細菌的遺傳分析打印演示文稿

細菌的遺傳分析打印演示文稿當前第1頁\共有66頁\編于星期四\7點（優(yōu)選）細菌的遺傳分析打印當前第2頁\共有66頁\編于星期四\7點(一)細胞計數(shù)(培養(yǎng)物細胞濃度)培養(yǎng)物中微生物計數(shù)方法是微生物學的基本實驗技術，其基本思路是：對原培養(yǎng)物進行連續(xù)稀釋；進行平板涂布（或混合倒平板）培養(yǎng)；由于每個細胞形成一個菌落，計數(shù)菌落數(shù)；根據(jù)稀釋倍數(shù)計算原培養(yǎng)物中的細胞濃度。當前第3頁\共有66頁\編于星期四\7點(二)建立純系的方法——純培養(yǎng)當前第4頁\共有66頁\編于星期四\7點(三)選擇培養(yǎng)法鑒定突變型與重組型許多細菌的突變都與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分及培養(yǎng)條件有關。營養(yǎng)缺陷型的篩選、鑒定：選擇培養(yǎng)法是根據(jù)菌株在基本培養(yǎng)基和營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)將菌株分為原養(yǎng)型(也稱為原生營養(yǎng)型)與營養(yǎng)缺陷型(在基本培養(yǎng)基上不能正常生長，只能在相應的營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長)。其它突變類型的篩選、鑒定：對于其它的突變類型(如溫度敏感型)，也可以通過培養(yǎng)條件的選擇培養(yǎng)來篩選與鑒定。當前第5頁\共有66頁\編于星期四\7點(四)突變型與重組型的批量篩選方法選擇培養(yǎng)法一次可鑒定、篩選一種突變型，但要檢測分離含有多種突變型的混和菌株，僅采用選擇培養(yǎng)法要進行多次試驗才能夠達到目的、效率太低。為高效檢測、分離混和群體中不同突變型，黎德伯格夫婦設計了影印培養(yǎng)法。該方法原理與選擇培養(yǎng)法一致，但是采用影印法將在完全培養(yǎng)基上單菌落同時接種到不同選擇培養(yǎng)基上同時對所有菌落進行選擇培養(yǎng)，鑒定效率大大提高。當前第6頁\共有66頁\編于星期四\7點細菌的基因組nucleoid(+plasmid)1結構:P107環(huán)狀雙鏈DNA，單倍性，以折疊或螺旋狀態(tài)存在；2大小：長約250~35000m(未螺旋)；3復制方式：著膜式復制。分裂特點：均等分裂，無基因重組。當前第7頁\共有66頁\編于星期四\7點Plasmidp108-109當前第8頁\共有66頁\編于星期四\7點圖7-3大腸桿菌染色體的基本結構圖解當前第9頁\共有66頁\編于星期四\7點細菌的突變型(一)合成代謝功能的突變型anabolicfunctionalmutants:營養(yǎng)缺陷型，auxotroph,X-(二)分解代謝功能的突變型：catabolicfunctionalmutants:

lac-等(三)抗性突變型resistant

mutants1抗藥性突變型:

青霉素:penr,

pens

鏈霉素:strr,strs

penicillinStreptomycin抗性:resistance敏感:sensitive，susceptive

2抗噬菌體突變型

T1噬菌體Tonr

Tons

T2噬菌體Ttor

TtosT6噬菌體Tsxr

Tsxs當前第10頁\共有66頁\編于星期四\7點突變型的篩選例如：營養(yǎng)缺陷型的篩選:u.v

野生型細菌完全培養(yǎng)基：影印培養(yǎng)基本培養(yǎng)基：補充培養(yǎng)基：氨基酸類維生素類系列氨基酸補充培養(yǎng)基：賴氨酸脯氨酸精氨酸….CMMMSM影印實驗（replicaplating）JoshuaLederberg

&

EstherLederberg（1952）當前第11頁\共有66頁\編于星期四\7點在細菌中遺傳物質(zhì)有三種轉移的形式。轉化（transformation）接合（conjugation）轉導（transduction）其共同特點是：（1）單方向轉移；（2）都產(chǎn)生部分二倍體；（3）外源基因只有整合到環(huán)狀染色體上才能穩(wěn)定地遺傳。

當前第12頁\共有66頁\編于星期四\7點當前第13頁\共有66頁\編于星期四\7點(一)細菌轉化實驗

(二)轉化過程(三)共轉化與遺傳圖譜繪制轉化一、細菌的轉化與作圖轉化(transformation)：指外源DNA片段不經(jīng)中間媒介體直接進入感受態(tài)細胞進行基因重組形成重組體的過程。轉化子：通過轉化而形成的重組體。P99證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實驗一：轉化實驗當前第14頁\共有66頁\編于星期四\7點感受態(tài)與感受態(tài)因子：感受態(tài)指細菌能夠從周圍環(huán)境中吸收DNA分子進行轉化的生理狀態(tài)。感受態(tài)主要受一類蛋白質(zhì)(感受態(tài)因子)影響，感受態(tài)因子可以在細菌間進行轉移，從感受態(tài)細菌中傳遞到非感受態(tài)細菌中，可以使后者變?yōu)楦惺軕B(tài)。一般認為感受態(tài)出現(xiàn)在細菌對數(shù)生長后期，并且某些處理過程可以誘導或加強感受態(tài)，以大腸桿菌為例，用Ca2+(如CaCl2)處理對數(shù)生長后期的大腸桿菌可以增強其感受能力。當前第15頁\共有66頁\編于星期四\7點按照細菌出現(xiàn)感受態(tài)的方式，可把轉化分為三種類型自然轉化(naturallyoccuringtransformation)：細菌自發(fā)地出現(xiàn)感受態(tài)，如肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，枯草桿菌等。人工誘導的感受態(tài)(artificiallyinducedcompetence)：如Ca2+誘導的大腸桿菌等發(fā)生的轉化。原生質(zhì)體轉化(protoplasttransformation)：將DNA分子連同PEG一同加入原生質(zhì)體，造成細胞攝取DNA。還可以用電穿孔法(electroporation)代替PEG，用高壓脈沖電流在細胞膜上擊成小孔，使DNA分子通過小孔而導入細胞，又稱為電轉化。可適用于多種細菌，放線菌和真核細胞的轉化。2和3：工程轉化（engineeredtransformation）

當前第16頁\共有66頁\編于星期四\7點轉化過程當前第17頁\共有66頁\編于星期四\7點當前第18頁\共有66頁\編于星期四\7點圖7-13細菌轉化的機制當前第19頁\共有66頁\編于星期四\7點通過轉化可以測定基因的連鎖、基因的排列順序以及圖距。原理如下：如果在供體的染色體上有兩個離得很遠的基因a＋和b＋，我們將會發(fā)現(xiàn)它們總是在不同的DNA片段上，這樣如果有一個a＋b＋供體和ab受體，那共轉化（cotransformation）即兩個基因同時轉化的概率是由兩個基因單獨轉化的概率的乘積。若每個基因的轉化頻率是10－3的話，那么這兩個基因同時被轉化的頻率應為10－3×10－3＝10－6。如果兩個基因離得很近，有可能位于同一個DNA片段上，那么它們共轉化的頻率將接近于單個基因轉化的頻率。若共轉化的頻率要比兩個單個基因轉化頻率相乘積高的話，那么這兩個基因一定是緊密連鎖的。

(三)共同轉化與遺傳圖譜繪制當前第20頁\共有66頁\編于星期四\7點基因的順序也可以通過共轉化的結果來分析確定，例如p＋和q＋常常共轉化，而q＋和o＋也常常共轉化，但基因p＋和o＋從未發(fā)生共轉化，那么這三個基因的順序一定是p–q-o。由于轉化片段的大小是可以控制的，因此兩個基因共轉化的頻率可以和轉化片段的平均大小相等。通過轉化片段平均大小相關的共轉化頻率測定，就可以獲得這些基因的連鎖圖譜。當前第21頁\共有66頁\編于星期四\7點利用共同轉化繪制細菌連鎖遺傳圖譜的基本原理：相鄰基因發(fā)生共同轉化的概率與兩者的距離間成正向關系，基因間距離越近，發(fā)生共同轉化的頻率越高，反之越低。因此可能通過測定兩基因共同轉化的頻率來指示基因間的相對距離。2轉化基因間重組值的計算

a、b單個整合個體數(shù)

a、b單個整合+同時整合總體數(shù)重組值=

=

(+-)+(-+)(++)+(+-)+(-+)

P93q21當前第22頁\共有66頁\編于星期四\7點出現(xiàn)野生型菌落的可能原因：回復突變；轉化；互養(yǎng)；細菌間發(fā)生了基因重組細菌的接合與染色體作圖當前第23頁\共有66頁\編于星期四\7點幾種可能解釋及其分析對上述試驗結果原養(yǎng)型菌落可能產(chǎn)生于：親本細菌A或B發(fā)生了回復突變；兩品系細胞通過培養(yǎng)基交換養(yǎng)料——互養(yǎng)作用；兩品系間發(fā)生了轉化作用；發(fā)生細胞融合，形成了異核體或雜合二倍體。為了驗證這些原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的可能而進行的研究最終表明：這些解釋均不成立。當前第24頁\共有66頁\編于星期四\7點回復突變可能的排除Lederberg和Tatum利用的雙營養(yǎng)缺陷型菌株進行試驗，已基本排除A或B品系發(fā)生回復突變產(chǎn)生原養(yǎng)型細菌的可能。單基因回復突變的頻率約為10-6；雙基因回復突變的頻率則為10-12，頻率很低。但試驗中產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落產(chǎn)生的頻率非常高，因此基本可以排除回復突變的可能。當前第25頁\共有66頁\編于星期四\7點互養(yǎng)作用及其排除試驗材料：A品系：A-B+T1s(met-bio-thr+leu+T1s)；B品系：A+B-T1r(met+bio+thr-leu-T1r)。試驗方法：將A、B品系混合接種在基本培養(yǎng)基表面；短時間后噴T1殺死A品系，使其不能持續(xù)產(chǎn)生Thr與Leu供B品系持續(xù)生長。結果與結論：仍然出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落。從而表明互養(yǎng)并非原養(yǎng)型菌落出現(xiàn)的原因，而可能發(fā)生了遺傳重組。當前第26頁\共有66頁\編于星期四\7點轉化作用及其排除Lederberg和Tatum曾把品系A的培養(yǎng)液經(jīng)加熱滅菌，加入到B品系的培養(yǎng)物中，未得到原養(yǎng)型菌落；表明原養(yǎng)型菌落可能不是由轉化作用產(chǎn)生。戴維斯(Dawis,1950)的U型管試驗(結果沒有得到原養(yǎng)型細菌)；實驗結論：細胞直接接觸是原養(yǎng)型細菌產(chǎn)生的必要條件。當前第27頁\共有66頁\編于星期四\7點異核體和雜合二倍體的可能性出現(xiàn)原養(yǎng)型菌落的另一種可能是細菌細胞發(fā)生融合，產(chǎn)生異核體或雙雜合二倍體。這兩種情況類似于二倍體生物的雜合體將產(chǎn)生原養(yǎng)型菌落。異核體指由于細胞融合而在細胞內(nèi)含有遺傳組成不同的兩個或多個細胞核。雙雜合二倍體則是異核體進一步發(fā)生核融合，形成二倍體細胞核，核內(nèi)含有兩種遺傳物質(zhì)。但細菌為單倍配子體生物，異核體和二倍體只能暫存在。培養(yǎng)繁殖過程中必將發(fā)生分離，產(chǎn)生各種缺陷型菌落。對試驗中得到的原養(yǎng)型菌落后代研究表明：后代沒有出現(xiàn)預期的性狀分離現(xiàn)象。當前第28頁\共有66頁\編于星期四\7點經(jīng)過上述分析可以認為：在Lederberg和Tatum及其它類似試驗中，發(fā)生了一種不同于轉化的遺傳重組方式，稱之為接合（conjugation）。由于歷史的局限，從一開始萊德伯格和塔特姆就根據(jù)真核的重組來解釋他們的發(fā)現(xiàn)，認為細菌接合是一個彼此交換遺傳物質(zhì)的過程。當前第29頁\共有66頁\編于星期四\7點F因子及其在雜交中的行為致育因子(fertilityfactor,F因子;sexfactor,性因子)。F因子的化學本質(zhì)是DNA，可以自主狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中或整合到細菌的染色體上。F因子可以在細菌細胞間進行轉移并傳遞遺傳物質(zhì)。圖F因子的結構圖F因子的整合當前第30頁\共有66頁\編于星期四\7點F因子狀態(tài)與遺傳物質(zhì)轉移特點Ffactor當前第31頁\共有66頁\編于星期四\7點F因子狀態(tài)與遺傳物質(zhì)轉移特點不能進行極少轉移Ｆ因子,大量轉移細菌基因。轉移Ｆ因子，還轉移細菌個別基因。Ｆ因子狀態(tài)游離整合菌株類型Ｆ+FˊＨfrＦ-

菌株性別♂♀雜交類型Ｆ+Ｆ-FˊＦ-ＨfrＦ-Ｆ-Ｆ-

傳遞特點只轉移Ｆ因子不轉移細菌基因。當前第32頁\共有66頁\編于星期四\7點F+F-(1)F纖毛(Fpili)由纖毛素(pilin)蛋白構成，接合管僅使細胞初步接觸；(2)轉移啟動轉移起始區(qū)(transferorigin,OriT),滾環(huán)復制；(3)單鏈轉移，復制，或重組。當前第33頁\共有66頁\編于星期四\7點HfrF-(1)F整合后呈線狀；(2)轉移起點0riT位于中間；(3)先轉移F因子的一部分,F的后面部分最后轉移。（4）重組子仍為F-高頻重組菌株P125異源雙鏈當前第34頁\共有66頁\編于星期四\7點三細菌基因重組的特點１部分二倍體:指含有一個完整基因組和部分基因組的細胞.(半合子)P85內(nèi)基因子:P85外基因子:P85２細菌基因重組的特點:(1)細菌基因重組是在部分二倍體中進行;(2)只有偶數(shù)交換才產(chǎn)生有活性的重組體;(3)相反的重組體不出現(xiàn).5-36當前第35頁\共有66頁\編于星期四\7點中斷雜交與重組作圖一、中斷雜交實驗原理

1中斷雜交實驗

Hfrthr+leu+azirtonrlac+gal+strs

F-

thr-leu-azistonslac-gal-strr

選擇培養(yǎng)基9′11′18′25′

加str

↓↓↓↓

無thr,leu

↓↓↓影印接種aziTonlacgal┆┆┆接合中斷接合殺死Hfr檢查基因作圖當前第36頁\共有66頁\編于星期四\7點當前第37頁\共有66頁\編于星期四\7點2中斷雜交實驗作圖原理A：

Hfr染色體上的基因是從某一點開始,以線性方式進入Ｆ-的,B：離原點愈近的基因進入Ｆ-愈早,出現(xiàn)在Ｆ-中的比例愈大,反之,則愈小.

3中斷雜交作圖:

指在HfrF-雜交中,把接合中的細菌在不同時間取樣,攪拌中斷雜交,分析受體菌基因型,以Hfr基因出現(xiàn)在Ｆ-中的先后為順序,以轉移的時間(分鐘)為圖距單位進行基因作圖的方法.

4作圖(原點)aziTonlacgalF09111825min當前第38頁\共有66頁\編于星期四\7點大腸桿菌基因組很大（全部轉移需要100分鐘），其遺傳圖譜須用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成。當前第39頁\共有66頁\編于星期四\7點1)不同的Hfr品系轉移的起始基因是不同的;說明：Ｆ因子可以在不同的位點插入細菌染色體;2)與同一基因相鄰的基因是相同的;說明：不同品系細菌的基因順序是相同的;3)Hfr基因可以兩個不同方向轉移基因進入Ｆ-;4)一個Hfr轉移的起始基因是另一個Hfr最后轉移的基因說明：細菌的染色體是環(huán)狀的.P85圖5-35

thr

lachis

galpurthipro2glyHfrH33121當前第40頁\共有66頁\編于星期四\7點5E.coli的染色體呈環(huán)狀當前第41頁\共有66頁\編于星期四\7點三、重組作圖(難點)１細菌的重組作圖的前提(1)

兩個基因緊密連鎖;(2)兩個基因進入受體菌的先后;

例：已知lac和ade緊密連鎖;lac+比ade+先進入Ｆ-;２雜交、選擇、統(tǒng)計重組體Hfrlac+ade+strs

F-lac-ade-strr

選擇培養(yǎng)基加str,無adeＦ-ade+strr伊紅美蘭培養(yǎng)基

紫紅色菌落ade+lac+粉紅色菌落ade+lac-B:lac+ade+

A:lac+ade+C:lac+ade+

F-lac+ade+親組合52F-lac-ade+重組合15當前第42頁\共有66頁\編于星期四\7點3計算重組體重組值=重組菌落數(shù)/總菌落數(shù)100%=(lac-ade+)/[(lac+ade+)+(lac-ade+)]100%=15/(52+15)100%≈20%已知中斷雜交實驗該兩個基因相距1分鐘,

重組作圖與中斷雜交作圖的圖距關系:

1分鐘圖距≈20%重組值4E.coli染色體全長：100分鐘；含有：4.6106bp20100≈2000cM1cM≈2000bp當前第43頁\共有66頁\編于星期四\7點F′因子與性導一F′因子與F′菌株F′因子：指整合態(tài)的F因子從Hfr上錯誤切割下來，且?guī)в屑毦鷤€別基因的F因子。F′菌株：指帶有F′因子的細菌。二性導:指利用Ｆ因子將供體菌的基因?qū)胧荏w形成部分二倍體的過程。F′

F-→F′+F′

當前第44頁\共有66頁\編于星期四\7點圖7-12F′因子的起源和部分二倍體的形成（仿自Griffiths，2005）當前第45頁\共有66頁\編于星期四\7點F′和F因子不同：①F′品系轉變成Hfr品系的頻率要高于F＋品系②F′變成Hfr時F′因子整合到同一（所帶基因的同源）位點上，而F＋變成Hfr時可整合到不同位點；③F′×F－

時可高頻傳遞特定的基因，形成部分二倍體。而F＋×F－要么產(chǎn)生F＋但不轉移任何基因，要么以10－7將宿主的基因按順序轉入受體，但受體仍為F－。所轉移的基因是不同的。

當前第46頁\共有66頁\編于星期四\7點性導:指利用Ｆ因子將供體菌的基因?qū)胧荏w形成部分二倍體的過程。F′

F-→F′+F′

1性導的特點:只能轉移Ｆ因子插入位點附近的基因。

2性導在遺傳分析中的應用：(1)F′因子可自主復制；(2)性導所形成的部分二倍體可用作測定兩突變形間的互補試驗；(3)確定部分二倍體中兩基因的顯隱系；(4)利用兩基因的共性導率作圖.P88：四種菌株總結雜交關系當前第47頁\共有66頁\編于星期四\7點Donorrecipient

defectivephageGeneralizedtransductionRestrictedtransduction轉導（transduction）與作圖當前第48頁\共有66頁\編于星期四\7點LerderbergandZinderLT22（P22溶原）phe-trp-tyr-his

+

LT2（P22敏感）phe+trp+tyr+his–結果：在MM上以10-5頻率出現(xiàn)原養(yǎng)型菌株。兩親本菌株分別置于U型管的兩臂時，在LT22的一邊出現(xiàn)了原養(yǎng)型菌株（與接合不同）。進一步實驗證明在兩個菌株間傳遞遺傳物質(zhì)的是沙門菌的一種溫和噬菌體P22。LT2LT22prototroph當前第49頁\共有66頁\編于星期四\7點普遍性轉導噬菌體的形成噬菌體的頭部誤包裝了細菌的染色體片段（大小相似的），形成轉導噬菌體，即：噬菌體頭部+供體菌的染色體片段或稱為：完全缺陷噬菌體，假噬菌體。P1包裝不嚴格，其中約有1/100的宿主片段可能會被錯誤地包裝到噬菌體中，稱為“偷渡”。當前第50頁\共有66頁\編于星期四\7點圖7-15普遍性轉導病毒顆粒的形成與受體細菌被轉導的結果當前第51頁\共有66頁\編于星期四\7點Generlizedtransduction當前第52頁\共有66頁\編于星期四\7點Abortivetransduction當前第53頁\共有66頁\編于星期四\7點普遍性轉導作圖(1)

作圖原理:兩基因的共轉率愈大相距愈近，反之則愈遠(2）雙因子轉導作圖例如：確定abc三個基因在染色體上的順序分別測定a-b、a-c、b-c的共轉導率；如果：a-b的共導率最大，a-c較大，而b-c的最小，則順序為：bac當前第54頁\共有66頁\編于星期四\7點兩點法基因順序的確定雜交測定三個共轉率:例：P1→供體thr+leu+azir

受體thr-leu-azis轉導子基因型共轉率leu+

azir50%leu+

thr+2%thr+

leu+3%thr+

azir0%

基因可能順序

thrazileu或

thrleuazi基因順序是:thrleuazi

2）三因子轉導作圖選擇thr+轉導子選擇leu+轉導子當前第55頁\共有66頁\編于星期四\7點(2)中間位點法

供體菌：supC+trpA+pyrF+

受體菌：supC-trpA-pyrF-↓

基因順序是:supCtrpApyrF

轉導子（1）supC+trpA+pyrF+36（雙交換）（2）supC+trpA+pyrF-114（雙交換）（3）supC+trpA-pyrF+0（四交換）（4）supC+trpA-pyrF-453（雙交換）當前第56頁\共有66頁\編于星期四\7點圖轉導噬菌體與受體染色體之間重組四交換形成轉導子頻率最低當前第57頁\共有66頁\編于星期四\7點3）共轉率與圖距關系公式:

d(圖距)=L(1-√x)L：轉導DNA的平均長度X:兩個基因的共轉導頻率3當產(chǎn)生轉導子是概率很低的隨機事件，加上噬菌體能攜帶細菌的DNA的總量受其頭部的大小容量限制，所以無論是a