎn)化因子，但它們通常并不能與核染色體組發(fā)生重組。

轉(zhuǎn)化的頻率通常為0.1％～1％，最高為20％。第十頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六II.DNA的結(jié)合與吸收III.轉(zhuǎn)化DNA的整合（RecA蛋白介導(dǎo)）第十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六4.轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)：利用完全或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。

由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得供體細(xì)胞部分遺傳性狀的重組受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子（transductant）。

攜帶供體部分遺傳物質(zhì)（DNA片段）的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體。細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的二種類型：普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)第十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）由烈性或溫和噬菌體在裂解寄主菌的過(guò)程中進(jìn)行的任何宿主基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。條件：

存在錯(cuò)誤包裝的可能

供體寄主菌的DNA在完全降解前即被包裝結(jié)果：

攜帶供體菌DNA的噬菌體再侵染受體菌，與受體菌的DNA同源重組，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。第十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六轉(zhuǎn)導(dǎo)模型第十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的三種后果：進(jìn)入受體的外源DNA通過(guò)與細(xì)胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)（abortivetransduction）轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA不能進(jìn)行重組和復(fù)制，但其攜帶的基因可經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄而得到表達(dá)。特點(diǎn)：在選擇培養(yǎng)基平板上形成微小菌落外源DNA被降解，轉(zhuǎn)導(dǎo)失敗。如果受體菌通過(guò)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得了供體菌DNA片段后，在其體內(nèi)不發(fā)生基因的交換、整合和復(fù)制，只進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯和性狀的表達(dá)。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)被稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo).第十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）由溫和噬菌體通過(guò)溶原階段連接供體菌基因后再誘導(dǎo)溶菌，并把供體菌特異基因帶給受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。在裂解寄主菌的過(guò)程中進(jìn)行的任何宿主基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。條件：

原噬菌體發(fā)生不正常切割結(jié)果：

形成缺陷噬菌體（如λdgal），再侵染，整合，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子。第十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六大腸桿菌中λ噬菌體的正常裂解及半乳糖基因轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成過(guò)程第十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六兩種轉(zhuǎn)導(dǎo)的特性比較普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)生自然發(fā)生人工誘導(dǎo)（uv）噬菌體形成誤包前噬菌體的“誤切”內(nèi)含DNA只含宿主DNA含噬菌體和宿主DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)性狀供體的任何性狀前噬菌體兩端鄰近基因轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程雙交換（轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA替換受體DNA同源區(qū)）轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA插入，使受體菌為部分二倍體第十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六5.細(xì)菌的結(jié)合通過(guò)供體菌和受體菌完整細(xì)胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過(guò)程。由于在細(xì)菌和放線菌等原核生物中出現(xiàn)基因重組的機(jī)會(huì)極為少見(jiàn)，而且較缺少形態(tài)指標(biāo)，所以關(guān)于細(xì)菌結(jié)合的工作直至Lederberg等1946年采用兩株大腸桿菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，才奠定方法學(xué)上的基礎(chǔ)。第十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六中間平板上長(zhǎng)出的原養(yǎng)型菌落是兩菌株之間發(fā)生了遺傳交換和重組所致！

1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm的多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型雜交實(shí)驗(yàn)。為了減少所培養(yǎng)的結(jié)果是回復(fù)突變的機(jī)會(huì)，采用了雙重或三重營(yíng)養(yǎng)缺陷型。該實(shí)驗(yàn)是建立在不大可能同時(shí)發(fā)生兩種或三種回復(fù)突變的設(shè)想上的。結(jié)合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)第二十頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六結(jié)合現(xiàn)象的證實(shí)證實(shí)接合過(guò)程需要細(xì)胞間的直接接觸的“U”型管實(shí)驗(yàn)（BernardDavis，1950）結(jié)合：兩個(gè)不同的微生物細(xì)胞之間接觸，遺傳物質(zhì)進(jìn)行單向轉(zhuǎn)移、交換，形成一個(gè)新個(gè)體。第二十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六能進(jìn)行結(jié)合的微生物種類主要在細(xì)菌和放線菌中存在。在細(xì)菌中，G－細(xì)菌尤為普遍，如E.coli、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弧菌屬、和假單胞菌屬等；放線菌中，以鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬最為常見(jiàn)，其中研究得最為詳細(xì)的是天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomycescoeilcolor）。在不同屬的一些菌種之間也可發(fā)生接合現(xiàn)象，如大腸桿菌與鼠傷寒沙門氏菌間或沙門氏菌與痢疾志賀氏菌間。在所有對(duì)象中，接合現(xiàn)象研究得最多、了解得最清楚的是E.coli

。E.coli

是有性別分化的，決定性別的是其中的F質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒還是合成性菌毛基因的載體。第二十二頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六結(jié)合的過(guò)程（滾環(huán)模型）第二十三頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六F因子的存在方式和相互關(guān)系F-F+第二十四頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六F因子的整合方式第二十五頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六高頻重組的特點(diǎn)接合中DNA轉(zhuǎn)移過(guò)程有著穩(wěn)定的速度和嚴(yán)格的順序性。染色體上越靠近F因子的先導(dǎo)區(qū)的基因，進(jìn)入的機(jī)會(huì)就越多，在F-中出現(xiàn)重組子的的時(shí)間就越早，頻率也高。第二十六頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六中斷雜交技術(shù)和基因定位利用Hfr×F-的接合過(guò)程，在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細(xì)菌，然后分析受體細(xì)菌基因型，以時(shí)間(分鐘)為單位繪制遺傳圖譜，該圖譜是細(xì)菌染色體上基因順序的直接反映。第二十七頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六6.轉(zhuǎn)座因子

轉(zhuǎn)座遺傳因子：

位于染色體或質(zhì)粒上的特殊的可移動(dòng)的DNA序列。

轉(zhuǎn)座可引起基因的突變、重組等。

依據(jù)分子結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)不同，分為：

插入序列(insertionsequence,IS)

轉(zhuǎn)座子(transposon,Tn)

轉(zhuǎn)座噬菌體(mutatorphage)第二十八頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六插入序列(IS)一類除了和它的轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因外不帶有任何其它基因的轉(zhuǎn)座因子。它們是較小的轉(zhuǎn)座因子，可以在染色體、質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)。F因子和大腸桿菌的染色體上有一些相同的插入序列如IS1、IS2等，通過(guò)這些序列間的重組，F(xiàn)因子可插入大腸桿菌的染色體，而使它們成為Hfr菌株。第二十九頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六轉(zhuǎn)座子(Tn)

Tn中除了含有轉(zhuǎn)座所必須的基因外，還含有與轉(zhuǎn)座無(wú)關(guān)的一些基因，如抗藥基因以及其它基因如乳糖發(fā)酵基因、熱穩(wěn)定腸毒素基因等。因此，Tn的轉(zhuǎn)座能使宿主菌獲得有關(guān)基因的特性，可作為遺傳標(biāo)志而易被鑒定出來(lái)。不同的符合轉(zhuǎn)座子的抗性標(biāo)記不同。Tn5轉(zhuǎn)座子部分示意圖第三十頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六Mu噬菌體

Mu噬菌體是大腸桿菌一種溫和噬菌體。通常每種溫和噬菌體應(yīng)整合到宿主染色體的一定位置上，可是Mu幾乎可插入宿主染色體的任何一個(gè)位置上，而且游離Mu和已插入的Mu基因次序是相同的。另外，它的兩端都沒(méi)有粘性末端，插入某種基因中就引起改基因的突變。這些都說(shuō)明它的整合方式不同于λ噬菌體，而類似于轉(zhuǎn)座因子的作用。第三十一頁(yè)，共三十四頁(yè)，編輯于2023年，星期六轉(zhuǎn)座的遺傳學(xué)效應(yīng)1.插入突變失活；2.插入位