青霉素發(fā)酵生產工藝演示文稿

青霉素發(fā)酵生產工藝演示文稿當前第1頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素簡介

發(fā)現

化學結構理化性質抗菌作用和臨床應用青霉素發(fā)酵生產工藝

菌種發(fā)酵工藝流程培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)控制提取精制2當前第2頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素的發(fā)現1928年，英國細菌學家Fleming發(fā)現污染在培養(yǎng)葡萄球菌的雙蝶上的一株霉菌能殺死周圍的葡萄球菌。他將此霉菌分離純化后得到的菌株鑒定為青霉，并將這菌產生的抗生物質命名為青霉素。3當前第3頁\共有49頁\編于星期四\13點1940年，英國Florey和Chain進一步研究此菌，并從培養(yǎng)液中制出了干燥的青霉素制品。經實驗和臨床試驗證明，它毒性很小，并對一些革蘭氏陽性菌所引起的許多疾病有卓越療效。4當前第4頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素類抗生素青霉素(Penicillin)又稱盤尼西林，是人類發(fā)現的第一種抗生素，也是目前全球銷量最大的抗生素。青霉素是β-內酰胺類抗生素中的一類，是分子中含有青霉烷、能破壞細菌細胞壁并在細菌細胞的系列生長期起殺菌作用的一類抗生素。一種高效、低毒、臨床應用廣泛的重要抗生素。它的研制成功大大增強了人類抵抗細菌性感染的能力，帶動了抗生素家族的誕生。5當前第5頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素的化學結構青霉素是β-內酰胺類抗生素中的一類，具有β-內酰胺環(huán)結構；是分子中含有青霉素母核（青霉烷）的多種化合物的總稱。分子結構球棍模型β-內酰胺環(huán)6-氨基青霉烷酸6當前第6頁\共有49頁\編于星期四\13點

青霉素類抗生素

青霉素G青霉素X青霉素V霉菌屬的青霉菌發(fā)酵液中提取，天然青霉素有多種G、V、N、K、X、其中PG的活性最高、產量最高。

青霉素N青霉素K7當前第7頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素理化性質一元有機酸一般的羧酸Pka4-6PGPka2.7（解離常數）8當前第8頁\共有49頁\編于星期四\13點不穩(wěn)定性β–內酰胺環(huán)是青霉素中最不穩(wěn)定的部分，原因：1、四元環(huán)和五元環(huán)稠合，環(huán)的張力大2、兩個環(huán)不在同一平面，青霉素結構中β-內酰胺環(huán)中羰基和氮原子的孤對電子不能共軛，易受到親核性或親電性試劑的進攻，使β-內酰胺環(huán)破裂。β-內酰胺環(huán)對水、光、熱、酸、堿、酶、醇、胺不穩(wěn)定，β-環(huán)開裂、活性降低或消失9當前第9頁\共有49頁\編于星期四\13點對堿或酶(β-內酰胺酶)不穩(wěn)定，水解10當前第10頁\共有49頁\編于星期四\13點對稀酸不穩(wěn)定，發(fā)生重排；PH=4青霉二酸青霉醛青霉胺-CO2對羰基親核反應分解重排11當前第11頁\共有49頁\編于星期四\13點對強酸不穩(wěn)定，發(fā)生重排PH=2orHgCl2青霉酸+青霉醛酸△青霉醛aβ-環(huán)開裂,-CO2abb12當前第12頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素的理化性質青霉素本身為一元有機酸，可與鉀、鈉、鎂、鈣、鋁和銨等化合成鹽類。青霉素游離酸易溶于醇、酸、醚、酯等一般有機溶劑，但在碳氫化合物中溶解度很??；在水中溶解度也很小，且會迅速喪失抗菌能力。青霉素金屬鹽類極易溶于水；幾乎不溶于乙醚、氯仿、醋酸戊酯，略溶于乙醇、丁醇、酮類和醋酸乙酯。青霉素鈉鹽、銨鹽、鉀鹽吸濕性依次減小，鈉鹽比鉀鹽更不易保存。青霉素游離酸不耐熱，一般保存于冰箱中；但青霉素鹽的結晶純品，穩(wěn)定性很好，在干燥條件下可于室溫保存數年。青霉素鉀鹽結晶，150℃加熱1.5h效價無影響，因此結晶青霉素可干熱滅菌。青霉素臨床上一般用其鈉鹽、鉀鹽或普魯卡因鹽，增強水溶性。粉針劑，有效期2年臨床用粉針劑，現用現配13當前第13頁\共有49頁\編于星期四\13點抗菌作用和臨床應用青霉素主要抑制革蘭氏陽性細菌，但對某些革蘭氏陰性細菌，螺旋體及放線菌也有較強的抗菌作用。青霉素的抗菌作用與抑制細胞壁的合成有關。青霉素臨床上用于治療葡萄球菌傳染癥如腦膜炎、化膿炎、骨髓炎等，溶血性鏈球菌傳染癥如腹膜炎、產褥熱，以及肺炎、淋病、梅毒和炭疽等。14當前第14頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素的應用溶血性鏈球菌感染。肺炎鏈球菌感染。不產青霉素酶葡萄球菌感染。炭疽。破傷風、氣性球疽等梭狀芽孢桿菌感鉤端螺旋體病。流行性腦脊髓膜炎。放線菌病。淋病。除脆弱擬桿菌以外的許多厭氧菌感染。青霉素與氨基糖苷燈藥物聯合用于治療草綠色鏈球菌心內膜炎。15當前第15頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素發(fā)酵生產工藝16當前第16頁\共有49頁\編于星期四\13點17當前第17頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素制備的一般流程圖菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預處理及種子加濾提取及精制成品檢驗成品包裝前體發(fā)酵階段提取精制18當前第18頁\共有49頁\編于星期四\13點菌種目前國內青霉素生產菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，根據絲狀菌產生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產黃青霉素。19當前第19頁\共有49頁\編于星期四\13點菌種青霉素最初生產菌為音符型青霉菌，生產能力僅為幾十個單位，不能滿足工業(yè)生產需要。后來發(fā)現適合深層培養(yǎng)的新菌種——產黃青霉，生產能力100U/ml，經不斷誘變選育，目前平均生產能力66000-70000U/ml，國際最高生產能力已超100000U/ml。20當前第20頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素產生菌的生長過程分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒減少，小空孢大空孢自溶菌絲生長期青霉素分泌期菌絲自溶期21當前第21頁\共有49頁\編于星期四\13點1－4期為菌絲生長期，3期的菌體適宜為種子。

4－5期為生產期，生產能力最強，通過工程措施，延長此期，獲得高產。

在第六期到來之前結束發(fā)酵。22當前第22頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長、青霉素合成和菌體自溶三個階段。菌體生長階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產菌在合適的環(huán)境中經過短時間的適應，即開始發(fā)育、生長和繁殖，直至達到菌體的臨界濃度。青霉素合成階段：這個階段主要合成青霉素，青霉素的生產速率達到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個階段，菌體重量有所增加，但產生菌的呼吸強度一般無顯著變化。菌體自溶階段：這個階段菌體衰老，細胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產速率下降，氨基氮增加，PH上升。23當前第23頁\共有49頁\編于星期四\13點絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程

冷凍管（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）——斜面母瓶（25°C，孢子培養(yǎng)，7天）——大米孢子（26°C，種子培養(yǎng)56h）——一級種子培養(yǎng)液（27°C，種子培養(yǎng)，24h）——二級種子培養(yǎng)液（27~26°C,發(fā)酵,7天）——發(fā)酵液。24當前第24頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素發(fā)酵過程青霉素發(fā)酵時，青霉素生產菌在合適的培養(yǎng)基、PH、溫度和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進行生長并合成青霉素。發(fā)酵開始前，有關設備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無機鹽等）必須先經過滅菌，后接入種子。在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑，假如酸堿控制發(fā)酵液的PH，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補充碳源及氮源，或補進其他料液和前體等以促進青霉素的生產。25當前第25頁\共有49頁\編于星期四\13點青霉素的發(fā)酵發(fā)酵工藝控制：

1.基質濃度

2.培養(yǎng)基成分的控制

3.溫度

4.pH值、溶氧

5.菌絲狀態(tài)6.泡沫的控制26當前第26頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵工藝控制

1.基質濃度：

在發(fā)酵過程中，常常因為前期基質量濃度過高，對生物合成酶系產生阻遏或對菌絲生長產生抑制（如葡萄糖的阻遏和抑制,苯乙酸的生長抑制）,而后期基質濃度低限制了菌絲生長和產物合成。所以，在青霉素發(fā)酵中通常采用補料分批操作法，以維持一定的最適濃度。27當前第27頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵工藝控制2.培養(yǎng)基成分的控制:

A.碳源：發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖。

乳糖最為便宜，但因貨源較少，很多國家采用葡萄糖代替。但當葡萄糖濃度超過一定限度時，會過分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導致pH下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長和產物的合成。目前普遍采用淀粉的酶水解產物，葡萄糖化液流加，以降低成本。28當前第28頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵工藝控制B.氮源：

主要有機氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。

玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通氣及氧的傳遞，因而利用率較高。有機氮源還可以提供一部分有機磷，供菌體生長。無機氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。29當前第29頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵工藝控制C.無機鹽：碳酸鈣用來中和發(fā)酵過程中產生的雜酸，并控制發(fā)酵液的pH值為菌體提供營養(yǎng)的無機磷源一般采用磷酸二氫鉀。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。鐵離子對青霉素有毒害作用，應嚴格控制發(fā)酵液中鐵含量在30ug/mL以下?，F在還有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過程中鐵離子便逐漸進入發(fā)酵液；發(fā)酵時間愈長，則鐵離子愈多。鐵離子在50μg/ml以上便會影響青霉素的合成。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜。30當前第30頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵工藝控制D.前體：前體的加入是青霉素發(fā)酵的關鍵問題之一。添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借?；D移的作用，將苯乙酸轉入青霉素分子，提高青霉素G的生產強度。但苯乙酸對發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結合進青霉素成品。而月桂酸作為細菌營養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價格較貴。前體要在發(fā)酵開始20h后加入，并在整個發(fā)酵過程中控制在50μg/ml左右。前體用量大于0.1%時，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在0.1%為宜。31當前第31頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵工藝控制3.溫度：

青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別,但一般認為應在25°C左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產率,同時增加葡萄糖的維持消耗,降低葡萄糖至青霉素的轉化率。對菌絲生長和青霉素合成來說,最適溫度不是一樣的,一般前者略高于后者,故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的溫度，以縮短生長時間,到達生產階段后便適當降低溫度,以利于青霉素的合成。

32當前第32頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵工藝控制4.pH值、溶氧：

pH值：青霉素發(fā)酵的最適pH值一般認為在6.8～7.2左右,應盡量避免pH值超過7.0。因為青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定,容易加速其水解。溶氧:對于好氧的青霉素發(fā)酵來說,溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重要因素。當溶氧濃度降到30%飽和度以下時,青霉素產率急劇下降,低于10%飽和度時,則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高,說明菌絲生長不良或加糖率過低,造成呼吸強度下降,同樣影響生產能力的發(fā)揮。在罐的夾層或蛇管中需通冷卻水以維持一定罐溫。在整個發(fā)酵過程中，需不斷通無菌空氣和攪拌，以維持一定罐壓或溶氧。33當前第33頁\共有49頁\編于星期四\13點5.菌絲狀態(tài)：菌絲濃度：發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度,從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上達到平衡。菌絲生長速度：在葡萄糖限制生長的條件下，當比生長速率低于0.015h-1時，比生產速率與比生長速率成正比。因此,要在發(fā)酵過程中達到并維持最大比生產速率,必須使比生長速率不低0.015h-1。菌絲形態(tài)：青霉素產生菌分化主要呈絲狀生長和結球生長兩種形態(tài)。在絲狀菌發(fā)酵中,控制菌絲形態(tài)使其保持適當的分支和長度,并避免結球,是獲得高產的關鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中,使菌絲球保持適當大小和松緊,并盡量減少游離菌絲的含量,也是充分發(fā)揮其生產能力的關鍵素之一。34當前第34頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵工藝控制6.泡沫的控制：

在發(fā)酵過程中產生大量泡沫,可以用天然油脂,如豆油、玉米油等或用化學合成消泡劑“泡敵”來消泡。應當控制其用量并要少量多次加入,尤其在發(fā)酵前期不宜多用,否則會影響菌體的呼吸代謝。

加消沫劑控制泡沫，必要時還加入酸、堿以調節(jié)發(fā)酵液的pH。35當前第35頁\共有49頁\編于星期四\13點染菌處理

染菌是發(fā)酵工業(yè)長期以來不能徹底解決的問題，因此如何解決染菌問題就成了發(fā)酵工業(yè)的工作重點之一。要解決染菌問題首要問題就是要能檢測出是否染菌。

染菌通常通過三個途徑發(fā)現：無菌試驗，發(fā)酵液直接鏡檢，發(fā)酵液的生化分析。其中無菌試驗是判斷染菌的主要依據。

36當前第36頁\共有49頁\編于星期四\13點染菌的處理染菌在發(fā)酵過程的每個階段都可能發(fā)生，下面就各個不同的階段的染菌情況和處理辦法一一說明。

⒈種子培養(yǎng)期染菌

⒉發(fā)酵前期染菌

⒊發(fā)酵中期染菌

⒋發(fā)酵后期染菌

37當前第37頁\共有49頁\編于星期四\13點染菌的處理⒈種子培養(yǎng)期染菌

種子培養(yǎng)主要是生長繁殖菌體。此時菌體濃度低，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，因此容易染菌。種子培養(yǎng)期染菌，帶進發(fā)酵罐中的危害極大，應嚴格控制種子污染。當發(fā)現種子受污染后均應滅菌后棄去，并對種子罐、管道進行檢查和徹底滅菌。返回38當前第38頁\共有49頁\編于星期四\13點染菌的處理⒉發(fā)酵前期染菌

發(fā)酵前朗主要是菌體生長繁殖，代謝產物生成很少，染菌后雜菌容易繁殖，與生產菌爭奪營養(yǎng)成分和氧分，嚴重干擾生產菌的生長繁殖和產物的生成，因此要特別注意發(fā)酵前期的染菌。當發(fā)酵前期染菌時，由于營養(yǎng)成分消耗不多，能耗也不大，從經濟性的角度考慮應迅速重新滅菌，補充必要的營養(yǎng)成分，重新接種進行發(fā)酵。返回39當前第39頁\共有49頁\編于星期四\13點染菌的處理⒊發(fā)酵中期染菌

發(fā)酵中期染菌將嚴重干擾生產菌的代謝，影響產物的生成。如產酸，產泡沫，使菌體自溶，使發(fā)酵液變臭等。發(fā)酵中期染菌，由于營養(yǎng)成分大量消耗，一般挽救處理困難，危害性大，發(fā)酵中期染菌應做到早發(fā)現，早處理，通常做法是“倒罐”，即用一罐沒有染菌的發(fā)酵液與染菌的發(fā)酵液混合，使有害菌濃度下降，生產菌濃度提高進而重新成為優(yōu)勢生長菌群。顯然，倒罐必然造成物料消耗和操作費用的增加。

返回40當前第40頁\共有49頁\編于星期四\13點染菌的處理⒋發(fā)酵后期染菌

發(fā)酵后期產物積累較多，效價已經很高，營養(yǎng)物質接近耗盡，此時如染菌量不多，可繼續(xù)進行發(fā)酵，如嚴重污染也可提前放罐，停止發(fā)酵，這在經濟上往往是合算的。41當前第41頁\共有49頁\編于星期四\13點下游操作過濾萃取脫色結晶42當前第42頁\共有49頁\編于星期四\13點發(fā)酵液預處理青霉菌素發(fā)酵后，放罐，加少量絮凝劑沉淀蛋白，然后經真空轉鼓過濾或板框過濾（青霉菌絲較粗，過濾較容易），除掉菌絲體及部分蛋白，過濾收率一般在90%左右。青霉素易降解，發(fā)酵液及濾液應冷卻至10℃低溫保存，備后續(xù)提取精制。通常發(fā)酵液中青霉素濃度很低，僅0.1%~4.5%左右，而雜質濃度比青霉素的高幾