細胞工程植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)詳解演示文稿

細胞工程植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)詳解演示文稿當前第1頁\共有147頁\編于星期四\7點（優(yōu)選）細胞工程植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)當前第2頁\共有147頁\編于星期四\7點第四章植物組織器官培養(yǎng)技術(shù)植物細胞工程的中心內(nèi)容是植物細胞和組織的離體培養(yǎng)；從技術(shù)上說，它是一種從單細胞到植株的無性繁殖技術(shù)；從遺傳的角度來講它具有雙重性，一是遺傳的保守性，二是遺傳的變異性。利用其保守性我們可以進行植物的快速繁殖，建立植物種質(zhì)資源庫以及生成有用化合物；利用其變異性我們可以進行體細胞誘變、體細胞雜交以及基因工程。當前第3頁\共有147頁\編于星期四\7點一植物脫毒與離體無性繁殖技術(shù)二花藥與花粉培養(yǎng)三植物胚胎培養(yǎng)當前第4頁\共有147頁\編于星期四\7點一植物脫毒與離體無性繁殖技術(shù)意義植物脫毒離體無性繁殖當前第5頁\共有147頁\編于星期四\7點意義任何一個優(yōu)良品種均需要有一個忠實地保存其遺傳性狀的繁殖方法。離體無性繁殖主要是以植物營養(yǎng)器官為外植體，繁殖過程在人工控制的環(huán)境條件下，所以既不會造成性狀分離同時還避免了病蟲害的侵染，從而可以很好地保持品種的優(yōu)良特性，是異交作物和無性繁殖品種繁殖的一個非常理想的途徑。1、能夠有效地保持優(yōu)良品種特性當前第6頁\共有147頁\編于星期四\7點離體繁殖周期短（1～3個月），不受季節(jié)限制，因此繁殖系數(shù)高（幾十至幾百倍），繁殖速度是任何其它方法所不能比擬的，所以通常將組織培養(yǎng)繁殖稱之為快繁（rapidclonalpropagation）。2、快速繁殖新品種繁殖系數(shù)（breedingcoefficient）：也叫增殖率，指每塊外植體在一個培養(yǎng)周期內(nèi)增殖的倍數(shù)。當前第7頁\共有147頁\編于星期四\7點目前受病毒為害嚴重的作物有：①大田作物馬鈴薯、甘薯、甘蔗和煙草。②蔬菜白菜、大蒜、蔥、番茄和蘿卜。③果樹柑橘、蘋果、草莓和香蕉。④花卉香石竹、各種菊花、天竺葵和紫羅蘭等。3、生產(chǎn)無病毒種苗，防治品種退化當前第8頁\共有147頁\編于星期四\7點對于那些以塊根、塊莖、鱗莖為繁殖器官的作物來講，每年相當一部分產(chǎn)品要用作留種。如：①大蒜留種量占產(chǎn)量的1/5～1/8。②馬鈴薯留種量占產(chǎn)量的1/10。③貝母留種量占產(chǎn)量的1/3。

4、節(jié)約耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品商品產(chǎn)出率當前第9頁\共有147頁\編于星期四\7點常規(guī)營養(yǎng)繁殖器官多是塊根、塊莖、鱗莖、枝條等，體積大、含水量高，包裝、運輸十分不便，特別是遠距離調(diào)運損失很大。離體繁殖的種苗體積小，一般自帶容器，很容易攜帶，運輸方便。-以馬鈴薯為例來講，按1畝地4000株計算，常規(guī)種薯4000個重約200kg,若用試管薯4000個則只有2kg。5、便于運輸當前第10頁\共有147頁\編于星期四\7點基本原理技術(shù)規(guī)程影響脫毒效果的因素植物莖尖脫毒當前第11頁\共有147頁\編于星期四\7點莖尖脫毒是控制植物病毒的有效途徑－藥物防治病毒效率低－抗病毒育種步履艱難－組織培養(yǎng)的高效隔離防止了病毒的再侵染脫毒－保持種性－快繁已是一個系統(tǒng)技術(shù)，在許多無性繁殖作物的種苗生產(chǎn)上均形成了自己的體系。1、基本原理當前第12頁\共有147頁\編于星期四\7點病毒在植物體內(nèi)的分布具有不均勻性－1934年，White發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒（TMV）在煙草根中分布是不均勻的，越靠根尖區(qū)病毒含量越低，在根尖的頂端（生長點）不含病毒。－1949年，Limaset和Cornuet根據(jù)White的發(fā)現(xiàn)推測，病毒在煙草莖中的分布也可能存在與根部組織同樣的情況，莖尖分生組織也應(yīng)不帶病毒。－1952年，Morel和Martin首先利用莖尖分生組織培養(yǎng)獲得了大麗花和馬鈴薯無病毒苗，同時建立了莖尖脫毒的組織培養(yǎng)技術(shù)體系。當前第13頁\共有147頁\編于星期四\7點能量競爭傳導(dǎo)抑制激素抑制酶缺乏抑制因子關(guān)于植物分生組織種不帶或很少帶有病毒的假說當前第14頁\共有147頁\編于星期四\7點（1）被脫毒植物攜帶病毒的診斷（2）母體材料的選擇和預(yù)處理（3）莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株（4）脫毒效果檢測（5）脫毒苗的保存與繁殖2、基本技術(shù)規(guī)程當前第15頁\共有147頁\編于星期四\7點（1）被脫毒植物攜帶病毒的診斷基本規(guī)程在脫毒之前，首先應(yīng)該了解植物攜帶何種病毒，其感染程度如何，以便采取適當處理措施。這種診斷一般根據(jù)病毒病的癥狀特征和表現(xiàn)程度進行判斷，必要時借助指示植物或血清學、分子生物學方法幫助鑒別。當前第16頁\共有147頁\編于星期四\7點（2）母體材料的選擇和預(yù)處理基本規(guī)程母體的選擇：－欲脫毒材料的品種典型性－植株健康程度當前第17頁\共有147頁\編于星期四\7點外植體預(yù)處理：當前第18頁\共有147頁\編于星期四\7點

香石竹在38℃～40℃條件下經(jīng)兩個月處理可除去全部病毒。

菊花在35℃～38℃的條件下處理60天可使病毒失活。

馬鈴薯在37℃條件下處理10～20天能除去卷葉病毒。柑橘－速衰病毒/黃化病毒40℃/30℃條件下處理7～12周。鱗皮病毒需要在40℃/30℃條件下處理8周。啐葉病毒需要在50℃條件下處理3～22小時。洲青果病毒在50℃條件下處理30～40分鐘。當前第19頁\共有147頁\編于星期四\7點（3）莖尖分生組織培養(yǎng)再生植株外植體消毒－莖尖剝離與接種－莖尖培養(yǎng)基本規(guī)程當前第20頁\共有147頁\編于星期四\7點－外植體消毒

在切取外植體之前莖芽進行表面消毒。葉片包被嚴緊的芽，如菊花、蘭花，只須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹、蒜和馬鈴薯等，則用0.1%次氯酸鈉或升汞表面消毒10分鐘。對于這些消毒方法，工作中應(yīng)靈活運用，如在大蒜莖尖培養(yǎng)時，可將小鱗莖在75%酒精中浸蘸一下，再用燈火燒掉酒精然后解剖出無菌莖芽。

當前第21頁\共有147頁\編于星期四\7點ⅰ把莖芽置于解剖鏡下（8～40倍），一只手用鑷子將其按住另一只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針要常蘸入90%酒精，并用火焰灼燒以進行消毒。但應(yīng)注意解剖針的冷卻，可蘸入無菌水進行冷卻；ⅱ當一個閃亮半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將分生組織切下來，為提高成活率，可帶1-2枚幼葉然后將其接到培養(yǎng)基上；ⅲ接種時確保微莖尖不與其他物體接觸，用解剖針接種即可。剝離莖尖時，應(yīng)盡快接種，莖尖暴露時間應(yīng)當越短越好，以防莖尖變干?？稍谝粋€襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進行操作，有助于防止莖尖變干。

－莖尖剝離與接種當前第22頁\共有147頁\編于星期四\7點shoottipshootapexapicalmeristemapicaldome當前第23頁\共有147頁\編于星期四\7點－莖尖培養(yǎng)將接種好的莖尖置于25℃左右的溫度下,每天以16h2000～3000lx的光照條件下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠,所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月才能培養(yǎng)成功。

當前第24頁\共有147頁\編于星期四\7點當前第25頁\共有147頁\編于星期四\7點指示植物鑒定(indicatortestplants)所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的?；园Y狀的寄主植物。血清鑒定(serologictest)試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴散；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。

（4）脫毒效果檢測基本規(guī)程當前第26頁\共有147頁\編于星期四\7點指示植物鑒定(indicatortestplants)a.摩擦接種法：－取培養(yǎng)植株的葉片置于研缽中，加入少量的水和等量的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.0），磨成勻獎；－將其涂抹在指示植株葉片上并在葉片上撒上金剛砂，通過輕輕摩擦使汁浸入葉片表皮細胞而又不損傷葉片；－5分鐘后清水清洗葉面。將指示植株放于防蚜蟲網(wǎng)罩的溫室內(nèi)然后視其病斑的有無，來判斷是否脫除了病毒。如：植物液接種后如果使千日紅葉片枯斑，黃花煙、心葉煙呈花葉，證明該植物體內(nèi)具有馬鈴薯X病毒。

當前第27頁\共有147頁\編于星期四\7點b.嫁接法

有些病毒不是通過汁液傳播，而是通過專門的介體傳播的，例如草莓黃花病毒、草莓叢枝病毒是通過一種特殊的蚜蟲為介體進行傳播。這種病毒的鑒定需將培養(yǎng)植株的芽嫁接在敏感植物上，再根據(jù)敏感植株的病癥來判斷是否脫除了病毒。

當前第28頁\共有147頁\編于星期四\7點血清鑒定(serologictest)a.試管沉淀反應(yīng)

在抗原-抗體最適比例的條件下，觀察有無沉淀的產(chǎn)生來確定被測植株是否帶病毒。試管沉淀反應(yīng)操作簡單，需注意的問題：

①葉綠體的自發(fā)凝聚

可用磷酸緩沖液提取汁液，再用氯仿處理除去葉綠體，（pH保持在6.5～8.5）。

②抗原抗體的比例要適當，當抗原過量會抑制沉淀的形成。當前第29頁\共有147頁\編于星期四\7點絮狀沉淀反應(yīng)：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對應(yīng)，而又二者比例適當時，會出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反應(yīng)。環(huán)狀沉淀反應(yīng)：是一種定性試驗方法，可用已知抗體檢測未知的抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿著管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對應(yīng)，在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。當前第30頁\共有147頁\編于星期四\7點當前第31頁\共有147頁\編于星期四\7點原理

絮狀沉淀試驗

抗原溶液與相應(yīng)抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。(flocculationtest)方法評價：敏感度較低、簡便；易受抗原抗體比例影響臨床意義：可測定抗原抗體反應(yīng)的最適比。當前第32頁\共有147頁\編于星期四\7點1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉淀試驗絮狀沉示意圖淀AgAbAg當前第33頁\共有147頁\編于星期四\7點原理環(huán)狀沉淀試驗

把抗原液小心地加于已含抗體液的細試管液面上，當對應(yīng)的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環(huán)。(ringprecipitationtest)方法評價：

敏感度較低、簡便；只能定性不能定量、缺乏多對分辨力。臨床意義：

鑒定血跡、診斷炭疽當前第34頁\共有147頁\編于星期四\7點AbAg環(huán)狀沉淀示意圖沉淀管內(nèi)徑1.5～2mm1～5min出現(xiàn)沉淀環(huán)為陽性30min不出現(xiàn)沉淀環(huán)為陰性操作步驟當前第35頁\共有147頁\編于星期四\7點b.免疫雙擴散

在半固體凝膠中測定在其中擴散的抗原和抗體間的沉淀反應(yīng)的方法。與沉淀法比較起來有兩個優(yōu)點：一是節(jié)約血清，二是汁液不用特殊處理。

步驟：

①倒膠，一般厚2mm

②打孔，多打成梅花型

③加樣，加血清和汁液

一般加樣后在37℃恒溫過夜，即可進行結(jié)果觀察。有擴散沉淀的即為帶毒株，沒有則為不帶毒株。

當前第36頁\共有147頁\編于星期四\7點原理單向瓊脂擴散試驗

將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測抗原在凝膠中自由擴散，與相應(yīng)抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關(guān)。(singlegeldiffusiontest)方法評價：敏感度1.25mg/L、穩(wěn)定、簡便、重復(fù)性和線性均好當前第37頁\共有147頁\編于星期四\7點瓊脂單擴散試驗示意圖當前第38頁\共有147頁\編于星期四\7點原理雙向瓊脂擴散試驗

將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成沉淀線。(doublegeldiffusiontest)應(yīng)用：1.檢測未知Ag或Ab2.Ag性質(zhì)分析3.Ab效價滴定4.Ag或Ab純度鑒定當前第39頁\共有147頁\編于星期四\7點瓊脂雙擴散試驗示意圖當前第40頁\共有147頁\編于星期四\7點瓊脂雙擴散試驗結(jié)果圖當前第41頁\共有147頁\編于星期四\7點Agargeldiffusiontest

左圖示抗體與樣本都起反應(yīng)右圖示抗體只與一個樣本反應(yīng)當前第42頁\共有147頁\編于星期四\7點c、酶聯(lián)免疫吸附測定

（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）

它是將抗原抗體的免疫反應(yīng)和酶的高效催化反應(yīng)有機結(jié)合起來的一種綜合性技術(shù)。即通過化學的方法將酶與抗體或抗原結(jié)合起來，形成酶標記物。然后將它與相應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)，形成酶標記的免疫復(fù)合物。結(jié)合在免疫復(fù)合物的酶，在遇到相應(yīng)的底物時，催化無色底物生成有色底物，通過比色計可以準確測定。優(yōu)點是靈敏度高，測定快速，每次可以同時測定多個樣品。

當前第43頁\共有147頁\編于星期四\7點雙抗體夾心ELISA法示意圖當前第44頁\共有147頁\編于星期四\7點雙抗體夾心ELISA捕獲試驗當前第45頁\共有147頁\編于星期四\7點采用電子顯微鏡，可直接觀察樣品材料有無病毒存在，還可進一步鑒定病毒顆粒大小、形狀和結(jié)構(gòu)，這些特征相當穩(wěn)定，因此電鏡檢查法既準確又有效，但需要有一定的設(shè)備和技術(shù)。

電鏡檢查法當前第46頁\共有147頁\編于星期四\7點分子檢測法

例如RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReation）將待測樣品的總RNA與cDNA合成的試劑盒進行反應(yīng)，合成cDNA，然后利用病毒DNA特有的序列設(shè)計引物進行PCR反應(yīng)，即可以知道在寄主中是否有病毒基因的表達。

當前第47頁\共有147頁\編于星期四\7點脫毒苗的離體保存與繁殖建立脫毒種苗生產(chǎn)繁殖網(wǎng)絡(luò)體系木本植物建立隔離的脫毒苗母本園（5）脫毒苗的保存與繁殖基本規(guī)程當前第48頁\共有147頁\編于星期四\7點母體材料病毒侵染的程度外植體的生理狀態(tài)起始培養(yǎng)的莖尖大小3、影響脫毒效果的因素當前第49頁\共有147頁\編于星期四\7點莖尖長(mm)葉原基數(shù)小植株數(shù)脫毒植株數(shù)脫毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響當前第50頁\共有147頁\編于星期四\7點離體無性繁殖是在人工控制的無菌條件下，使植物在人工培養(yǎng)基上繁殖的技術(shù)。跟常規(guī)繁殖方法相比，它是一種微型且快速的操作過程，因此，有時也稱之為微繁(micropropagation)、快速繁殖（rapidcloneprogagation）。離體繁殖技術(shù)的應(yīng)用，首先應(yīng)歸功于Morel，他在1960年首先建立了蘭花離體繁殖的方法。目前已有近400種植物的離體繁殖獲得成功，其中許多有重要經(jīng)濟價值的花卉（如蘭花、菊花、石竹等）、水果（如草莓、無籽西瓜、葡萄、香蕉等）、經(jīng)濟作物（如馬鈴薯、甘蔗等）和林木（如桉樹、楊樹等）等，均已建立離體繁殖的種苗生產(chǎn)體系，取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。離體無性繁殖(propagationinvitro)

當前第51頁\共有147頁\編于星期四\7點無菌培養(yǎng)物的建立培養(yǎng)物的增殖器官分化植株的形成和移栽當前第52頁\共有147頁\編于星期四\7點關(guān)鍵環(huán)節(jié)應(yīng)用范圍需注意的問題當前第53頁\共有147頁\編于星期四\7點外植體的選擇－繁殖對象的品種典型性；－植物有自然條件下的繁殖特點。盡可能取自然繁殖器官的適當部位作外植體；－外植體的取材部位、大小和生理狀態(tài)關(guān)鍵環(huán)節(jié)當前第54頁\共有147頁\編于星期四\7點培養(yǎng)物的增殖－芽增殖－不定芽增殖－體細胞胚增殖－愈傷組織增殖關(guān)鍵環(huán)節(jié)當前第55頁\共有147頁\編于星期四\7點培養(yǎng)方法簡單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，能長期繼代繁殖這一繁殖方式一般不需添加外源激素。如果某些植物需要使用激素，一定要嚴格控制濃度，以防止產(chǎn)生愈傷組織。腋芽增殖當前第56頁\共有147頁\編于星期四\7點從現(xiàn)存的芽以外的任何器官和組織上通過器官發(fā)生重新形成的芽稱為不定芽（adventitiousbuds）特點－繁殖系數(shù)高－遺傳穩(wěn)定性較好－繼代次數(shù)有限不定芽增殖當前第57頁\共有147頁\編于星期四\7點胚狀體增殖增長率高，胚的雙極性免去了生根環(huán)節(jié)，但胚狀體休眠的誘導(dǎo)和解除還難以把握，其成苗率還不高。目前除一些特殊用途外（人工種子），這一技術(shù)途徑還沒有用于植物的快速繁殖。當前第58頁\共有147頁\編于星期四\7點所有的植物通過組織培養(yǎng)的方法均可以誘導(dǎo)形成愈傷組織，再進一步分化即可獲得小植株。這一途徑經(jīng)歷了組織培養(yǎng)技術(shù)的所有過程，即從愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織增殖、芽分化、根分化到形成完整植株。它屬于愈傷組織增殖

真正意義上的組織培養(yǎng)。一切通過其它增殖方式不能成功的植物，均可以通過愈傷組織的途徑獲得組培苗。愈傷組織增殖的特點是成功率高，繁殖系數(shù)大，但遺傳穩(wěn)定性較差。對要求遺傳穩(wěn)定性高的作物品種，一般不采用這一途徑快繁。當前第59頁\共有147頁\編于星期四\7點細胞或組織培養(yǎng)經(jīng)原球莖途徑分化成植株。大部分的蘭花屬于這一類型，即蘭花的各個部分的離體組織都能誘導(dǎo)形成原球莖，再經(jīng)培養(yǎng)分化形成植株。原球莖是蘭花種子萌發(fā)時產(chǎn)生的呈珠粒狀、縮短的、類似嫩莖的器官，是蘭科植物在誘導(dǎo)時分化出的原初植物形態(tài)，具有完整植株的器官雛形，成苗容易。原球莖增殖當前第60頁\共有147頁\編于星期四\7點關(guān)于試管苗生根與煉苗關(guān)鍵環(huán)節(jié)1.生根培養(yǎng)生根是獲得完整植株一個關(guān)鍵。通過腋芽、不定芽、愈傷組織途徑產(chǎn)生的芽長成試管苗，必須誘導(dǎo)生根才能移植。生根培養(yǎng)基一般要求降低礦物營養(yǎng)的濃度，

提高生長素的濃度，具體應(yīng)根據(jù)植物不同而定。當前第61頁\共有147頁\編于星期四\7點2.生產(chǎn)用苗的培育

－試管苗的生長環(huán)境：無菌異養(yǎng)高溫弱光恒溫

當前第62頁\共有147頁\編于星期四\7點a、壯苗

加入生長控制劑，如多效唑，B9（丁酰肼），CCC（矮壯素），其作用是使苗粗壯，葉綠素增加。

b、煉苗：將瓶蓋打開打破無菌環(huán)境，濕度逐漸下降，光照逐漸加強，使之形成新的功能強的根和葉片。一般煉苗時間為10～30d。－移栽前的工作當前第63頁\共有147頁\編于星期四\7點

－移栽時應(yīng)注意的問題a、防止菌類滋生b、保持小苗水分供給c、移栽時選擇合理的種植基質(zhì)d、注意一定光照，溫度條件當前第64頁\共有147頁\編于星期四\7點自然無性繁殖極易感染病毒的植物，如馬鈴薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹和百合等。有性繁殖變異范圍過大而自然條件下又不易無性繁殖的植物如非洲菊、花竹和紫羅蘭等。某些難以繁殖或繁殖系數(shù)很低的植物，某些需要加速繁殖的特殊基因型如名貴花卉、優(yōu)良資源、果樹芽變體和轉(zhuǎn)基因植物等。應(yīng)用范圍當前第65頁\共有147頁\編于星期四\7點增殖方式的合理選擇外源生長調(diào)節(jié)劑對品種典型性的影響繼代次數(shù)與變異需注意的問題當前第66頁\共有147頁\編于星期四\7點二花藥與花粉培養(yǎng)概念及意義花藥培養(yǎng)花粉及小孢子培養(yǎng)單倍體植株的鑒定及二倍化當前第67頁\共有147頁\編于星期四\7點花瓣雄蕊萼片雌蕊花托花柄當前第68頁\共有147頁\編于星期四\7點當前第69頁\共有147頁\編于星期四\7點當前第70頁\共有147頁\編于星期四\7點花藥培養(yǎng)（antherculture）屬于器官培養(yǎng)范疇?；ǚ叟囵B(yǎng)（pollenculture）也稱為小孢子培養(yǎng)（microsporeculture）,屬于細胞培養(yǎng)類型。

概念及意義當前第71頁\共有147頁\編于星期四\7點花藥培養(yǎng)與小孢子培養(yǎng)目的一樣，為了獲得單倍體－一定條件下，花藥培養(yǎng)與小孢子培養(yǎng)可以得到再生植株。這樣的植株只含有一套染色體，數(shù)目和配子體相同，因而是單倍體植株。－單倍體植株經(jīng)過染色體加倍就成為加倍單倍體植株（doubledhaploidplants,DH植株）或稱純合二倍體。當前第72頁\共有147頁\編于星期四\7點hexaploid植物其haploid為triploid普通小麥2n＝6x＝42n＝3x＝21octoploid植物其haploid為tetraploid草莓2n＝8x＝56n＝4x＝28當前第73頁\共有147頁\編于星期四\7點單倍體植物與其二倍體相比較，有三個明顯特點：－體細胞染色體數(shù)減半－生長發(fā)育弱，體形小，各種器官明顯減?。菩叟渥訃乐財∮?，有的甚至不能進入有性世代當前第74頁\共有147頁\編于星期四\7點純合二倍體不僅育性可以恢復(fù)且在遺傳上是純合的。加倍單倍體育種（DH育種）技術(shù)在植物遺傳育種上的價值體現(xiàn)在：－加快常規(guī)育種速度－提高常規(guī)育種選擇效率當前第75頁\共有147頁\編于星期四\7點常規(guī)育種，雜種F2代開始分離，繼續(xù)自交，通過不斷選擇和淘汰，一般需到F5～F6代才能得到純合后代?；ㄋ?、花粉培養(yǎng)可得到單倍體植株，染色體加倍后即獲得純合二倍體。從雜交到獲得純合株系，只需二個世代。因此，可以縮短育種年限3～4個世代。當前第76頁\共有147頁\編于星期四\7點在常規(guī)雜交后代中，存在顯、隱性的干擾從而影響選擇的準確性和效果，在加倍單倍體的后代中只有一種基因型和表現(xiàn)型，不存在顯性性狀掩蓋隱性性狀的問題，不良性狀在當代即可表現(xiàn)出來，便于淘汰。因此，利用花藥培養(yǎng)的單倍體育種技術(shù)可提高選擇效率。當前第77頁\共有147頁\編于星期四\7點

小麥高稈（D）對矮稈（d）為顯性，抗銹?。═）對不抗銹?。╰）為顯性，現(xiàn)在有純合的高稈抗銹病的小麥（DDTT）和矮稈不抗銹病的小麥（ddtt），問怎樣才能得到矮稈抗病的優(yōu)良品種（ddTT）？當前第78頁\共有147頁\編于星期四\7點Ｐ高抗矮不抗F1

高抗F2DDTTddttDdTtddTt高抗高不抗矮抗矮不抗ddTT矮抗ddTTddTt矮抗ddTT矮抗矮抗矮不抗ddTtddTT雜交自交選優(yōu)自交F3選優(yōu)當前第79頁\共有147頁\編于星期四\7點選育純種選用純合親本雜交利用現(xiàn)有基因重新組合選種

連續(xù)自交當前第80頁\共有147頁\編于星期四\7點Ｐ高抗矮不抗Ｆ１高抗DDTTddttDdTtdtdT雜交F1植株花粉單倍體幼苗DTDt花藥離體培養(yǎng)dtdTDTDt秋水仙素處理ddttddTTDDTTDDtt正常植株（純合子）矮抗第一年第二年矮桿抗病新品種第三年當前第81頁\共有147頁\編于星期四\7點單倍體途徑的應(yīng)用潛力：－迅速獲得純合型材料，縮短育種年限，提高選擇效率－獲得育種中間材料－與誘變育種相結(jié)合可以提高誘變頻率－與細胞融合相結(jié)合，使這一育種途徑更具有實際應(yīng)用意義－作為遺傳工程受體更為有效－用作基礎(chǔ)遺傳研究的各個領(lǐng)域當前第82頁\共有147頁\編于星期四\7點flowerbud花芽anther花藥antherculture花藥培養(yǎng)haploidcallus單倍體愈傷組織haploidembryo單倍體胚haploidplantlets單倍體植株colchicinetreatment秋水仙素處理homozygous純合的,同型結(jié)合的heterozygous雜合的，雜合子的diploid二倍體donorplant供體植株，母體植株當前第83頁\共有147頁\編于星期四\7點首先報道通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體植株成功的是印度學者Guha和Maheshwari(1964,1966)。目前已有250多種高等植物花藥培養(yǎng)成功。我國花藥培養(yǎng)獲得單倍體的技術(shù)途徑在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育種中廣泛應(yīng)用。

我國通過花藥培養(yǎng)途徑培育出大面積推廣應(yīng)用的水稻品種“寒花早”、“中花8號”等，小麥品種“京花1號”。同時還獲得大批具有育種價值的單倍體系?；ㄋ幣囵B(yǎng)當前第84頁\共有147頁\編于星期四\7點概念花藥培養(yǎng)（antherculture）指把發(fā)育到一定階段的花藥接種在人工培養(yǎng)基上，使其發(fā)育和分化成為植株的過程。當前第85頁\共有147頁\編于星期四\7點基本環(huán)節(jié)外植體選擇－外植體(花蕾)預(yù)處理－外植體消毒－花藥分離與接種－誘導(dǎo)培養(yǎng)－分化培養(yǎng)-移栽當前第86頁\共有147頁\編于星期四\7點供試材料的遺傳背景－目前，通過花藥培養(yǎng)成功獲得單倍體植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科和百合科等。－不同植物類型和同一類型的不同品種對花藥培養(yǎng)的反應(yīng)也是不同的。技術(shù)要點外植體選擇當前第87頁\共有147頁\編于星期四\7點供試材料的生理狀態(tài)在多年生植物中，幼年植株比老齡植株的花藥誘導(dǎo)頻率高。草本植物生長健壯且處于生殖生長高峰期的花藥誘導(dǎo)頻率較高，而徒長或是營養(yǎng)不足的植株花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)頻率較低。當前第88頁\共有147頁\編于星期四\7點花粉發(fā)育時期四分體—小孢子—單核花粉—雙核花粉最適期－Sunderland(1971)對煙草不同花粉發(fā)育時期的培養(yǎng)反應(yīng)進行了觀察：花粉發(fā)育時期胚狀體誘導(dǎo)頻率(％)減數(shù)分裂期0單核早期14單核晚期40雙核早期55當前第89頁\共有147頁\編于星期四\7點外植體預(yù)處理大量試驗結(jié)果表明，花藥培養(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的。－煙草、茄子3～5℃下72小時－水稻10℃下10～14天－柑橘3℃下5～10天－馬鈴薯4℃下48小時技術(shù)要點當前第90頁\共有147頁\編于星期四\7點低溫處理的作用：－低溫能使花粉保持較長的生活力，延緩花藥壁組織的衰老和降低花粉的死亡率，從而增加有效存活的花粉數(shù)量，使較多的小孢子完成從配子體到孢子體發(fā)育類型的轉(zhuǎn)變。當前第91頁\共有147頁\編于星期四\7點挑出適宜培養(yǎng)的花蕾或幼穗，一般先將花蕾或幼穗的表面用70%乙醇浸泡1min，然后在0.1%升汞中浸泡3～5min，無菌水沖洗3～5次。若花蕾包裹嚴密內(nèi)部一般是無菌的，只需要用蘸有70%酒精的棉球?qū)θ~鞘或花蕾進行表面擦拭就可達到滅菌的目的。

外植體的表面消毒技術(shù)要點當前第92頁\共有147頁\編于星期四\7點

將消毒過的材料置于超凈工作臺上，無菌剝?nèi)』ㄋ庍M行接種。在剝?nèi)』ㄋ帟r，應(yīng)注意在整個操作過程中盡可能避免花藥受到損傷，否則常常會刺激花藥壁形成愈傷組織。若是花藥較大的材料，可用解剖刀或鑷子剝開花蕾，取出花藥。如果是花器很小，可能需借助解剖鏡夾取花藥，或只是把花被去掉，將其余部分接種在培養(yǎng)基上。接種時盡量減少花藥在空氣中的暴露時間，將花藥水平地放在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。接種密度因培養(yǎng)方式而異。

花藥分離與接種技術(shù)要點當前第93頁\共有147頁\編于星期四\7點花藥培養(yǎng)培養(yǎng)基－花藥培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基：MS（Murashigc&Skoog，1962）Nitsch(Nitsch，1969)N6(朱至清，1974)B5(Gamborgetal，1976)－附加成分：蔗糖,激素。技術(shù)要點當前第94頁\共有147頁\編于星期四\7點蔗糖在花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)階段的主要功能是:提供C源；維持適宜的滲透壓；抑制花藥壁分裂而促進花粉細胞的分裂番茄花藥培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)頻率對蔗糖濃度的反應(yīng)蔗糖濃度2％3％4％6％10％13％17％誘導(dǎo)頻率5％10％12％18％25％45％8％當前第95頁\共有147頁\編于星期四\7點在花藥的誘導(dǎo)培養(yǎng)期間（脫分化），需要有較適宜的細胞分裂素和生長素配比，從而有效地誘導(dǎo)花粉細胞啟動分裂，同時控制二倍體細胞的分裂。常用的激素：-細胞分裂素類：BA、KT、玉米素-生長素類:NAA、IAA、2,4-D

當前第96頁\共有147頁\編于星期四\7點高秀云等對茄子的研究表明：MS＋2,4-D0.5mgl-1＋KT1mgl-1n93.8%2n6.2%MS＋2,4-D2mgl-1＋KT1mgl-1n64,1%2n35.9%高濃度的2,4-D主要誘導(dǎo)花藥形成愈傷組織，而不能形成胚狀體，從而增加了二倍體細胞發(fā)育的機會。當前第97頁\共有147頁\編于星期四\7點培養(yǎng)條件－溫度和光照

溫度：25～28℃下進行花藥和花粉培養(yǎng)。－柑橘在20℃以下完全不能形成胚狀體，愈傷組織形成亦很少；溫度提高到21～25℃時便有胚狀體形成，而當溫度提高到26℃以上時又完全不能夠形成胚狀體。－油菜若將接種后的花藥在30℃條件下培養(yǎng)2～3天，可顯著提高花粉胚的形成率。－小麥在33℃條件下培養(yǎng)3～5天可提高成愈率和綠苗率當前第98頁\共有147頁\編于星期四\7點光照：先弱后強，光照1000～2000lx、光周期14h條件下進行分化培養(yǎng)；關(guān)于光質(zhì)對花藥和花粉培養(yǎng)影響的研究較少。當前第99頁\共有147頁\編于星期四\7點培養(yǎng)方法

－固體培養(yǎng)－液體培養(yǎng)－雙層培養(yǎng)－分步培養(yǎng)－條件培養(yǎng)當前第100頁\共有147頁\編于星期四\7點固體培養(yǎng)Antherandhaploid

plantletsonasolid

mediumcontaining

activatedcharcoal當前第101頁\共有147頁\編于星期四\7點Antherandhaploid

plantletsonaliquid

mediumcontaining

activatedcharcoal液體培養(yǎng)當前第102頁\共有147頁\編于星期四\7點在3.5cm小培養(yǎng)皿中鋪加一層（1ml）瓊脂培養(yǎng)基，待固化后，在其表面再加入0.5ml液體培養(yǎng)基。優(yōu)點在于花藥在培養(yǎng)早期可以從活性高的液體培養(yǎng)基中汲取營養(yǎng)，花粉胚長大后又不會沉沒，可以在通氣良好的條件下分化成植株。雙層培養(yǎng)當前第103頁\共有147頁\編于星期四\7點將花藥接種在液體培養(yǎng)基上進行漂浮培養(yǎng)，花粉可以從花藥中自然釋放并散落在液體培養(yǎng)中，然后及時用吸管將花粉從液體培養(yǎng)基中取出，植板于瓊脂培養(yǎng)基上，使其處于良好的通氣環(huán)境，使得花粉植株的誘導(dǎo)率大大提高。分步培養(yǎng)當前第104頁\共有147頁\編于星期四\7點用預(yù)先培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基再次進行花藥培養(yǎng)，可使花藥培養(yǎng)效率大大提高。條件培養(yǎng)基不存在種的特異性，例如培養(yǎng)過小麥花藥的培養(yǎng)基對大麥同樣有效果。

條件培養(yǎng)基培養(yǎng)當前第105頁\共有147頁\編于星期四\7點Sunderland(1978)明確提出藥壁因子作用假設(shè)，認為當花粉對花藥壁因子接受能力最大的時期與花藥壁因子作用的最大時期一致時，植株的花藥最易被誘導(dǎo)。-組織學研究也證實藥壁因子在誘導(dǎo)花粉胚中起著關(guān)鍵作用。在煙草中，只有原來貼靠著花藥壁的花粉粒才能順利發(fā)育成花粉胚。在天仙子中，也只有處在藥室外圍緊靠絨氈層的花粉能夠發(fā)育成花粉胚。關(guān)于藥壁因子當前第106頁\共有147頁\編于星期四\7點當前第107頁\共有147頁\編于星期四\7點離體培養(yǎng)的花藥中小孢子改變發(fā)育途徑，經(jīng)過連續(xù)多次細胞分裂發(fā)育為孢子體的過程，通常稱為雄核發(fā)育（androgenesis)：花藥培養(yǎng)中單倍體形成的途徑當前第108頁\共有147頁\編于星期四\7點培養(yǎng)初期花粉發(fā)育的途徑根據(jù)Sunderland、Wicks和Norreel的研究，可以把早期花粉發(fā)育分為三類：(1)單核正常非均等分裂形成一個生殖核和一個營養(yǎng)核以后，或一個生殖核發(fā)育，或一個營養(yǎng)核發(fā)育，或二者均等發(fā)育。(2)單核均等分裂為兩個子細胞，以后不斷發(fā)育。(3)異常多核花粉粒發(fā)育有些小孢子核連續(xù)分裂3次，形成類似8核胚囊的現(xiàn)象，稱為花粉胚囊。當前第109頁\共有147頁\編于星期四\7點單倍體植株形成途徑－通過胚狀體形成單倍體植株－通過愈傷組織形成單倍體植株

當前第110頁\共有147頁\編于星期四\7點-通過早期的分裂，單個花粉粒細胞形成了一個多細胞團，這種多細胞團從花藥壁中釋放出來后按照合子胚的途徑發(fā)育，經(jīng)過球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚的發(fā)育過程。-由胚狀體的發(fā)育過程可以看出，一個花粉粒只形成一個胚狀體，一個胚狀體萌發(fā)出一個植株。也就是說，通過胚狀體形成的植株均是來自單個花粉粒。通過胚狀體形成單倍體植株當前第111頁\共有147頁\編于星期四\7點-花粉粒早期分裂的細胞團如果一直保持無序分裂狀態(tài)，會形成多細胞團的愈傷組織，進一步分化成植株。目前為止，大多數(shù)花藥培養(yǎng)成功的植物都是由這一途徑產(chǎn)生。-通過愈傷組織形成的植株其倍性常不只是單倍體也有二倍體，有時還有多倍體、混倍體等。通過愈傷組織形成單倍體植株當前第112頁\共有147頁\編于星期四\7點NAA濃度對甜椒品種“二豬咀”花藥誘導(dǎo)胚狀體的影響NAA(mgl-1)0.251.02.0embryoid(%)6.451.91.11callus6.79.212.9當前第113頁\共有147頁\編于星期四\7點植株再生途徑與倍性植株來源倍性細胞類型embryoidn單個花粉粒callusn/2n/2n+單個或多個花粉?；ǚ奂毎c花藥壁細胞等當前第114頁\共有147頁\編于星期四\7點①誘導(dǎo)頻率低。頻率最高的煙草也只有30%，低的只有百分之幾，千分之幾；

②體細胞（花絲、藥壁、藥隔）干擾問題；

③藥壁絨氈層細胞對花粉發(fā)育的作用以及如何用合成培養(yǎng)基代替氈絨層的作用還不十分清楚，目前培養(yǎng)基成分帶有一定的盲目性；

④白化苗問題

存在的問題當前第115頁\共有147頁\編于星期四\7點禾谷類植物的花藥培養(yǎng)中經(jīng)常會出現(xiàn)白化苗－愈傷組織分化綠苗或白苗的特性是相對穩(wěn)定的，綠苗和白苗混生的現(xiàn)象只占極少數(shù)。－影響花粉白苗形成的因素可能包括：供體植物的基因型、花粉發(fā)育時期、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等。－染色體結(jié)構(gòu)的變異可能是白化苗的成因。當前第116頁\共有147頁\編于星期四\7點概念花粉培養(yǎng)（pollenculture）即小孢子培養(yǎng)（microsporeculture）,是從花藥中分離出花粉粒使之成為分散的或游離的狀態(tài)，通過培養(yǎng)使花粉粒脫分化進而發(fā)育成完整植株的過程?；ǚ奂靶℃咦优囵B(yǎng)當前第117頁\共有147頁\編于星期四\7點關(guān)鍵環(huán)節(jié)取材時期的確定－花粉的分離－花粉的培養(yǎng)當前第118頁\共有147頁\編于星期四\7點四分體—單核早期—單核晚期—雙核早期—雙核晚期—三核期－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－小孢子花粉粒－－－－－－－－－－－－花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)技術(shù)要點取材時期的確定當前第119頁\共有147頁\編于星期四\7點－機械分離法－花藥漂浮自然釋放法

技術(shù)要點

花粉或小孢子的分離當前第120頁\共有147頁\編于星期四\7點培養(yǎng)方法技術(shù)要點－哺育培養(yǎng)－看護培養(yǎng)－微室培養(yǎng)

當前第121頁\共有147頁\編于星期四\7點當前第122頁\共有147頁\編于星期四\7點a、花藥培養(yǎng)容易受藥壁、藥隔、花絲等體細胞組織的影響，再生植株會出現(xiàn)不同倍性的個體，而花粉培養(yǎng)可以克服這一不足。

b、能更好調(diào)節(jié)控制核發(fā)育的各種因子，而且可直接從單細胞開始觀察整個雄核發(fā)育的過程，為研究雄核生理生化等問題提供方便。

c、原則上講，從花粉培養(yǎng)能得到更多的花粉植株。

花粉培養(yǎng)的優(yōu)點當前第123頁\共有147頁\編于星期四\7點與其他器官的培養(yǎng)技術(shù)相比，花粉粒培養(yǎng)還不成熟，影響培養(yǎng)的效果可能很多，要非常系統(tǒng)歸納還不可能，簡述如下：

A在培養(yǎng)前分離的花藥應(yīng)多次洗滌，否則其生長和形態(tài)發(fā)生將受影響，不洗滌的花粉不能生長或只能形成愈傷組織

B冷處理已廣泛用來提高花粉雄核發(fā)育的頻率

C培養(yǎng)基中增加蔗糖和肌醇的濃度能明顯提高雄核發(fā)育的頻率。

當前第124頁\共有147頁\編于星期四\7點單倍體植株的鑒定及二倍化

－形態(tài)學鑒定－染色體分析鑒定方法當前第125頁\共有147頁\編于星期四\7點

－秋水仙素處理加倍－繼代加倍－創(chuàng)傷法加倍

單倍體植株的二倍化當前第126頁\共有147頁\編于星期四\7點三植物胚胎培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)中所取外植體部位及取材時期不同，植物胚胎培養(yǎng)包括：胚培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)以及子房培養(yǎng)。胚珠和子房培養(yǎng)由于取材時期不同，包括受精以后的胚珠子房培養(yǎng)、未受精胚珠和子房培養(yǎng)。當前第127頁\共有147頁\編于星期四\7點胚培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)當前第128頁\共有147頁\編于星期四\7點植物胚培養(yǎng)(embryocultureofplants)胚培養(yǎng)在實踐中的意義－克服雜交育種中雜種胚的早期夭折－克服珠心胚干擾，提高育種效率－理論研究領(lǐng)域的應(yīng)用1.胚培養(yǎng)的意義和類型當前第129頁\共有147頁\編于星期四\7點胚培養(yǎng)的類型－成熟胚(matureembryo)培養(yǎng)－幼胚(immatureembryo)培養(yǎng)當前第130頁\共有147頁\編于星期四\7點成熟胚培養(yǎng)－成熟胚一般指子葉期后至發(fā)育完全的胚。培養(yǎng)較易成功，在含有大量元素和糖的培養(yǎng)基上能正常生長成幼苗。由于種子外部有較厚種皮包裹不易造成損傷，易于進行消毒，因此，將成熟或未成熟種子用70%酒精進行幾秒種的表面消毒，再用無菌水沖洗3～4次，然后在無菌條件下進行解剖，取出胚并接種在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)。

當前第131頁\共有147頁\編于星期四\7點幼胚培養(yǎng)－幼胚是指子葉期以前的幼小胚，由于幼胚培養(yǎng)在遠緣雜交育種上有極大的利用價值，因此，其研究和應(yīng)用越來越深入和廣泛。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)不斷完善，幼胚培養(yǎng)技術(shù)也在進步，現(xiàn)在可使心形期胚或是更早期的長度僅0.1～0.2mm的胚生長發(fā)育成植株。

當前第132頁\共有147頁\編于星期四\7點Hanning早在1904年就培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，發(fā)現(xiàn)離體胚可以充分發(fā)育，并且提前萌發(fā)形成小苗，這是世界上胚培養(yǎng)最早獲得成功的一例。Laibach在1925～1929年間，培養(yǎng)亞麻種間雜種幼胚，成功地獲得了種間雜種，首次證實了這種方法在實際應(yīng)用中的價值。李繼侗，1933年在銀杏培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了胚乳提取物能夠促進銀杏離體胚的生長。為后人使用植物胚乳汁液、幼嫩種子及果實提取液等天然物質(zhì)促進培養(yǎng)物的生長具有啟示作用。2.幼胚培養(yǎng)

當前第133頁\共有147頁\編于星期四\7點－取材時期－幼胚剝離－培養(yǎng)條件與控制幼胚培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)當前第134頁\共有147頁\編于星期四\7點A)GlobularB)heartshapedC)torpedo大多數(shù)幼胚培養(yǎng)成功的實例證明，適宜于幼胚培養(yǎng)的胚發(fā)育時期多為球形胚至魚雷形胚。以幼胚搶救為目的的胚培養(yǎng)取材，必須在胚退化衰敗之前。

取材時期當前第135頁\共有147頁\編于星期四\7點－幼胚是一種半透明、高粘稠狀組織，剝