分子生物學期末復(fù)習資料

分子生物學發(fā)期末復(fù)習資料是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA,再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過程。這是所有有細胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。在某些病毒中的RNA自我復(fù)制（如煙草花葉病毒等）和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過程（某些致癌病毒）是對中心法則的補充。蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)（super-secondarystructure）是指在多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的二級結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)聚集體。也稱為基序（Motif）。結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域（domain）是指多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)或超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成三級結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū)，它是相對獨立的緊密球狀實體。單核苷酸多肽性基因組水平上由單個核苷酸的差異或變異產(chǎn)生的DNA多態(tài)性，是人類可遺傳的變異種最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。平均1kb就有1個，總數(shù)達3萬。順式作用元件某些能影響基因表達但不編碼蛋白質(zhì)和RNA的DNA序列，按照功能分第1頁共16頁為啟動子、增強子、負調(diào)控元件-沉默子。反式作用因子反式作用因子指能直接或間接地識別或結(jié)合在各順式作用元件8?12bp核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)，也稱序列特異性DNA結(jié)合蛋白(sequencespecificDNAbindingprotein,SDBP),有時也稱轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)。增強子是一段短的DNA序列，其中含有多個作用元件，可特異結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，增強基因的轉(zhuǎn)錄活性。一般位于轉(zhuǎn)錄起始點上游-1~-3bp處。沉默子為負性調(diào)控元件。是一段短的DNA序列，能與反式作用因子結(jié)合從而阻遏基因的轉(zhuǎn)錄活性。選擇性剪接高等真核細胞中，某個內(nèi)含子5的供點在特定條件下可與另一個內(nèi)含子3受點進行剪接，同時刪除這兩個內(nèi)含子及其中間的全部外顯子或內(nèi)含子，即一個外顯子或內(nèi)含子是否出現(xiàn)在成熟的mRNA中是可以選擇的，這種剪接方式稱為選擇性剪接。核酸雜交互補的核苷酸序列(DNA與DNA、DNA與RNA、RNA與RNA等)通過Watson-Crick堿基配對形成非共價鍵，從而形成穩(wěn)定的同源或異源第2頁共16頁雙鏈分子的過程，稱為核酸分子雜交技術(shù)，又稱核酸雜交。11、探針探針是一小段單鏈DNA或者RNA片段（大約是20到5bp），用于檢測與其互補的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為單鏈，隨后用放射性同位素（通常用磷-32）、熒光染料或者酶（如辣根過氧化物酶）標記成為探針。12、印跡技術(shù)印跡技術(shù)是指將待測核酸分子結(jié)合到一定固相支持物上的方法。13、載體載體（vector），指在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。三種最常用的載體是細菌質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。14、原癌基因原癌基因（proto-oncogene）是細胞內(nèi)與細胞增殖相關(guān)的基因，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高度保守。當原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強時，使細胞過度增殖，從而形成腫瘤。15、癌基因癌基因是指人類或其他動物細胞（以及致癌病毒）固有的一類基因。又稱轉(zhuǎn)化基因，它們一旦活化便能促使人或動物的正常細胞發(fā)生癌變。16、抑癌基因第3頁共16頁抑癌基因也稱為抗癌基因。正常細胞中存在基因，在被激活情況下它們具有抑制細胞增殖作用，但在一定情況下被抑制或丟失后可減弱甚至消除抑癌作用的基因。正常情況下它們對細胞的發(fā)育、生長和分化的調(diào)節(jié)起重要作用。17、基因診斷18、就是利用分子生物學技術(shù)，從DNA/RNA水平檢測基因的存在、分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達狀態(tài)，從而對疾病作出診斷。19、內(nèi)含子內(nèi)含子（intron）是結(jié)構(gòu)基因中的非編碼序列，往往與編碼序列呈間隔排列。當基因轉(zhuǎn)錄后，在mRNA的成熟過程中被剪切（splicing）。20、外顯子是結(jié)構(gòu)基因中的編碼序列，當基因轉(zhuǎn)錄后，mRNA在成熟過程中切去內(nèi)含子，外顯子才被拼接成完整的序列，成為成熟的mRNA作為指導蛋白質(zhì)合成的模板。21、斷裂基因真核生物編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因最突出的特點是其不連續(xù)性，被稱為斷裂基因。22、重疊基因同一段核酸序列能夠編碼2種或2種以上蛋白質(zhì)。重疊基因雖然共用一段核酸序列，但轉(zhuǎn)錄成的mRNA鏈的開放閱讀框（ORF）不同，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子大不相同。判斷題第4頁共16頁蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)（super-secondarystructure）是指在多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的二級結(jié)構(gòu)常常在空間折疊中靠近，彼此相互作用，形成規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)聚集體。也稱為基序（Motif）。p53抑癌基因（PS:沒有p35）p53抑癌基因是生物體內(nèi)一種抑制細胞轉(zhuǎn)變癌細胞的基因。細胞中本來就有致癌基因（oncogene）及抑癌基因的存在，只要一方產(chǎn)生病變而失去平衡，癌癥就可能會發(fā)生。人類p53基因定位于17號染色體p13,全長16-20kb,含有11個外顯子，轉(zhuǎn)錄2.8kb的mRNA,編碼蛋白質(zhì)為P53,是一種核內(nèi)磷酸化蛋白。p53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。過去一直把它當成一種癌基因，直至1989年才知道起癌基因作用的是突變的p53,后來證實野生型p53是一種抑癌基因。原癌基因原癌基因（proto-oncogene）是細胞內(nèi)與細胞增殖相關(guān)的基因，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高度保守。當原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強時，使細胞過度增殖，從而形成腫瘤。原癌基因功能相關(guān)腫瘤sis生長因子Erwing網(wǎng)瘤erb-B受體酪氨酸激酶，EGF受體星形細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌第5頁共16頁fms受體酪氨酸激酶，CSF-1受體髓性白血病rasG-蛋白肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、直腸癌src非受體酪氨酸激酶魯斯氏肉瘤Abl-1非受體酪氨酸激酶慢性髓性白血病rafMAPKKK，絲氨酸/蘇氨酸激酶腮腺腫瘤vav信號轉(zhuǎn)導連接蛋白白血病myc轉(zhuǎn)錄因子Burkitt淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病病毒基因組1、類型（1）雙鏈DNA多數(shù)動物病毒，如腺病毒、皰疹病毒、痘病毒，乙肝病毒等，環(huán)形、線形。（2）單鏈正股DNA序列與mRNA相同的為正股（+），與mRNA互補的為負股（一）（3）雙鏈RNA以負鏈RNA為模板轉(zhuǎn)錄出mRNA，如呼腸孤病毒及噬真菌體。（4）單鏈負股RNA（5）單鏈正股RNA：2、特點（1）大小相差較大（2）核酸的結(jié)構(gòu)不同（3）病毒基因組有連續(xù)的和不連續(xù)的第6頁共16頁編碼序列大于90%單倍體基因組(除逆轉(zhuǎn)錄病毒外)基因有連續(xù)的和間斷的相關(guān)基因叢集：病毒基因組核酸序列中功能相關(guān)的蛋白質(zhì)基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位，形成一個功能單位或轉(zhuǎn)錄單元?；蛑丿B：同一段核酸序列能夠編碼2種或2種以上蛋白質(zhì)。重疊基因雖然共用一段核酸序列，但轉(zhuǎn)錄成的mRNA鏈的開放閱讀框(ORF)不同，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子大不相同。(9)含有不規(guī)則結(jié)構(gòu)基因mRNA5z帽子和勺尾巴1.5端加帽和3端多聚腺苷酸化及意義5端加帽:真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA在轉(zhuǎn)錄后，在5端加上7-甲基鳥苷(m7GPPPmNp-)。意義:保護轉(zhuǎn)錄體mRNA不受5外切酶降解，增強mRNA的穩(wěn)定性，同時有利于mRNA從細胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運，促進mRNA與核糖體的結(jié)合(通過帽結(jié)合蛋白介導完成)。3端加尾：轉(zhuǎn)錄后在mRNA在3末端加上50?150個腺苷酸，即poly(A)尾。意義:保證mRNA在轉(zhuǎn)錄過程中不被降解。人類基因組有哪些圖譜1、遺傳圖譜(geneticmap)第7頁共16頁遺傳圖譜又稱遺傳連鎖圖(linkagemap)。是指基因或DNA標志在染色體上的相對位置與遺傳距離。遺傳距離用重組率來衡量。即通過計算兩個連鎖的遺傳標記在每次減數(shù)分裂中的重組概率，確定兩者的相對距離。其單位用厘摩(cM)表示。1厘摩表示每次減數(shù)分裂的重組頻率為1%。厘摩值越高表明遺傳標志物兩點之間距離越遠，值越低則兩點間距離越近。此基因定位屬遺傳學的研究范疇。2、物理圖譜即確定兩個遺傳標記之間的實際(絕對)距離。物理圖以一段已知核苷酸序列的片段STS序列為路標，以堿基對數(shù)目的多少為圖距表示，圖距基本單位是Mb、kb、bp。序列標簽位點(SequenceTaggedSites,STS)用來確定相連或重疊的DNA片段,近而確定片段在基因組的位置。首先，物理圖要獲得大量定位明確STS,其次，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建覆蓋每條染色體的大片段DNA的連續(xù)克隆系，為最終完成全序列的測定奠定基礎(chǔ)。3、序列圖譜是分別將各染色體全部堿基序列繪制的圖譜。包括轉(zhuǎn)錄序列和非轉(zhuǎn)錄序列。目前的策略是把龐大的基因組分成若干有路標的區(qū)域后，進行測序分析。將測出的每一個DNA片段按其染色體位置進行準確的排列，從而得到人類基因組DNA序列的全貌。測序方法有多種：全基因組的“鳥槍法”測序策略，cDNA測序，及BACDNA測序等。目前，我們可以從基因網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫中查到所有基因的序列。第8頁共16頁4、轉(zhuǎn)錄圖譜/表達圖譜是在人類基因組中鑒別出占據(jù)1-5%長度的全部結(jié)構(gòu)基因的位置、結(jié)構(gòu)與功能。以表達序列標簽(expressedsequencetag,EST)為位標繪制的圖譜。EST是一段cDNA片段。所有生物性狀和疾病都是由蛋白質(zhì)決定的，而所有蛋白質(zhì)都是mRNA依照遺傳密碼編碼的，若把mRNA通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(或稱作EST的部分cDNA片段)，就抓住了基因的轉(zhuǎn)錄部分。然后大規(guī)模測序，進行基因的分離、定位。因此，轉(zhuǎn)錄圖亦稱cDNA圖或“表達序列”圖。乳糖操縱子的調(diào)控模式1、乳糖操縱子的組成：大腸桿菌乳糖操縱子含Z、Y、A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個操縱序列O，—個啟動子P和一個調(diào)節(jié)基因I。2、阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時，I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖的三種酶；有乳糖存在時，乳糖作為誘導物誘導阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導開放合成分解乳糖的三種酶。所以，乳糖操縱子的這種調(diào)控機制為可誘導的負調(diào)控。3、CAP的正性調(diào)節(jié)：在啟動子上游有CAP結(jié)合位點，當大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時，cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使CAP發(fā)生變構(gòu)，CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動序列附近的CAP結(jié)合位點，激活RNA聚合酶活性，促進結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)第9頁共16頁節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對乳糖操縱子實行正調(diào)控，加速合成分解乳糖的三種酶。4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié):乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。調(diào)控區(qū)0-半乳糖昔酶Y：透酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶色氨酸操縱子的調(diào)控模式色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)基因（E、D、C、B、A）編碼的5種酶，在色氨酸合成代謝過程中發(fā)揮作用，結(jié)構(gòu)基因中還包括L基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是先導mRNA，調(diào)控元件有啟動子（P）和操縱基因（O）。色氨酸操縱子表達的調(diào)控有兩種方式，一種通過阻遏蛋白的負調(diào)控；另一種是通過衰減子作用（attenuation）。第1。頁共16頁珂謂蛋白二成體色敏酸操縱于的結(jié)構(gòu)及其調(diào)控方式衰減子對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控色氨酸操縱子的衰減子位于前導肽編碼基因中，離E基因上游約30?60個核苷酸。大腸桿菌在無色氨酸的環(huán)境下，前導肽編碼基因和5個結(jié)構(gòu)基因能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有6,7個核苷酸的全長多順反子mRNA，當細胞內(nèi)色氨酸增多時，E、D、C、B和A基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，但前導肽編碼基因轉(zhuǎn)錄出140個核苷酸mRNA引導序列并沒有減少，這部分轉(zhuǎn)錄稱為衰減子轉(zhuǎn)錄物。引導序列由一段14氨基酸前導肽編碼區(qū)和一個衰減子組成，前導肽編碼區(qū)起始部位有核蛋白體結(jié)合位點，AUG密碼子后面緊跟13個密碼子，第10、11為色氨酸密碼子。根據(jù)序列特點可將整個mRNA引導序列分為4區(qū)，可形成不同的堿基配對結(jié)構(gòu)；1區(qū)和2區(qū)互補時，3區(qū)和4區(qū)可以互補配對，形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)及隨后出現(xiàn)的8個U即構(gòu)成典型的不依賴P因子終止子；1區(qū)不能與2區(qū)互補時，2區(qū)即與3區(qū)互補，3區(qū)不再與4區(qū)互補。4個區(qū)域以何種形式配對取決于核蛋白體翻譯mRNA引導序列的速度，后者又受控于色氨酸的水平。色氨酸豐富時，核蛋白體可順利沿引導序列移動直至達最后一個第11頁共16頁密碼子UGA，合成完整的引導肽。UGA位于1區(qū)和2區(qū)之間，到達此處的核蛋白體占據(jù)2區(qū)，使3區(qū)不能與2區(qū)互補而與4區(qū)互補，形成終止子發(fā)夾結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶停止在衰減子部位。色氨酸缺乏時，核蛋白體因原料缺乏終止在1區(qū)Trp密碼子部位，2區(qū)無法與1區(qū)配對且在4區(qū)被轉(zhuǎn)錄出來之前與3區(qū)互補，致4區(qū)處于單鏈狀態(tài)，不能形成終止發(fā)夾，RNA聚合酶通過衰減子而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄。意義：這種機制可以保證充分地消耗色氨酸，使其合成維持在滿足需要的水平，防止色氨酸堆積和過多地消耗能量。同時，也使細菌能夠優(yōu)先將環(huán)境中的色氨酸消耗完，然后開始自身合成。雙脫氧法測序技術(shù)原理(一)基本原理末端終止法：在DNA合成反應(yīng)體系中，除含有正常脫氧核苷三磷酸底物外，還加入少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTPs)特殊底物，由于這種底物的5，-磷酸基團是正常的，能夠替代相對應(yīng)的脫氧核苷三磷酸而與引物延伸鏈的羥基連接，進入部分新合成鏈；但由于這種特殊底物不存在3，羥基末端，故下一個核苷酸底物不能通過5,-磷酸基團與之形成3，，5，-磷酸二酯鍵，從而導致DNA新鏈的延伸提前終止于這一“異常”核苷酸處，而摻入的雙脫氧核苷三磷酸則位于DNA延伸鏈的最末第1項共16頁端。(二)主要步驟單鏈DNA模板的制備。DNA模板與測序引物退火。摻入法標記反應(yīng)。延伸-終止反應(yīng)。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。放射自顯影。閱讀測序結(jié)果。三大雜交技術(shù)的原理及步驟(任選一個)一、核酸分子雜交的原理核酸分子雜交實質(zhì)上是雙鏈DNA或者具有二級結(jié)構(gòu)的RNA變性后，其具有互補序列的兩條單鏈的復(fù)性過程。變性(denaturation)復(fù)性(renaturation)雜交(hybridization)二、Southern印跡雜交(Southernblothybridization)具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則特異性地雜交形成雙鏈。制備基因組DNA用限制性內(nèi)切核酸酶消化基因組DNA第13頁共16頁瓊脂糖凝膠電泳分離DNA酶切片段凝膠預(yù)處理5.Southern印跡轉(zhuǎn)移標記核酸探針、探針與DNA片段雜交雜交結(jié)果顯示三、Northern印跡雜交(Northernblothybridization)指將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。用于mRNA定性和定量分析。Northern印跡轉(zhuǎn)移除了在樣品的制備、凝膠電泳分離及凝膠的處理步驟與Southern印跡轉(zhuǎn)移不同外，其他步驟與Southern印跡轉(zhuǎn)移基本一致。用堿法提取質(zhì)粒DNA的原理及步驟堿裂解法是提取質(zhì)粒的最常用也最有效的方法，是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異達到分離目的。原理：高pH使質(zhì)粒DNA和染色體DNA變性，同時沉淀蛋白質(zhì)。再將pH值調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA較小，很容易復(fù)性成雙鏈。而染色體DNA較大,纏結(jié)成網(wǎng)狀不溶物質(zhì)，從而可以通過離心除去。方法：依次加入下面三種溶液：溶液1：葡萄糖50mmol/L,EDTA1mmol/L,Tris-Cl25mmol/L,溶菌酶5mg/ml,pH8.0溶