海洋微藻的細(xì)胞操作

海洋微藻的細(xì)胞操作第一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日海洋微藻細(xì)胞操作的意義微藻因為其結(jié)構(gòu)簡單和易于培養(yǎng)等特點，成為原生質(zhì)體制備、再生和增殖、細(xì)胞融合以及細(xì)胞工程等細(xì)胞操作和基因工程研究的極好材料。絕大多數(shù)海洋微藻有細(xì)胞壁，其細(xì)胞操作收到了限制。因此，海洋微藻細(xì)胞操作的第一步是去除細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體。第二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日通過原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞操作和遺傳飾變的要點概況成為：（1）原生質(zhì)體的分離（2）原生質(zhì)體的培養(yǎng)及再生（3）細(xì)胞融合（4）把外源遺傳物質(zhì)、細(xì)胞器或微生物導(dǎo)入原生質(zhì)體第三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日海洋微藻細(xì)胞操作研究的歷史與現(xiàn)狀50年代末期，F(xiàn)uhs利用絲狀體藍(lán)藻制備得到原生質(zhì)體。70年代其他種類的原生質(zhì)體的制備也獲得成功。這些微藻原生質(zhì)體分離成功為海藻原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)研究提供了寶貴的基礎(chǔ)資料，為80年代大型海藻原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)工作的活躍開展奠定了寶貴的基礎(chǔ)。從80年代開始，微藻原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)以及細(xì)胞融合的研究逐漸向大型海藻轉(zhuǎn)移，這種研究重點的轉(zhuǎn)移似乎可以說明，大型海藻的遺傳飾變更加困難和復(fù)雜，在理論和實踐上有更多的問題需要解決。第四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日微藻細(xì)胞操作的有關(guān)問題微藻細(xì)胞操作的材料應(yīng)具備下列特征

1.生長狀態(tài)良好、健康

2.形態(tài)簡單均一

3.細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組成簡單易于原生質(zhì)體化

4.原生質(zhì)體能穩(wěn)定的再生和增殖

5.可在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖選擇

6.具有可供選擇的標(biāo)記（如抗生素的耐性）第五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日細(xì)胞操作的全過程應(yīng)保持在細(xì)胞的正常生理狀態(tài)，這在再生和增殖階段更為重要。需要注意的要點是：

1.處理前細(xì)胞狀態(tài)的控制

2.處理過程細(xì)胞狀態(tài)的控制，特別是外界條件如：溫度、光照、鹽度、PH、和處理時間等的控制

3.滲透壓調(diào)節(jié)劑的種類和濃度

4.原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定性

5、原生質(zhì)體的純化方法及純度

6、不同研究目的的不同原生質(zhì)體化程度。第六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.2海洋微藻的分離和純化技術(shù)在以海洋為材料的的各種研究中，常常要求培養(yǎng)物是單種和無菌的。為實現(xiàn)這一目的，合適的分離和純化技術(shù)是必需的。第七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.2.1藻的采集藻體的最初來源一般是采自自然環(huán)境。浮游藻可用浮游生物網(wǎng)采集和濃縮。附著的和絲狀體種類可以從礁石、葉狀體或其他大型藻類上刮取。當(dāng)藻種采集后，必需在最短的時間內(nèi)進(jìn)行觀察、鑒定和分離，應(yīng)為有一些重要的微藻種類在幾小時后可能開始解體。第八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.2.2分離方法1.毛細(xì)滴管復(fù)洗技術(shù)選直徑較細(xì)（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時，快速拉成口徑極細(xì)的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認(rèn)真仔細(xì)地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達(dá)到純分離的目的。如不成功，應(yīng)反復(fù)幾次，直至達(dá)到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個培養(yǎng)皿中接20～30個個體。從分離出少量細(xì)胞擴大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長時期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（1000～5000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純藻種。第九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日2.噴霧技術(shù)

相當(dāng)簡捷的技術(shù)，可用來分離和純化采集的藻樣。用離心洗滌法洗8~9ml藻樣，最后離心一次后，在離心管中留2ml上清液，其余倒掉。將毛細(xì)管通過棉塞插到離心管的底部，將離心管固定于滴定臺上。將壓縮空氣通過一滴管吹出并從離心管中的毛細(xì)管的頂端通過。離心管中的懸浮液會被吸出并形成細(xì)霧。將一滅菌的瓊脂培養(yǎng)基平板迅速通過細(xì)霧，距離大約為25cm左右。蓋好培養(yǎng)皿，至于合適的光照和溫度下培養(yǎng)。經(jīng)幾天生長后，可用毛細(xì)滴管將沒有細(xì)菌和真菌污染的單細(xì)胞或藻落挑出移入新鮮培養(yǎng)液中。第十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日3.瓊脂板技術(shù)

將采集的少量藻與已冷卻的但未凝固的含有營養(yǎng)物的瓊脂培養(yǎng)液混合，攪勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固。在適宜條件下經(jīng)幾天培養(yǎng)后，將形成的藻落切下，再移入新鮮培養(yǎng)液中培養(yǎng)。第十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.2.3純化方法1.離心洗滌技術(shù)

細(xì)菌和海藻一般可以較容易地通過離心和在無菌培養(yǎng)液中洗滌分開來。2.抗生素技術(shù)

用混合的抗生素可以成功地純化海藻培養(yǎng)物，這一方法特別適用于那些較大的不適于離心洗滌的藻類。3.紫外光處理技術(shù)紫外光可用來處理純化海洋微藻，因為大多數(shù)藻類對紫外線處理的致死效應(yīng)比細(xì)菌的抗性強。第十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日4.過濾技術(shù)膜濾可用來分離絲狀體海藻和細(xì)菌。5.純化程度的檢測

經(jīng)純化的培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行檢測以確定培養(yǎng)物是否真正逮到了無菌，用一般性培養(yǎng)基做檢測在不同溫度和光暗條件下進(jìn)行。第十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.3培養(yǎng)基成分及作用第十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日海水是海藻生長的理想介質(zhì)，自然海水可以滿足孢子萌發(fā)和不同藻種的分離等研究的需要，但在多數(shù)的培養(yǎng)中，用幾種植物培養(yǎng)物如N、P、和Fe等加富海水是必要的。合成培養(yǎng)基的主要目的是提供簡化的和確定的培養(yǎng)基。第十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日在配制培養(yǎng)基的過程中，一個主要的問題是海水培養(yǎng)基高壓滅菌時會產(chǎn)生沉淀。目前，解決這一問題的途徑主要有兩個：

1.加入某種適宜且無毒的PH緩沖劑和螯合物，同時降低培養(yǎng)基的鹽度，特別是鈣的濃度。

2.用濾膜過濾的方法滅菌。第十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日用于藻類培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方有很多種，每種配方主要適用于一定藻種，這里介紹幾種比較常用的。水生4號和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍(lán)藻可用朱氏10號或水生105號無氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍(lán)藻）；硅藻可用朱氏10號和水生硅1號培養(yǎng)基；另外還有海產(chǎn)綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基配方見下表。第十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內(nèi)加入1.5％瓊脂。第十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日培養(yǎng)基的配制及其原則第二十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日一、培養(yǎng)基母液的配制(一)母液配制的目的

1.方便配制其它的培養(yǎng)基：

2.保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時的快速移取。

(二)母液配制方法

1.單配法將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)。

2.混配法將幾類營養(yǎng)成分按配方中的用量擴大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可用amg/L表示，即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液aml。

第二十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日（三）母液配制的藥品與器材1、藥品：配制藻類培養(yǎng)基所需的藥品、蒸餾水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL等。2、器材：各類天平、燒杯、容量瓶、量筒、母液瓶、標(biāo)簽、冰箱等。第二十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日（四）母液配制（以MS培養(yǎng)基為例）

無機大量母液鐵鹽母液第二十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日配制MS培養(yǎng)基時母液的計算第二十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日二、培養(yǎng)基的配制

海藻的培養(yǎng)基一般由三部分組成：大量元素、微量元素和維生素。配置步驟：無菌海水（600-700ml）

母液的量取溶解

液

調(diào)PH定容（1L）分裝1.量取前先檢查母液并搖動2.量母液前,移液管和量筒應(yīng)潤洗第二十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日三、配制藻類培養(yǎng)基的原則

1、要有適量氮源（除固氮藍(lán)藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機氮等。

2、應(yīng)包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等

3、要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH。

4、要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。

5、要滿足某些藻類特殊需要，如藍(lán)藻需鉬，硅藻需硅。

6、要添加適量生長物質(zhì)如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。

第二十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基。其具有較高的無機鹽濃度，能夠保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)還能加速愈傷組織的生長。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存和消毒等過程中，即使有些成分略有出入，也不會影響離子間的平衡。MS固體培養(yǎng)基可用于誘導(dǎo)愈傷組織，也可用于胚、莖段、莖尖及花藥的培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時能獲得明顯的成功。MS培養(yǎng)基的無機養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細(xì)胞在營養(yǎng)上和生理上的需要。因此，一般情況下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機附加成分。和其它培養(yǎng)基的基本成分相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它的顯著特點。第二十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.4海洋微藻的生長測量和培養(yǎng)技術(shù)第二十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.4.1培養(yǎng)類型

海洋微藻的培養(yǎng)類型按時間長短分為：1.長期保存培養(yǎng)2.短期保存培養(yǎng)第二十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日類型長期保存培養(yǎng)短期保存培養(yǎng)定義

指長時間保持一特定的海藻以備將來的使用的培養(yǎng)，能在長達(dá)3個月甚至1年的時間里保持藻的活力

指藻體材料用于實驗前的較短時間的培養(yǎng)實驗用法

一般不宜直接用于實驗

可以直接用于實驗培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：如蛋白胨的Bold營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,用于綠藻的長期保存培養(yǎng)獲得正常微藻較低濃度培養(yǎng)基加速生長較高濃度培養(yǎng)基缺點（1）營養(yǎng)物必須是無菌的（2）某些藻在瓊脂培養(yǎng)基上不能生長

不能長期保存第三十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.4.2生長測定

1.分裂速率的計算

生長規(guī)律：慢——塊——慢

生長指標(biāo)：細(xì)胞數(shù)目適宜條件下，當(dāng)生長速度達(dá)恒定時（指數(shù)生長期），細(xì)胞增加的速度與原來細(xì)胞數(shù)目之間有：第三十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日表示在和時測得的細(xì)胞數(shù)。若用以2為底的對數(shù)來計算生長常數(shù)，則和這時k的意義為每天分裂的次數(shù)K（分裂次數(shù)/d）=Ke/ln2生長常數(shù)也可以用細(xì)胞加倍時間DT表示：DT=1/K=ln2/Ke第三十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日2.細(xì)胞計數(shù)方法1）血球計數(shù)板計數(shù)法

血球計數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四條下凹的槽,構(gòu)成三個平臺.中間的平臺較寬,其中間又被一短橫槽隔為兩半,每半邊上面,刻有一個方格網(wǎng).方格網(wǎng)上刻有9個大方格,其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室,供微生物計數(shù)用.這一大方格的長和寬各為1mm,深度為0.1mm,其體積為0.1mm3.計數(shù)室通常有兩種規(guī)格.一種是大方格內(nèi)分為16中格,每一中格又分為25小格;另一種是大方格內(nèi)分為25中格,每一中格又分為16小格.但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造;它們都有一個共同的特點,即每一大方格都是由16×25=25×16=400個小方格組成,見圖.第三十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日計數(shù)方法：用酒精擦洗計數(shù)板取一滴藻液滴在蓋玻片一側(cè)邊緣，使它沿著蓋玻片和計數(shù)板間的縫隙滲入計數(shù)室計數(shù)

1ml細(xì)胞數(shù)=1個大方格（0.1ul）細(xì)胞數(shù)×10×1000第三十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日2)光密度法

原理：分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。方法:用分光光度計測得各濃度藻類的光度值，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，光度值為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞數(shù)和光度值的對應(yīng)曲線。利用這一曲線，在測得樣品的光度值后，可以查得樣品的細(xì)胞數(shù)。

優(yōu)點：計數(shù)快速方便第三十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.4.1培養(yǎng)方法1.分批培養(yǎng)2.連續(xù)培養(yǎng)3.同步培養(yǎng)第三十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日1.分批培養(yǎng)

分批培養(yǎng)是指在一個密閉系統(tǒng)內(nèi)投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后，接入少量微藻種進(jìn)行培養(yǎng)，使微藻生長繁殖，在特定條件下完成一個生長周期的培養(yǎng)方法。是最簡單和普遍采用的方法。單胞藻的生長可分為：生長延緩期：細(xì)胞剛開始適應(yīng)環(huán)境，所以生長并不旺盛，生長曲線基本呈平線狀指數(shù)生長期：細(xì)胞適應(yīng)了環(huán)境，生長旺盛，生長速度極快，細(xì)胞數(shù)量呈倍數(shù)增長，生長曲線陡然上升靜止期：因培養(yǎng)基營養(yǎng)物有限，而細(xì)胞此時數(shù)量已達(dá)很多，相互間競爭，所以死亡的細(xì)胞數(shù)和新生的細(xì)胞數(shù)持平，生長曲線再次呈平線。第三十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日2.連續(xù)培養(yǎng)

指在一個限定的系統(tǒng)中，通過不斷加入新鮮的營養(yǎng)液，在生長速度和稀釋速度間建立一種平衡的關(guān)系，使培養(yǎng)液細(xì)胞濃度保持一定的培養(yǎng)方法。分為：（1）半連續(xù)培養(yǎng)：定期定量加入營養(yǎng)液，定期定量取出培養(yǎng)物。（2）全連續(xù)培養(yǎng)：不斷加入營養(yǎng)液的同時營養(yǎng)液又不斷流出。第三十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日3.同步培養(yǎng)采取某種措施（變換光暗周期，溫度和營養(yǎng)條件），使培養(yǎng)液中的藻類處于細(xì)胞周期中同一時期的培養(yǎng)方法。優(yōu)點：每一周期均可得到細(xì)胞數(shù)目、干物質(zhì)和細(xì)胞組成一致的材料同步培養(yǎng)的方法有誘導(dǎo)法和選擇法兩種。(一)誘導(dǎo)法

控制環(huán)境條件。誘導(dǎo)法就是采用物理、化學(xué)因子使微藻細(xì)胞生長進(jìn)行到某個階段而停下來，使先到達(dá)該階段的微藻細(xì)胞個體能進(jìn)人下一生長階段，待全部群體細(xì)胞都到達(dá)該生長階段后，再除去該因子，使全部群體細(xì)胞同時進(jìn)人下—個生長階段，以達(dá)到誘導(dǎo)微藻細(xì)胞同步生長的目的。（二）選擇法：用密度梯度離心或微孔濾膜，分離剛分裂的小細(xì)胞（體積和重量大致相等），然后再培養(yǎng)即可。第三十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.5原生質(zhì)體分離技術(shù)第四十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日本節(jié)要點：原生質(zhì)體與原生質(zhì)球檢測細(xì)胞壁存在的方法海藻原生質(zhì)體的制備方法原生質(zhì)體分離方法第四十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日一.原生質(zhì)體與原生質(zhì)球

根據(jù)藻類細(xì)胞脫壁程度的不同，將脫壁后的藻細(xì)胞分為原生質(zhì)體和和原生質(zhì)球。原生質(zhì)體：是指質(zhì)膜外的細(xì)胞壁和包被層全部除去而保持其余細(xì)胞組分的任何基因型的藻細(xì)胞。原生質(zhì)球是指細(xì)胞壁被全部或部分除去，仍保持質(zhì)膜外包被層的含全部細(xì)胞內(nèi)組分的部分第四十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日原生質(zhì)體與原生質(zhì)球的區(qū)別：

原生質(zhì)球：細(xì)胞壁完全或部分去除，包被原生質(zhì)球：細(xì)胞壁和包被層全部去除層完整保留。第四十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日原生質(zhì)體的特征：（1）無細(xì)胞壁障礙，可對膜、細(xì)胞器進(jìn)行基礎(chǔ)研究，同時可進(jìn)行遺傳操作。（2）具有全能性，能在人工條件控制下，進(jìn)行大量，快速繁殖。（3）可誘導(dǎo)融合，形成雜種細(xì)胞，為體細(xì)胞雜交提供實驗材料。由于質(zhì)膜外的包被層存在與否尚無標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，故原生質(zhì)體與原生質(zhì)球間的差別常被忽略。第四十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日二.檢測細(xì)胞壁存在的方法電子顯微鏡細(xì)胞壁染色技術(shù)處理后的細(xì)胞對滲透脅迫的敏感性第四十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日三.海藻原生質(zhì)體的制備方法海藻原生質(zhì)體的制備方法有機械法、微生物酶解法和酶法。機械法由于原生質(zhì)體得率太低，費時費力目前已很少使用。微生物酶解法：利用海洋細(xì)菌與藻體共培養(yǎng)過程中釋放出來的特殊酶，把海藻細(xì)胞壁分解掉從而得到原生質(zhì)體，這實際也是酶法。酶法：是特定的酶水解藻細(xì)胞壁，具有很強的專一性，同時酶解的條件十分溫和在細(xì)胞能夠承受的范圍之內(nèi)，所以對細(xì)胞無傷害，而且酶法效率高從而能獲得大量的有活力的原生質(zhì)體。目前普遍采用酶解的方法第四十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日（一）海洋微藻原生質(zhì)體分離實例藍(lán)藻（細(xì)胞壁含有粘肽），因而可以用溶菌酶消化的方法制備藍(lán)藻的原生質(zhì)體。綠藻（細(xì)胞壁含有纖維素），因而可用纖維素酶處理獲得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。硅藻、甲藻（細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊），可用去污劑或富含有機物但缺乏二價陽離子的溶液處理。紅藻和褐藻可用多糖酶消化細(xì)胞壁成分制備原生質(zhì)體。第四十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日（二）原生質(zhì)體制備的酶的來源微生物來源的海藻解壁酶。如從假單胞菌、產(chǎn)氣單胞菌、弧菌、埃氏交替單胞菌、的發(fā)酵液或培養(yǎng)液中提取粗酶，這種粗酶可用于分離原生質(zhì)體。微生物來源的海藻解壁酶有：瓊膠酶、褐藻酸酶、卡拉膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶!紫菜聚糖酶。動物來源的海藻解壁酶。如從海兔中提取褐藻酸酶、從疣鮑中提取鮑酶、從紫海膽提取海膽酶、韓寶芹等，研究了14種無脊椎動物消化酶液對海藻的解壁作用，最終從灘棲螺、石鱉和笠貝中制備出海螺酶、石鱉酶和笠貝酶，并研究了這3種酶對4種綠藻、7種紅藻和3種褐藻細(xì)胞的解壁作用。目前用于制備原生質(zhì)體的酶類，如纖維素酶、纖維素酶、果膠酶、崩潰酶、離析酶等，已有商品出售。第四十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日四.原生質(zhì)體分離方法第四十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第五十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第五十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第五十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日第五十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.6原生質(zhì)體的培養(yǎng)技術(shù)第五十四頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日一、原理植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁的一個為質(zhì)膜所包圍的的裸露細(xì)胞，用酶降解法脫去細(xì)胞壁的具有活力的原生質(zhì)體，其在合適的離體培養(yǎng)條件下具有繁殖，分化，再生成為完整植株的能力。而動物本身沒有細(xì)胞壁，自然不用去除細(xì)胞壁。第五十五頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日二、實驗儀器滅菌培養(yǎng)皿，血球計數(shù)板，顯微鏡，試管等。第五十六頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日三、培養(yǎng)基液體再生培養(yǎng)基瓊脂再生培養(yǎng)基第五十七頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日四、實驗過程稀釋→離心沉淀→棄上清液→洗滌→懸浮→計數(shù)→光照→取原生質(zhì)體→培養(yǎng)繁殖→再繁殖→再光照→藻落出現(xiàn)第五十八頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日具有活力的原生質(zhì)體在合適的培養(yǎng)條件下，3~6天就可以看見原生質(zhì)體的第一次分裂，2周左右可見到小細(xì)胞團(tuán)。要不斷加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，加入的時間和容量按實驗的情況而異，原則上要在原生質(zhì)體一次或幾次分裂后逐步再加入。

細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)長大成愈傷組織到植株分化的過程與其它組織培養(yǎng)的情況相同。第五十九頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日5.7細(xì)胞學(xué)技術(shù)第六十頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日一、破碎細(xì)胞的方法1.桿狀玻璃勻漿器法該勻漿器由一根端部表面磨砂的玻璃桿和一個內(nèi)壁磨砂的玻璃套管組成。使用時，先用鋒利的刀片把組織塊切碎，然后把碎塊加入套管中，用力使玻桿移動使組織細(xì)胞破碎。第六十一頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日2.高速組織搗碎機法使用時將4℃預(yù)冷的組織碎塊或細(xì)胞懸液加入搗碎機的梅花玻璃杯中，至杯體積的1/3即可蓋好玻璃杯蓋，固定好帶桿葉片刀，緩慢調(diào)整旋轉(zhuǎn)速度，一般開機數(shù)十秒后，組織細(xì)胞即可被高速旋轉(zhuǎn)的葉片刀破碎。但不宜時間過長，以防高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生熱而導(dǎo)致分離物中的活性物降解，用冷卻水降溫更好。第六十二頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日3.超聲波處理法

超聲波發(fā)生器能產(chǎn)生高強度的超聲信號，經(jīng)換能器傳送至與之接觸的溶液中，由聲波形成沖擊和振動而產(chǎn)生剪力，致使細(xì)胞破碎，動物組織肝、腎、胸腺、淋巴結(jié)、腹水細(xì)胞、紅細(xì)胞、體外培養(yǎng)的細(xì)胞均可在短時間內(nèi)破碎，因超聲時可產(chǎn)熱，應(yīng)注意冰浴冷卻，生物大分子如核酸和酶對超聲敏感，一般不宜采用。第六十三頁，共七十三頁，編輯于2023年，星期日4.化學(xué)裂介法在細(xì)胞懸液中加入Triton-100、NP-40、SDS，去氧膽酸鈉均可使細(xì)胞裂解，往往仍需機械去輔助，方可在短時間內(nèi)使細(xì)胞完全裂解