普通免疫學(xué)單克隆抗體

普通免疫學(xué)單克隆抗體第一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗體制備與抗原抗體反應(yīng)及應(yīng)用

抗體的制備（多克隆與單克隆抗體）基因工程抗體的制備主要的抗原抗體反應(yīng)免疫學(xué)在生物學(xué)中的應(yīng)用第二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗體的制備（多克隆與單克隆抗體）抗原上那部分可以引起機體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)，叫做抗原決定簇。一個抗原上可以有許多不同的抗原決定簇，因而使機體產(chǎn)生許多不同的抗體。

第三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗體的制備（多克隆與單克隆抗體）抗原上那部分可以引起機體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)，叫做抗原決定簇。一個抗原上可以有許多不同的抗原決定簇，因而使機體產(chǎn)生許多不同的抗體。

第四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日多克隆抗體具有異質(zhì)性：如何表示？等電聚焦實驗?zāi)芙沂径嗫寺】贵w中的各種抗體具有不同的等電點。等電聚焦實驗：蛋白質(zhì)在pH梯度膠中電泳，每個分子沿著pH梯度遷移至電荷為中性的相應(yīng)pH位置，并在此點積聚。多克隆抗體通常用兔制備的第五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日TheimmuneresponsetoanantigengenerallyinvolvestheactivationofmultipleB-cellsallofwhichtargetaspecificepitopeonthatantigen.Asaresultalargenumberofantibodiesareproducedwithdifferentspecificitiesandepitopeaffinitiestheseareknownaspolyclonalantibodies.第六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日用包含多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)免疫動物，從而刺激多個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對多種抗原表位的不同抗體。因此，所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物，稱為多克隆抗體(polyclonalantibody，pAb)，可以制作“生物導(dǎo)彈”。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，也稱為多克隆抗體。第七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗血清的缺陷：每一種抗血清都不同于其他任何的抗血清，即使選用遺傳背景完全相同的動物，采用相同的抗原制劑和相同的免疫程序。產(chǎn)生的抗血清只能是有限的數(shù)量，因此同一份血清制劑不可能長期使用或完成一系列復(fù)雜的實驗或臨床檢測。即使是用親和層析技術(shù)純化的抗體也可能包含少量引起交叉反應(yīng)的抗體，干擾對實驗的分析。第十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日發(fā)展一種無限量能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)均一且已知特異性的抗體分子方法。第十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日1975年Kǒhler和Milstein首先報道用細(xì)胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC)免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,建立起第一個B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株,并成功地制得抗SRBC的單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）。迄今世界已研制成數(shù)以千計的McAb。第十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日"fortheoriesconcerningthespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystemandthediscoveryoftheprincipleforproductionofmonoclonalantibodies"Jerne

KǒhlerMilsteinTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1984第十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日由一種克隆產(chǎn)生的針對一種細(xì)胞表位的特異性抗體叫做單克隆抗體。MonoclonalantibodiesrepresentasingleBlymphocytegeneratingantibodiestoonespecificepitope.單克隆抗體為單一種B細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的一種均一的免疫球蛋白，是一種獨特型的抗體。它的特異性是針對一個抗原決定簇的。第十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體的原理

骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)能大量無限增殖，因此能在體外長期培養(yǎng)，但不能分泌特異性抗體；B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無限增殖，因此不能長期培養(yǎng)。免疫動物的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，繼承了兩個親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞能無限制增殖的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。第十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日在制備雜交瘤過程中的一個問題是什么？如何解決？讓未成雜交瘤的骨髓瘤細(xì)胞和脾臟細(xì)胞去死第十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日

HAT培養(yǎng)基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。

第十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日5-磷酸核糖焦磷酸尿嘧啶RNADNA

次黃嘌呤（H）

胸腺嘧啶（T）氨基蝶呤（A）合成主要途徑

合成替代途徑

TKHPGRTHPGRT：次黃嘌呤鳥嘌呤核苷轉(zhuǎn)移酶TK：胸腺嘧啶激酶第十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日未融合的脾細(xì)胞因不能在體外長期存活而死亡；未融合的骨髓瘤細(xì)胞合成核酸的主要途徑被培養(yǎng)基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），不能利用培養(yǎng)基中的次黃嘌呤合成核酸而死亡。

第十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾臟細(xì)胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。經(jīng)過克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，即可無限制地大量制備單克隆抗體。第二十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日未融合的親代脾臟細(xì)胞壽命有限，不久就死亡了。第二十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第二十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日

三、單克隆抗體的制備過程

雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的主要步驟包括：

（1）抗原制備；

（2）免疫動物；

（3）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；

（4）細(xì)胞融合；

（5）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；

（6）雜交瘤細(xì)胞的篩選；

（7）雜交瘤細(xì)胞的克隆化；

（8）單克隆抗體的檢定；

（9）分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；

（10）單克隆抗體的大量制備。第二十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日1、免疫動物免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的過程。一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射?？乖ㄟ^血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。

2、細(xì)胞融合采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。第二十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日

3、選擇性培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補救途徑合成核酸而死亡。未融合的脾細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤－鳥嘌呤－磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。第二十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌所需特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進(jìn)行凍存。第二十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日

5、單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備主要采用動物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。

（1）體內(nèi)誘生法取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。第二十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日（2）體外培養(yǎng)法將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。近年來，各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。第二十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日鼠單抗也具有一些缺陷，主要是小鼠免疫系統(tǒng)不能識別某些免疫原。另一方面，由于多克隆抗體識別的是抗原的多個抗原決定簇，同時抗體的親和性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鼠來源的抗體，再加上技術(shù)環(huán)節(jié)的簡單性，所以一直具有不可取代的優(yōu)勢，也廣泛應(yīng)用于科研及診斷。如何得到高親和性、強特異性、廣譜識別性的抗體？

第二十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日

實驗動物的選擇：做單抗的動物最開始是小鼠，后來又有像epitomics這樣的公司用兔子的(有特殊的專利)，還有一些人用大鼠神馬的，當(dāng)然其它的動物的也有，據(jù)不完全統(tǒng)計，現(xiàn)在能用傳統(tǒng)方法制備單抗的動物已經(jīng)有二三十種了。但是最主流的還是小鼠和兔子了。第三十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日Monoclonalantibodies(mAbs)fromrabbitshavenotbeenavailablebecausenorabbitplasmacytomas(骨髓瘤樣腫瘤),fromwhichahybridomafusionpartnercouldbegenerated,havebeenidentified.第三十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日1995年，Dr.KatherineKnight在LoyolaUniversityofChicago成功地在在轉(zhuǎn)基因兔中獲得骨髓瘤樣腫瘤(plasmacytoma)。其后幾年里，Dr.RobertPytela和Mr.WeiminZhu在UCSF將此技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，使之能高產(chǎn)量的生產(chǎn)兔單克隆抗體。兔單克隆抗體(RabMAbs)：新一代單克隆抗體用于科研、診斷和治療第三十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日如何獲得骨髓瘤樣腫瘤?第三十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日在c-myc/v-abl轉(zhuǎn)基因兔身上成功地獲得了兔漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系第三十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日proto-oncogenes(原癌基因)

調(diào)控細(xì)胞生長和增殖的正常細(xì)胞基因。突變后轉(zhuǎn)化成為致癌的癌基因myc轉(zhuǎn)錄因子Burkitt淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病Abl-1:非受體酪氨酸激酶慢性髓性白血病第三十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第三十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第三十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第三十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日美國Epitomics公司成立于2001年9月，與加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)及芝加哥LOYOLA大學(xué)聯(lián)手開發(fā)出新型雜交瘤技術(shù)，擁有兔單克隆抗體(RabMabs)技術(shù)的全球?qū)＠?，是國際上唯一一家擁有兔類單抗技術(shù)的生物技術(shù)公司。

第三十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日2012年3月6日英國上市公司Abcam宣布將以1.7億美元收購全球唯一兔單株抗體蛋白生物技術(shù)公司Epitomics(F-宜佰)Epitomics第四十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第四十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第四十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日由于兔脾臟較大，可以進(jìn)行更多的融合實驗，使得高通量篩選融合細(xì)胞成為可能。預(yù)期后10年數(shù)百種治療性抗體將被開發(fā)用于許多疾病的治療。鼠單克隆抗體與兔單克隆抗體的比較親和力更高:可以比鼠抗血清識別更多種類的表位

識別表位更多:能夠識別許多小鼠中不產(chǎn)生免疫的抗原

特異性更高、檢測靈敏度更高、應(yīng)用范圍更廣、背景本底更低第四十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第四十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第四十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日漿細(xì)胞腫瘤第四十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日基因工程抗體的制備生物導(dǎo)彈的原理:生物導(dǎo)彈是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼，它由單克隆抗體與藥物、酶或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動導(dǎo)向，在生物體內(nèi)與特定目標(biāo)細(xì)胞或組織結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。

第四十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日單克隆抗體具有高度專一性，能夠識別細(xì)胞表面抗原、各種受體、各種體液成分及細(xì)胞內(nèi)和組織內(nèi)的各種成分，能精確地瞄準(zhǔn)和捕獲靶細(xì)胞，特異性地與靶目標(biāo)發(fā)生反應(yīng)，因而有“生物導(dǎo)彈”之稱。

單抗體引導(dǎo)藥物或毒素到達(dá)抗原存在部位使藥物或使毒素發(fā)揮更有效的作用.從而減少藥物、毒素、同位素和酶在腫瘤治療過程中引起嚴(yán)重的副作用,大大提高治療腫瘤的效果。第四十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日用鼠單克隆抗體制備的生物導(dǎo)彈有什么問題？第四十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日雜交瘤是鼠來源的，因此產(chǎn)生的抗體也是鼠源的蛋白，對于人體而言是一種異種蛋白。異種蛋白在人體內(nèi)可能會引起免疫反應(yīng)（哮喘、蕁麻疹/風(fēng)疹塊，產(chǎn)生抗體等）或被排斥，有時會引起嚴(yán)重的致死性反應(yīng)，因此自1980年代以來，如何解決生物導(dǎo)彈的這個問題，一直是生物導(dǎo)彈在人體內(nèi)應(yīng)用的重要問題。第五十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4V區(qū)第五十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗體基因的改造將鼠源抗體的V區(qū)與人源抗體C區(qū)基因重組，獲得的嵌合體（chimericalantibody),可保留鼠抗體對抗原的高親和性，又減弱鼠抗原對人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。解決方法第五十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日鼠單抗恒定區(qū)人源化鼠單抗恒定區(qū)人源化第五十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第五十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日如何得到親和力高、特異性強的抗體克??？通過遺傳工程技術(shù)改造與生產(chǎn)抗體第五十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗體基因文庫將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合，克隆到合適的表達(dá)載體（噬菌體）中，在原核細(xì)胞表達(dá)不同的抗體，形成一個抗體庫。從這個抗體庫中，用抗原可以篩選到相應(yīng)的抗體基因。優(yōu)點：一是從不適合進(jìn)行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得親和力高、特異性強的克隆抗體。第五十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日主要的抗原抗體反應(yīng)第五十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第五十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗體效價的測定血清：血液凝固析出的淡黃色透明液體，在凝血過程中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白塊，所以血清中無纖維蛋白原?？贵w效價(滴度，titer)：通過血清學(xué)方法能顯示一定反應(yīng)的抗血清(或抗體)的最高稀釋倍數(shù)(或稀釋度的倒數(shù))。如終點稀釋度為1/100，則血清的效價(每1ml的血清中抗體效價)為100抗體單位的高低是衡量血清中抗體水平的一項檢測指標(biāo)。

第五十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日試管凝集實驗（tubeagglutinationtest）原理：大分子顆粒性抗原（細(xì)菌、紅細(xì)胞）與其相應(yīng)的抗體相結(jié)合，在適量的電解質(zhì)存在及一定的溫度下，經(jīng)過一定的時間可出現(xiàn)肉眼可見的凝聚團(tuán)塊。一般以標(biāo)準(zhǔn)抗原測得免疫血清或患者血清中抗體的效價。第六十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日不加免疫血清＋＋＋＋、＋＋＋、＋＋、＋：凝聚強度＋：出現(xiàn)凝聚－：無凝聚第六十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗體與多價抗原結(jié)合的濃度帶現(xiàn)象第六十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日抗體稀釋度應(yīng)根據(jù)：①抗體效價高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；②一般講，應(yīng)用的抗體稀釋度越大，溫育時間越長。③抗體中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時才能防止非特異性背景染色；抗體的稀釋主要是指第一抗體，因為第一抗體中特異性抗體合適的嘗試是關(guān)鍵,應(yīng)用高稀釋度第一抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應(yīng),減少或消除其中交叉抗體反應(yīng)。第六十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日三、常見免疫分析方法利用抗原與抗體特異性反應(yīng)的特性對抗原或抗體進(jìn)行量和質(zhì)的測定分析。這類分析方法具有特異、靈敏和快速的特點。免疫沉淀1.環(huán)狀沉淀實驗：是溶液中的沉淀反應(yīng)。在體外當(dāng)抗體與相應(yīng)抗原二者濃度比例恰當(dāng)時，會發(fā)生免疫沉淀。第六十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日免疫監(jiān)測免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分離蛋白第六十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日人絨毛膜促性腺激素（HCG）的免疫監(jiān)測尿液膠乳胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生大量的人絨毛膜促性腺激素，可通過孕婦血液循環(huán)而排泄到尿中第六十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日人絨毛膜促性腺激素的免疫監(jiān)測-陰性對照第六十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日Co-IP工作示意圖Co-immunoprecipitationbinding

wash

elutionYYYYY第六十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)分離蛋白第六十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第七十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日Identifyingspecificproteininteractionpartnersusingquantitativemassspectrometryandbeadproteomes第七十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日2.免疫雙擴(kuò)散抗原抗體在半透明的半固相介質(zhì)中進(jìn)行沉淀實驗。雙擴(kuò)散是在瓊脂板中抗原和抗體分別從相鄰的孔中向四周擴(kuò)散，在抗原孔和抗體孔之間二者比例合適的部位形成沉淀線。當(dāng)兩個抗原完全一致時，兩條沉淀線完全融合；如果兩個抗原無共同抗原決定簇時，沉淀線互不干擾；當(dāng)兩個抗原只是部分抗原決定簇相同，還有其他不同的抗原決定簇，則沉淀線在后者一方形成突出的小刺第七十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日3.免疫電泳利用蛋白質(zhì)在凝膠中電泳遷移率不同能被分離開來的特點與免疫擴(kuò)散結(jié)合一起進(jìn)行分析的方法。第七十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日1、血清免疫電泳:雙擴(kuò)散第七十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第七十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日2、火箭電泳：為加速度的單向免疫擴(kuò)散(抗原擴(kuò)散,抗體不擴(kuò)散)與電泳結(jié)合的一種方法在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標(biāo)本后，將抗原置陰極端，抗原泳向陽極，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭?？贵w濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標(biāo)本中的抗原含量。第七十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日常用于標(biāo)記抗原的放射性同位素有3H、125I、131I、14C等。3H可以置換有機化合物中的氫，不影響原有化學(xué)性質(zhì)，且半衰期長和能量低，便于防護(hù)。125I的敏感度約比14C大3900倍。又因為125I有合適的半衰期，低能量的γ射線易于標(biāo)記，標(biāo)記物。

標(biāo)記方法簡便，多肽、蛋白質(zhì)與小分子半抗原均可進(jìn)行碘標(biāo)記。一些不能直接用碘標(biāo)記的半抗原，通過接上一個酪氨酸亦可用碘標(biāo)記之。第七十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日氯胺T直接標(biāo)記法。氯胺T是一種氧化劑。在偏堿溶液中（pH7.5），氯胺T將125I的I－氧化為I+，I+取代蛋白質(zhì)酪氨酸苯環(huán)的氫，形成二碘酪氨酸。第七十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日發(fā)光免疫分析用發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記抗體。根據(jù)發(fā)光物的來源不同,有化學(xué)發(fā)光(chemiluminessence)和生物發(fā)光(bioluminescence)：化學(xué)發(fā)光供能反應(yīng)為一般化學(xué)反應(yīng)。指某種物質(zhì)分子吸收化學(xué)能而產(chǎn)生的光輻射。例如化學(xué)發(fā)光劑如熒光醇（luminol）發(fā)生高能化學(xué)反應(yīng)，形成處于電子激發(fā)態(tài)的分子，當(dāng)回到基態(tài)時，伴隨光子的釋放，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。第七十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日用于標(biāo)記的酶的種類:堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase)b-半乳糖苷酶(b-galactosidase)第八十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日廣泛使用,因酶促反應(yīng)使測定的結(jié)果被放大,反應(yīng)靈敏度高b.間接法:用酶標(biāo)第二抗體來檢查第一抗體是否與抗原結(jié)合,避免了用酶標(biāo)記每一種抗原或抗體的復(fù)雜過程。a.直接法:用酶標(biāo)第一抗體來檢查第一抗體是否與抗原結(jié)合。酶聯(lián)免疫分析法第八十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日生物發(fā)光是指生物體發(fā)光或生物體提取物在實驗室中發(fā)光的現(xiàn)象。它不依賴于有機體對光的吸收，而是一種特殊類型的化學(xué)發(fā)光，化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿男蕩缀鯙?00%。也是氧化發(fā)光的一種。生物發(fā)光的一般機制是：由細(xì)胞合成的化學(xué)物質(zhì)，在酶的作用下，使化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能：蟲熒素（luciferin）在蟲熒酶（lucifase）的催化下，有ATP，Mg2＋及O2存在時，發(fā)生瞬時發(fā)光反應(yīng)。

第八十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日PrincipleofWesternblottingwithEnhancedChemiluminescence(ECL)detectionsystem免疫學(xué)在生物學(xué)中的應(yīng)用第八十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第八十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第八十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第八十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第八十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第八十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第八十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第九十頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第九十一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第九十二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第九十三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日Indirectdetectionmethod第九十四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日化學(xué)發(fā)光(chemiluminescent)原理發(fā)光液A和B分別是Luminol和過氧化氫，在辣根過氧化物酶（HRP）的催化作用下,Luminol與過氧化氫反應(yīng)生成一種過氧化物，過氧化物不穩(wěn)定隨即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體,當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會產(chǎn)生熒光。在發(fā)光過程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP沒降解失活,是可以重復(fù)加發(fā)光液的。但HRP作為一種蛋白酶,在室溫放置時間過長,是會降解的；同時在發(fā)光過程中有什么物質(zhì)(比如顯影液)污染了膜的話,也有可能滅活膜上的HRP。第九十五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日LumigenPS3:化學(xué)發(fā)光檢測中與辣根過氧化物酶結(jié)合的底物

,producesamoreintenselightemissionoflingerduration第九十六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第九十七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第九十八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第九十九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日樣品1樣品2第一百頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第一百零一頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第一百零二頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日電泳遷移率：在特定介質(zhì)中單位電場強度的帶電顆粒電泳移動速度。電泳遷移率與顆粒所帶電荷量成正比，與顆粒的半徑和介質(zhì)黏度成反比。實際工作中常用相對電泳遷移率，即兩種帶電顆粒在同一介質(zhì)、同一電場中泳動距離之比。一般情況下電泳中蛋白質(zhì)分子量對數(shù)與遷移率呈線性關(guān)系。第一百零三頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日問題單克隆抗體是如何制備的？什么是免疫共沉淀？Western雜交試驗？第一百零四頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日(熒光醇)(過氧酸,-O-O-)第一百零五頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日放射免疫分析：第一百零六頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日免疫熒光分析:將熒光化合物標(biāo)記抗體。需要激發(fā)，才能發(fā)出熒光。第一百零七頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第一百零八頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日第一百零九頁，共一百二十一頁，編輯于2023年，星期日IRDyenearinfraredfluorescentdyesaresettingnewstandardsforproteinandcellularassays,microscopy,andinvivomolecularimaging.Thesedyeshaveexcellentwatersolubility,nearinfrared(700-800nm)emissionwavelengthswhereautofluorescenceislow,andminimalnon-specificbinding.UseIRDyeinfrareddyesforlabelingnucleicacids,a