分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠電泳

電泳基本原理電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。德厚行遠，因爾成道當前第1頁\共有39頁\編于星期五\17點電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術(shù)。德厚行遠，因爾成道當前第2頁\共有39頁\編于星期五\17點二、主要方法

有支持物的電泳技術(shù)：

1、紙上電泳

2、醋酸纖維薄膜電泳

3、薄層電泳

4、非凝膠性支持體區(qū)帶電泳（支持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)

5、凝膠支持體區(qū)帶電泳①淀粉液②聚丙烯酰胺凝膠③瓊脂糖凝膠

德厚行遠，因爾成道當前第3頁\共有39頁\編于星期五\17點

不用支持體的電泳技術(shù)：

1、Tiselius電泳

2、顯微電泳

3、等電點聚焦電泳技術(shù)

4、等速電泳技術(shù)

5、密度梯度電泳

德厚行遠，因爾成道當前第4頁\共有39頁\編于星期五\17點DNA電泳德厚行遠，因爾成道當前第5頁\共有39頁\編于星期五\17點DNA分子帶負電，向正電方向游泳德厚行遠，因爾成道當前第6頁\共有39頁\編于星期五\17點（一）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)在堿性緩沖液中DNA分子帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型瓊脂糖凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子可以分離長度為100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系德厚行遠，因爾成道當前第7頁\共有39頁\編于星期五\17點瓊脂糖Agarose瓊脂糖為鏈狀多糖

→繩狀瓊脂糖束→大網(wǎng)孔型Meltingat85℃andsolidifyingfrom32-40℃D-galactoseand3,6-anhydro-L-galactopyranose.德厚行遠，因爾成道當前第8頁\共有39頁\編于星期五\17點不同濃度瓊脂糖分離DNA分子的范圍瓊脂糖濃度（%）分離范圍（kb）

0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3德厚行遠，因爾成道當前第9頁\共有39頁\編于星期五\17點瓊脂糖濃度（%）分離范圍（kb）0.51.0～300.70.8～121.00.5～101.20.4～71.50.2～32.00.05～2德厚行遠，因爾成道當前第10頁\共有39頁\編于星期五\17點質(zhì)粒DNA分子有三種構(gòu)型，即CCCDNA、OCDNA和LDNA，這三種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的泳動率不同，因此電泳后呈三條帶，CCCDNA泳動最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNAEB：即溴化乙錠，它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測?？梢詸z測10ng的DNA注意：EB是一種誘變劑，操作時一定要注意安全，必須戴塑料或乳膠手套CCCDNALDNAOCDNA電泳方向德厚行遠，因爾成道當前第11頁\共有39頁\編于星期五\17點環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型1．當其兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)時，稱之為共價閉合環(huán)形DNA（cccDNA），這樣的DNA通常呈現(xiàn)超螺旋的SC構(gòu)型；2．如果兩條多核苷酸鏈中只有一條保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，另一條鏈出現(xiàn)有一至數(shù)個缺口時，稱之為開環(huán)DNA（ocDNA），此即OC構(gòu)型；3．若質(zhì)粒DNA經(jīng)過適當?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶切割之后，發(fā)生雙鏈斷裂形成線性分子（IDNA），通稱L構(gòu)型。德厚行遠，因爾成道當前第12頁\共有39頁\編于星期五\17點瓊脂糖凝膠中DNA的觀察溴化乙錠（EB）—DNA：紫外光下紅色熒光德厚行遠，因爾成道當前第13頁\共有39頁\編于星期五\17點瓊脂糖凝膠電泳主要實驗器材電泳儀電泳槽緩沖液瓊脂糖凝膠槽梳子取液器溴酚藍德厚行遠，因爾成道當前第14頁\共有39頁\編于星期五\17點電泳槽結(jié)構(gòu)德厚行遠，因爾成道當前第15頁\共有39頁\編于星期五\17點操作步驟瓊脂糖凝膠的制備：溶化，冷卻，EB凝膠板的制備：加梳子，倒膠樣品的制備：樣品+1/5體積溴酚藍加樣：加樣端為負極（黑）電泳：5V/cm觀察：紫外燈下觀察，照相德厚行遠，因爾成道當前第16頁\共有39頁\編于星期五\17點溶膠德厚行遠，因爾成道當前第17頁\共有39頁\編于星期五\17點準備膠槽德厚行遠，因爾成道當前第18頁\共有39頁\編于星期五\17點凝膠冷卻至50°C，加EB至終濃度0.5μg/ml德厚行遠，因爾成道當前第19頁\共有39頁\編于星期五\17點鋪膠德厚行遠，因爾成道當前第20頁\共有39頁\編于星期五\17點凝膠凝固后取出梳子德厚行遠，因爾成道當前第21頁\共有39頁\編于星期五\17點加緩沖液德厚行遠，因爾成道當前第22頁\共有39頁\編于星期五\17點準備樣品德厚行遠，因爾成道當前第23頁\共有39頁\編于星期五\17點點樣德厚行遠，因爾成道當前第24頁\共有39頁\編于星期五\17點電泳德厚行遠，因爾成道當前第25頁\共有39頁\編于星期五\17點注意觀察溴酚藍染液的遷移德厚行遠，因爾成道當前第26頁\共有39頁\編于星期五\17點紫外燈下觀察電泳結(jié)果德厚行遠，因爾成道當前第27頁\共有39頁\編于星期五\17點照相德厚行遠，因爾成道當前第28頁\共有39頁\編于星期五\17點（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨和加速劑TEMED的作用下聚合而成可以分離小片段（5～500bp）DNA分子聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用：蛋白質(zhì)分子的分離鑒定蛋白質(zhì)分子量的測定核酸的分析核酸序列測定德厚行遠，因爾成道當前第29頁\共有39頁\編于星期五\17點德厚行遠，因爾成道當前第30頁\共有39頁\編于星期五\17點

迷你垂直型電泳槽德厚行遠，因爾成道當前第31頁\共有39頁\編于星期五\17點DNA序列分析電泳槽德厚行遠，因爾成道當前第32頁\共有39頁\編于星期五\17點中型雙垂直電泳槽德厚行遠，因爾成道當前第33頁\共有39頁\編于星期五\17點蛋白電泳德厚行遠，因爾成道當前第34頁\共有39頁\編于星期五\17點（三）醋酸纖維素薄膜電泳

醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，又因為膜的親水性比較小，它所容納的緩沖液也少，電泳時電流的大部分由樣品傳導(dǎo)，所以分離速度快，電泳時間短，樣品用量少，5μg的蛋白質(zhì)可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。德厚行遠，因爾成道當前第35頁\共有39頁\編于星期五\17點（四）等電聚焦電泳技術(shù)

等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分?，F(xiàn)在它經(jīng)常與SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳構(gòu)成二維電泳中的第一向，主要用于分離蛋白質(zhì)。德厚行遠，因爾成道當前第36頁\共有39頁\編于星期五\17點IEF的基本原理

在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。德厚行遠，因爾成道當前第37頁\共有39頁\編于星期五\17點德厚行遠，因爾成道當前第38頁\共有39頁\編于星期五\1