胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)專題

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)專題生物探索編者按自世界首例試管嬰兒誕生以來，相繼出現(xiàn)了三代試管嬰兒技術(shù)。技術(shù)的發(fā)展以及現(xiàn)實需求使第三代試管嬰兒技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛，患者受益越來越顯著。然而，第三代試管嬰兒技術(shù)在臨床上應(yīng)用如何？面臨著哪些困境？在全面二孩時代，企業(yè)是如何推動我國第三代試管嬰兒技術(shù)的發(fā)展？世界首例“試管嬰兒”于1978年7月25日誕生于英國奧德海姆總醫(yī)院，我國首例試管嬰兒于1988年誕生于北京大學(xué)第三醫(yī)院，迄今為止，全世界已有超過600萬例的試管嬰兒。自世界首例試管嬰兒誕生以來，相繼出現(xiàn)了三代試管嬰兒技術(shù)。技術(shù)的發(fā)展以及現(xiàn)實需求使第三代試管嬰兒技術(shù)應(yīng)用越來越廣泛，患者受益越來越顯著。然而，第三代試管嬰兒技術(shù)在臨床上應(yīng)用如何？面臨著那些困境？在全面二孩時代，企業(yè)是如何推動我國第三代試管嬰兒技術(shù)的發(fā)展？1概述三十多年來，輔助生殖技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了常規(guī)的“試管嬰兒門體外受精和胚胎移植）、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSIX胚胎移植前基因（遺傳學(xué)）診斷，再到囊胚培養(yǎng)、卵子和精子冷凍、卵母細胞體外成熟技術(shù)等，這些技術(shù)是現(xiàn)代科學(xué)的一項重大成就，開創(chuàng)了胚胎研究和生殖控制的新紀(jì)元。試管嬰兒的三大時代試管嬰兒技術(shù)出現(xiàn)后經(jīng)歷不斷發(fā)展的過程，相繼出現(xiàn)三代試管嬰兒技術(shù)?！暗谝淮嚬軏雰骸币卜Q常規(guī)試管嬰兒技術(shù)，是為了解決女性因素導(dǎo)致的不孕問題，如輸卵管、內(nèi)分泌、宮腔問題等而誕生的。這種技術(shù)將精子與卵子放在體外共同培養(yǎng)，靠精子和卵子的自由結(jié)合來實現(xiàn)受精過程?！暗诙嚬軏雰骸笔菫榱私鉀Q由于男性因素導(dǎo)致的不育問題，它又稱卵母細胞胞漿內(nèi)單精子顯微注射，通過直接將精子注射入卵母細胞胞漿內(nèi)，來達到助孕目的。如果男方精子數(shù)量稀少或沒有足夠的活動量，或即使有了足夠的活動量，精子也不愿意與卵子結(jié)合，這種情況下第二代試管嬰兒技術(shù)可以大顯身手?！暗谌嚬軏雰骸币卜Q胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，指在胚胎移植前，取胚胎的遺傳物質(zhì)進行分析，診斷胚胎是否有異常，然后篩選健康胚胎移植。技術(shù)發(fā)展所需，現(xiàn)實所迫——PGD/PGS技術(shù)應(yīng)運而生2012年中國人口協(xié)會發(fā)布的調(diào)查結(jié)果顯示，目前我國不孕不育患者已經(jīng)超過4000萬，占育齡人口的12.5%。據(jù)“2009中國不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報告”：不孕不育的發(fā)病率達15%，病因有上百種、治愈率僅34%，試管嬰兒平均成功率為20-30%，不孕不育患者治療失敗約占66%，而這些病因中有50%以上的遺傳因素導(dǎo)致。近年來，隨著進行輔助生殖助孕的患者越來越多，臨床發(fā)現(xiàn)在輔助生殖過程中部分高風(fēng)險夫婦的胚胎易出現(xiàn)反復(fù)種植失敗或者不明原因流產(chǎn)的情況，試管嬰兒的總體活產(chǎn)率不到30%。而研究發(fā)現(xiàn)胚胎染色體異常時導(dǎo)致試管嬰兒失敗的主要原因。2012年《FertilityandSterility):對2,282枚反復(fù)流產(chǎn)患者的胚胎進行分析，顯示胚胎整倍體的概率僅占35%2010年《FertilityandSterility)雜志上的研究對113份極體和73份囊胚染色體檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非整倍體率分別為65.5%和45.2%此外,2016年(FertilityandSterility》雜志上的文獻表明，隨著女性年齡增加，胚胎整倍體概率顯著下降，超過35歲后，整倍體概率直線下降，試管嬰兒活產(chǎn)率不到40%。單純的形態(tài)學(xué)評價已不足以實現(xiàn)真正選擇染色體核型正常的胚胎植入，因此，臨床上希望通過一定的技術(shù)手段能夠在胚胎植入前對胚胎進行篩選，選擇健康的胚胎進行植入，從而提高試管嬰兒的妊娠率和活產(chǎn)率。第三代試管嬰兒技術(shù)又稱為PGD/PGS技術(shù)，針對單基因遺傳以及染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常的檢測，準(zhǔn)確率達99%以上。在臨床輔助生殖方面，起到關(guān)鍵的指導(dǎo)作用。在國外，通過使用PGS技術(shù)能夠?qū)⒒町a(chǎn)率提高至70%的水平，因而我國亟需PGD/PGS技術(shù)來更好地實現(xiàn)健康生育。試管嬰兒技術(shù)發(fā)展史GIFT:配子輸卵管內(nèi)移植；ZIFT:合子輸卵管內(nèi)移植法；PZD/SZI:透明袋開孔法/透明帶下注入法;ICSI:卵母細胞胞漿內(nèi)單精子顯微注射；PGD-FISH:通過熒光原位雜交技術(shù)進行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷；PGD-CCS:綜合染色體篩查的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷什么是PGD/PGS?第三代試管嬰兒技術(shù)主要分為兩個方向，第一個是胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，即PGD，第二是胚胎植入前染色體篩查，即PGS。PGD是尋找特定染色體上的已知單基因疾病，PGS是以提高試管嬰兒植入率和活產(chǎn)率為目的的早期產(chǎn)前篩查方法。PGD側(cè)重于胚胎著床前的遺傳診斷，經(jīng)過體外授精獲得胚胎。檢測物質(zhì)主要是8細胞期的1個胚胎細胞或者囊胚期的3-5個胚胎滋養(yǎng)層細胞。檢測用單細胞DNA分析法，一是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,檢測男女性別和單基因遺傳??；另一種是熒光原位雜交（FISH）,檢測性別和染色體病。PGD用于臨床檢測越來越廣泛，其主要應(yīng)用于單基因病遺傳病診斷，染色體異常診斷等。PGS技術(shù)是通過一系列的分子技術(shù)手段，針對胚胎染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常進行檢測，從中篩選出在染色體水平正常的胚胎植入子宮，以期提高胚胎植入的成功率。整個試管嬰兒的流程以及胚胎植入前檢測點如下：PGD/PGS的發(fā)展歷程（1）PGD的發(fā)展史PGD可看作是最早期的產(chǎn)前診斷，是生殖醫(yī)學(xué)與遺傳學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物。PGD為控制遺傳患兒的出生、降低遺傳率，探討出生缺陷發(fā)病機制等提供了重要途徑。1967年Edwards提出了PGD的思想（2）PGS的發(fā)展史PGD已成功應(yīng)用20余年，PGS針對染色體的異常篩查，晚于PGD發(fā)展，屬于嶄新領(lǐng)域，但隨著新技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，PGS檢測技術(shù)越來越多地應(yīng)用于相關(guān)研究和臨床檢測中。最早進行PGS檢測的熒光原位雜交技術(shù)（FISH）具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點，但由于熒光顯微鏡只能同時觀察部分探針的熒光信號，因此FISH只能對有限的染色體進行檢測。隨后，隨著全基因組擴增技術(shù)的發(fā)展，CGH技術(shù)更加全面的、將診斷范圍擴展至全基因組范圍檢測，其原理主要是用不同熒光色標(biāo)記待檢測DNA和對照DNA，然后進行雜交，通過雙色熒光強度進行對比分析信號。與FISH相比，其主要優(yōu)點是可以檢測所有染色體數(shù)目以及每條染色體各個位點遺傳物質(zhì)是否改變。但該技術(shù)在使用過程中需要對照DNA，并且根據(jù)熒光強度進行樣本分析，其準(zhǔn)確性相對較低。最近，高通量測序的發(fā)展致使越來越多的研究使用二代測序技術(shù)進行PGS單細胞活檢分析。2013年研究人員利用高通量測序技術(shù)對單細胞MDA全基因組擴增產(chǎn)物進行低覆蓋度的全基因組測序，開展了人類胚胎細胞非整倍體篩查的臨床前研究,發(fā)現(xiàn)在0.07倍的測序深度和5.5%的覆蓋度下可以有效進行染色體非整倍體的確定，在進行活檢囊胚滋養(yǎng)細胞測序的38個囊胚中，68%（26/38）為整倍體，32%（12/38）為非整倍體（15.8%為數(shù)目異常，10.5%的樣本檢測為非平衡易位，5.3%的樣本既是非整倍體又是結(jié)構(gòu)異常），其檢測結(jié)果準(zhǔn)確性與arrayCGH的結(jié)果完全吻合。越來越多的PGS使用二代測序技術(shù)進行胚胎活檢樣本檢測，這說明隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，PGS也得到越來越多的應(yīng)用。PGS為避免反復(fù)流產(chǎn)、降低遺傳患兒的出生、以及臨床體外輔助生殖有重大意義。PGD/PGS的檢測范圍(1)PGD——單基因疾病診斷、染色體異常檢測、其他PGD主要應(yīng)用于單基因病、X染色體連鎖遺傳和已知的染色體異常檢測，以及一些其他疾病等，其多應(yīng)用于具有明確遺傳缺陷的病人。較常見的單基因遺傳病有血友病、白化病、進行性肌營養(yǎng)不良、苯丙酮尿癥等。根據(jù)遺傳類型分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X連鎖顯性遺傳、X連鎖隱性遺傳和Y連鎖遺傳五個類型。單基因病遺傳類型不同，檢測方法也不同°PGD進行單基因遺傳病的檢測方法主要是通過PCR方法，2005年我國研究人員應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對地中海貧血進行PGD檢測，結(jié)果選擇非地中海貧血的胚胎移植到子宮，避免妊娠一個地中海貧血胎兒。2009年研究人員利用PGD技術(shù)對杜氏肌營養(yǎng)不良攜帶者進行臨床治療，阻止不良患兒的出生。PGD檢測技術(shù)可以診斷體外輔助生殖過程中染色體異常的胚胎，使這些異常胚胎避免植入，預(yù)防反復(fù)流產(chǎn)以及生出不健康的嬰兒。2007我國研究人員利用熒光原位雜交技術(shù)，成功對1例Y染色體微缺失患者進行了PGD，避免Y染色體微缺失胚胎植入，并順利分娩1健康女嬰。2011年，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心通過單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)對1例平衡易位攜帶患者的PGD試管嬰兒助孕治療，篩選染色體正常的胚胎進行植入，并于2012年3月成功分娩一健康女嬰。這些實例說明，PGD可以用于胚胎染色體異常檢測，輔助體外生殖。PGD除了單基因遺傳病和染色體異常疾病診斷外，也可用于HLA分型檢測。2004年研究人員針對中國人16種6地貧突變類型和8種常見的HLA-DRB1基因型建立了穩(wěn)定的單細胞多重巢式PCR檢測技術(shù)，可同時檢測6珠蛋白基因，與6珠蛋白基因緊密連鎖的STR基因及HLA-DRB1基因，并對4例已出生重型6地貧患兒的患者進行了6地貧HLA配型的PGD治療。全世界遺傳性疾病有4000余種，目前通過使用第三代試管嬰兒技術(shù)，能篩選甄別和檢測的遺傳性疾病達確定的多達72種，具體有以下疾?。篈ddison?。ú⒂心X硬化）血管角質(zhì)瘤Fabry病腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良先天性白內(nèi)障腎上腺發(fā)育不良小腦共濟失調(diào)血球蛋白血?。˙ruton型）小腦共濟失調(diào)血球蛋白血?。ㄈ鹗啃停U散性腦硬化眼部白化病腓骨肌萎縮癥（Charcot-Marie-Tooth,CMT）白化病一耳聾綜合征無脈絡(luò)膜癥Wiskott-Aldrich綜合征脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變Alport綜合征色盲（綠色系列型）釉質(zhì)生長不全（成熟低下型）膽囊纖維化和血友病釉質(zhì)生長不全（發(fā)育不良型）腎源性尿崩癥遺傳性低色素性貧血尿崩癥（神經(jīng)垂體型）先天性角化不良低磷酸血性佝僂病外胚層發(fā)育不全（無汗型）魚鱗癬Ehlers-Danlos綜合征（第V類型）色素失節(jié)癥面生殖發(fā)育不全（Aarskog綜合征）Kallmann綜合征局灶性皮膚發(fā)育不良Spinulosa毛囊角化病葡萄糖-6磷酸脫氫酶缺乏癥Lesch-Nyhan綜合癥糖原貯積第VII類型）Lowe（眼腦腎）綜合癥性腺發(fā)育不全（xy女性類型）視網(wǎng)膜黃斑營養(yǎng)不良慢性肉芽腫病Menkes綜合癥血友病A智力遲緩（FMRI型）血友病B智力遲緩（FRAXE型）腦積水（中腦水管狹窄）智力遲緩（MRXI型）小眼癥（并有多種畸形）（Lenz綜合癥感覺性聾癥（DNFZ型）黏多糖貯積病II（Hunte綜合征）磷酸甘油酸激酶缺乏肌營養(yǎng)不良（Becke