免疫共沉淀研究生實(shí)驗(yàn)課

背景據(jù)估計(jì)，人體中大約總共可產(chǎn)生500,000種蛋白，而單個(gè)細(xì)胞可以產(chǎn)生10,000種。在這些蛋白中，80%不是以獨(dú)立的方式存在的，而是存在于一個(gè)蛋白復(fù)合體中。蛋白-蛋白的相互作用包含在一個(gè)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中，我們形象地稱之為通過節(jié)點(diǎn)（nodes）連接的樞紐（hubs）。蛋白的相互作用當(dāng)前第1頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)StandardTechniques Glutathione-S-TransferaseFusionProteins AffinityTags TandemAffinityPurification(TAP)Tags Strep-TagIII QuantitativeProteomics ChemicalCrosslinking Two-hybridYeast Phage-display

UniversalVerificationofInteractionTechniques Co-Immunoprecipitation ConfocalMicroscopy

BiophysicalVerificationofInteractionTechniques FluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET) GFP-ProteinProximityImagingMicroscopy(GFP-PRIM) MassSpectroscopy(MS) AtomicForceMicroscopy(AFM) SurfacePlasmonResonance(SPR)當(dāng)前第2頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握免疫共沉淀的原理及操作方法，了解免疫共沉淀結(jié)果分析。了解與免疫共沉淀相關(guān)的實(shí)驗(yàn)及進(jìn)展當(dāng)前第3頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。金標(biāo)準(zhǔn)

用途：測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。概念及用途當(dāng)前第4頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)bindingwashelutionYYYYY當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來。實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)前第5頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)當(dāng)前第6頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于直徑為6cm的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)大約90%以上融合后，倒掉培養(yǎng)液，PBS洗3次；加入1mlLysisBuffer（20mMTris,150mMNaCl,1mMEDTA,1mMEGTA,1%TritonX-100,1mMβ-Glycerolphosphate,1mMNa3VO4,Cocktailproteinase，pH7.5），冰上放置30min，裂解細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)步驟當(dāng)前第7頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)采用溫和的裂解條件，不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或TritonX-100)。每種細(xì)胞的裂解條件不一樣，通過經(jīng)驗(yàn)確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS)。為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Na3VO4作用為保護(hù)磷酸化的蛋白不會被磷酸酶還原。因此在做磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)需添加。當(dāng)前第8頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管中，4℃轉(zhuǎn)鼓搖15min，14000g4℃離心15min；吸取上清液到新EP管中，每管加1μg對照兔IgG，同時(shí)加入ProteinAagarose，4℃轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)30min，4℃10000g離心5min；

preclear及其作用

一抗和相應(yīng)來源的normalmouse,rat,rabbitorgoatIgG中有相同或相似的成分(如無關(guān)IgG),用一抗相應(yīng)來源的IgG與蛋白裂解液和proteinA－agarose可以去除一抗中無關(guān)IgG對蛋白裂解液中物質(zhì)的非特異吸附,二是可以去除蛋白液中與proteinA－agarose非特異結(jié)合的物質(zhì)。做preclear的IgG是不針對特異性抗原的。瓊脂糖珠的選擇

SEPHAROSE是注冊商品名,本身是agarose做的凝膠。

當(dāng)前第9頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)轉(zhuǎn)移上清液至一新管中，將每管總蛋白定量至500-2000(250-1000)μg，用lysisBuffer將體積補(bǔ)齊至600-800μl。加入AKT兔抗人多克隆抗體10μl，4℃轉(zhuǎn)鼓過夜(10min)；孵育液體積的控制：考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖液太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。加入35μlProteinAagarose，4℃轉(zhuǎn)鼓轉(zhuǎn)2h(10min)

；1000g4℃離心5min，PBS洗3次，加入40μl2×SDSSampleBuffer（125mMTris?ClpH6.8,4%SDS,20%Glycerol,100mMDTT,0.02%溴酚藍(lán)）沸水浴中煮沸5min；WesternBlot檢測樣品，剩余樣品-20℃保存。當(dāng)前第10頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)抗體的選擇：1.使用明確的抗體：實(shí)驗(yàn)最需要注意的就是抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免疫細(xì)胞化學(xué)染色能結(jié)合未必能用在IP反應(yīng)。仔細(xì)檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題，確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發(fā)生；2.使用對照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗兔多克隆抗體：正常兔IgG3.抗體用量的控制：1-4μg（通常用2μg）4.確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中，而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來確定。當(dāng)前第11頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)相互作用的蛋白都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。當(dāng)前第12頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)缺點(diǎn)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；如用westernblot檢驗(yàn)，必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，若預(yù)測不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果（但如果結(jié)合質(zhì)譜檢測就可以分析所有的結(jié)合蛋白的種類）。當(dāng)前第13頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)通過質(zhì)譜確定捕獲的蛋白當(dāng)前第14頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)結(jié)果分析鹽離子濃度影響coIP結(jié)果

很多蛋白復(fù)合體對鹽濃度敏感，但敏感性有強(qiáng)弱之別。通常來說，真實(shí)存在著的蛋白復(fù)合體能耐受生理鹽（0.15M）或更高濃度，即在生理鹽濃度下不會解體。具體如，某種CDK和Cyclin其牢固程度能耐受以上的高鹽而不解體。因此，了解一個(gè)蛋白復(fù)合體對鹽濃度的耐受，既是一個(gè)幫助判斷蛋白復(fù)合體是否真實(shí)存在的一個(gè)重要依據(jù)，更是一個(gè)非常重要的生化數(shù)據(jù)；對某些體外生化反應(yīng)的蛋白原料的純化制備也是很重要的輔助依據(jù)。在生理鹽或更低鹽濃度下進(jìn)行coIP可能增加假陽性幾率—很多蛋白間非特異性的黏粘被記錄下來。通常選擇做細(xì)胞裂解。純化蛋白通常選取0.6M以上進(jìn)行IP。當(dāng)前第15頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)2.過表達(dá)

血清中豐富的BSA可以被任意抗體識別（其實(shí)也是一種相互作用），同理高豐度的兩種或多種蛋白人為拼湊到一起，也可以非特異性的黏粘或者發(fā)生弱的相互作用。3.不添加NP40一類表面活性劑，削弱對非特異性結(jié)合的拮抗

NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效拮抗非特異性的蛋白相互作用，提高coIP的特異性。通常IP體系中NP40含量0.2-0.5%。NP40在0.5-1.0%時(shí)，染色體很容易析出，造成樣品過粘而需要超聲。當(dāng)前第16頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)4.超聲和凍融的影響很多市售或自制的裂解液過于溫和，需要考慮采用機(jī)械或者超聲等手段提高裂解效率（超聲要慎用，可能破壞弱的相互作用）。但是，有些時(shí)候裂解液的凍融又可能影響某些弱的相互作用，所以不太建議凍融裂解液——即最好裂解液制備好后立即進(jìn)行coIP。如果證實(shí)凍融無影響可考慮將蛋白樣品保存-80度待用。5.Tag的影響

His-tagged主要用于純化蛋白。用His-tagged蛋白進(jìn)行coIP存在潛在的隱患。因?yàn)楹芏嗟鞍讜懈缓琱istidine的domain，遇到效價(jià)非常好的抗體會使很多內(nèi)源性的蛋白都被該抗體識別。造成coIP的假象。當(dāng)前第17頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)

TAPtag不能用于分析鈣調(diào)信號通路。TAPtag實(shí)際上從成本角度和Histag差不多，洗脫試劑價(jià)格低廉，因此可用于質(zhì)譜分析，能獲取最全面的相互作用的信息。然而由于其中包含鈣調(diào)蛋白和蛋白A的相互作用domain，天然會結(jié)合鈣信號相關(guān)蛋白，從而干擾或掩蓋靶蛋白與鈣信號蛋白之間的相互作用，有一定的應(yīng)用局限。

Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然會有天然的干擾，應(yīng)用略有局限；相較后兩者是人工合成專門用于tagged蛋白（有相應(yīng)的專利，因此目前無論抗體或交聯(lián)好的beads價(jià)格都非常昂貴），因此干擾最小、最常用。如需進(jìn)一步細(xì)致區(qū)分，a-Flag效價(jià)比a-HA略高，因此更適合IP。當(dāng)前第18頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)tag的位置。將tag構(gòu)建到蛋白的N端還是C端，也是一個(gè)潛在的能夠影響coIP結(jié)果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信號肽，如果將tag構(gòu)建到N端，則外分泌時(shí)會被信號肽酶連同信號肽一起切除；所以這時(shí)必須構(gòu)建在C端。再如，多數(shù)蛋白的C端是疏水區(qū)，有的時(shí)候?qū)ag構(gòu)建在C端會影響蛋白原來的空間結(jié)構(gòu)，如恰好C端同時(shí)是相互作用的結(jié)構(gòu)域，某些時(shí)候還可能被遮蔽，從而干擾相互作用。因此，通常構(gòu)建質(zhì)粒的時(shí)候是N端、C端tagged同時(shí)分別構(gòu)建，以備萬一。當(dāng)前第19頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)更高效的方法使用Dynabeads?蛋白A或G進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)

Dynabeads

磁珠vs瓊脂糖珠分離純化蛋白質(zhì)注重品質(zhì)和特異性，而非數(shù)量。此時(shí)，磁珠是最佳的選擇。當(dāng)前第20頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)常見問題及解決策略目的蛋白分子量比預(yù)期大？至少兩種可能性是存在的

一個(gè)是在所謂“搖”的過程中，目的蛋白被修飾。正常的細(xì)胞中有很多departments，每個(gè)department都有特定蛋白的存在，比如線粒體蛋白、溶酶體蛋白、葉綠體蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白、核蛋白；一旦細(xì)胞被勻漿化，各個(gè)departments就不存在了，每個(gè)蛋白都會與其他所有蛋白有接觸的機(jī)會，所以，發(fā)生一些unexpected修飾（或切割）是正?，F(xiàn)象。

再有一種可能是B蛋白只能結(jié)合被修飾的A蛋白，從而在免疫沉淀的過程中富集了這種被修飾的A蛋白。當(dāng)前第21頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)2.

背景深條帶多，特異性差。最簡單的改進(jìn)方法：換特異性高的抗體，最好用單抗。如果不換抗體，還可以改進(jìn)共沉淀的條件，例如孵育的溫度，孵育的時(shí)間，抗體的濃度等等。另外，曝光的時(shí)候，時(shí)間不要太長，可以降低背景。也可能是抗體濃度過高，可以降低抗體作用濃度。3.沒有檢測到與目的蛋白相互作用的蛋白或者檢測得到的信號太弱

裂解液中的去垢劑濃度過高或者配方過于劇烈：降低去垢劑濃度或者更換去垢劑種類（按作用劇烈程度來區(qū)分:SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS）

受蛋白的亞細(xì)胞定位影響：重新選擇裂解液配方以釋放目的蛋白

蛋白之間的相互作用太弱或者不太穩(wěn)定：選擇親和力更高的抗體以捕獲更多的目的蛋白從而捕獲更多的相互作用蛋白;過表達(dá)提高目的蛋白的含量；選擇目的蛋白或者相互作用蛋白含量高的樣品進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第22頁\共有29頁\編于星期五\2點(diǎn)相關(guān)技術(shù)體外免疫共沉淀（TnT試劑盒，promega）免疫沉淀（immunoprecipitation）

利用抗體可與抗原