血液學第四章-第二節(jié)-第三節(jié)

血液學第四章--第二節(jié)--第三節(jié)第一頁，共77頁。細胞化學染色是細胞學和化學相結合而形成的一門科學。它以細胞形態(tài)學為基礎，結合運用化學反應的原理對血細胞內的各種化學物質（酶類、脂類、糖類、鐵、蛋白質、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。第二頁，共77頁。細胞化學染色臨床上用于：①輔助判斷急性白血病的細胞類型。因為不同細胞系列，其所含的化學物質成分、分布及含量各有不同，且隨著細胞的逐漸成熟，化學物質的含量等發(fā)生相應的變化。因此根據(jù)細胞化學染色結果的不同，可推斷所屬的細胞系列，如過氧化物酶染色、非特異性酯酶染色、特異性酯酶染色等。故臨床上急性白血病細胞類型的判斷需要結合細胞化學染色。②輔助血液系統(tǒng)等疾病的診斷和鑒別診斷。因為血細胞在病理情況下，其化學物質成分及含量會發(fā)生改變，以輔助疾病的診斷，如中性粒細胞堿性磷酸酶染色、鐵染色等。③觀察疾病療效和預后。④發(fā)病機制的探討。所以，細胞化學染色是診斷血液系統(tǒng)等疾病不可缺少的手段。第三頁，共77頁。不同細胞化學染色，染色步驟不同，但基本步驟為固定、顯示及復染。1、固定為了保持細胞結構及化學成分的不變，需對細胞進行固定。根據(jù)染色的成分不同，選擇合適的固定液，使細胞內的蛋白質、酶類、糖類等變成不溶性物質。固定的方法有物理法和化學法固定，臨床上常用的是化學法固定。物理法包括干燥和火焰固定，化學法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定，分為蒸氣固定和液體固定。第四頁，共77頁。（1）蒸氣固定：甲醛是一種常用的固定劑，甲醛極易揮發(fā)、氧化，故常用40%甲醛進行蒸氣固定。即在較封閉的玻璃器皿中加入40%甲醛，將涂片血膜朝下，固定5—10min。（2）液體固定：將涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中，也可用兩種或兩種以上固定液混合面成，如10%甲醛甲醇液、甲醛丙酮液等。第五頁，共77頁。2、顯示通過不同化學反應，最終形成穩(wěn)定的有色沉淀，顯示出被檢測的化學物質。常用的化學反應種類有以下幾種：（1）偶氮偶聯(lián)法：含萘酚的底物，在相應酶的作用下釋放出萘粉，萘粉與重氮鹽結合，偶氮偶聯(lián)形成有色沉演。重氮鹽的種類有堅牢藍紫醬GBC、堅牢藍B、六偶氮付品紅等。如中性粒細胞堿性磷酸酶染色、特異性酯酶染色、非特異性酯酶染色、酸性磷酸酶染色等。第六頁，共77頁。（2）聯(lián)苯胺法：粒細胞和單核細胞中的過氧化物酶，能分解過氧化氫釋放出新生態(tài)氧，使無色的聯(lián)苯胺氧化形成有色沉淀，如過氧化物酶染色。（3）普魯士藍反應：細胞內、外的鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成如亞鐵氰化鉀藍色沉淀，如鐵染色。（4）雪夫反應：過碘酸氧化細胞內糖類中的乙二醇基形成乙二醛基，醛基與雪夫試劑作用，使無色品紅形成紅色沉淀物，如過碘酸-雪夫反應。（5）金屬沉淀法：金屬及其化合物一般都有顏色，故形成的沉淀物為有色物質，如鈣鈷法中性粒細胞堿性磷酸酶染色。第七頁，共77頁。3、復染復染的目的在于使各種細胞能顯示出來以便于觀察。選擇復染液的顏色應與有色沉淀的顏色有明顯的對比度，既能使細胞結構顯示又能清楚地看出細胞化學染色結果。如鐵染色復染常用中性紅，過碘酸-雪夫反應常用甲基綠。對核著色效果較好的有中性紅、甲基綠、蘇木精、核固紅、沙黃等，使?jié){著色較好的有伊紅、剛果紅、光綠等。復染后，首先要通過顯微鏡觀察染色是否成功（如過氧化物酶染色、碘酸、雪夫反應等可觀察中性成熟粒細胞是否呈強陽性），然后觀察相應細胞的染色結果并報告結果，結果的報告一般包括陽性率、積分或陽性分布情況。第八頁，共77頁。細胞化學染色的種類有很多，下面介紹過氧化物酶染色、蘇丹黑染色、中性粒細胞堿性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色、鐵染色及酯酶染色。酯酶有多種，根據(jù)PH不同分為酸性、中性和堿性酯酶；根據(jù)酯酶特異性高低分為特異性酯酶和非特異性酯酶。非特異性酯酶包括酸性非特異性酯酶（即酸性a-醋酸蔡酚酯酶）、堿性非特異性酯酶（即a-丁酸蔡酚酯酶）和中性非特異性酯酶，后者包括a-醋酸萘酚酯酶、醋酸AS-D萘酚酯酶等。下面逐項介紹各種細胞化學染色。第九頁，共77頁。一、過氧化物酶染色

[原理]過氧化物酶(peroxidase,POX)染色方法有Washburn法、四甲基聯(lián)苯胺法和改良的Pereira染色法等。前者曾是最為常用的方法，但由于其底物聯(lián)苯胺具有致癌性，故現(xiàn)常用后兩者，下面分別介紹這兩種方法的原理。四甲基聯(lián)苯胺法粒細胞和部分單核細胞的溶酶體顆粒中含有過氧化物酶，POX能分解H2O2而釋放出新生氧，使四甲基聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，后者與亞硝基鐵氰化鈉結合，再進一步氧化形成穩(wěn)定的藍色物質，沉淀于酶活性的細胞質內。改良的Pereira染色法粒細胞和部分單核細胞中POX能分解H2O2而釋放出新生氧，使碘化鉀氧化生成碘，碘再與煌焦油藍作用形成藍綠色沉淀，定位于酶活性的細胞質內。第十頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]

1、粒細胞系統(tǒng)分化差的原粒細胞為陰性，分化好的原粒細胞至中性成熟粒細胞均呈陽性；且隨著細胞的成熟，陽性反應的程度逐漸增強。中性分葉核粒細胞為強陽性反應，但衰老的粒細胞陽性程度減弱甚至呈陰性；嗜酸性粒細胞陽性最強，其陽性顆粒粗大、有折光性；嗜堿性粒細胞為陰性。2、單核細胞系統(tǒng)大多數(shù)單核細胞系統(tǒng)的細胞呈陰性或弱陽性，陽性顆粒少而細小。3、其他細胞淋巴細胞系統(tǒng)、紅細胞系統(tǒng)及巨核細胞系統(tǒng)的細胞均呈陰性，漿細胞、組織細胞也呈陰性，吞噬細胞有的呈陽性。第十一頁，共77頁。[臨床評價]POX染色是臨床上輔助判斷急性白血病細胞類型首選、最重要的細胞化學染色。但在觀察要辨認的細胞POX染色結果前，首先要注意觀察成熟粒細胞是否呈強陽性，以判斷染色是否成功。第十二頁，共77頁。1、幫助鑒別急性白血病的類型（1）急性粒細胞白血病，白血病性原始粒細胞可呈陽性反應，陽性顆粒一般較多，較粗大，常呈局限性分布，但陰性時也不能排除本??；急性淋巴細胞白血病時，原始淋巴細胞和幼稚淋巴細胞均呈陰性反應，但可有少許陽性細胞，此系殘留的原粒細胞，故FAB分型規(guī)定急性淋巴細胞白血病其陽性率<3%，急性單核細胞白血病時，白血病原始單核細胞呈陰性反應，有時雖少數(shù)可呈弱陽性反應，但陽性顆粒少而細小，常彌散分布。第十三頁，共77頁。2）小型原始粒細胞和原始淋巴細胞不易區(qū)別，如果小型原始細胞呈過氧化物酶陽性反應，可確定為小型原始粒細胞。（3）急性早幼粒細胞白血病有時需與急性單核細胞白血病鑒別，如果白血病細胞呈過氧化物酶強陽性反應，應確定為急性早幼粒細胞白血病。（4）急性單核細胞白血病有時需與組織細胞白血病和惡性組織細胞病相鑒別，異常組織細胞的過氧化物酶呈陰性反應，而白血病性幼單核細胞和單核細胞呈弱陽性反應。第十四頁，共77頁。2、成熟中性粒細胞過氧化物酶活性的變化（1）活性增高：可見于再生障礙性貧血、感染（特別是化膿性細菌感染）、急性淋巴細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病。（2）活性減低：可見于急性粒細胞白血病、慢性粒細胞白血病、急性單核細胞白血病、骨髓增生異常綜合征、放射病及退化性中性粒細胞。第十五頁，共77頁。二、蘇丹黑染色

[原理]蘇丹黑（SudanblackB,SBB）是一種脂溶性重氮染料，能溶解于細胞內的含脂結構（如中性脂肪、磷脂、糖脂和類固醇）中，而使脂類物質顯示出來，呈棕黑色或深黑色。脂類物質在粒細胞中豐富，單核細胞中也有少量。[正常血細胞的染色反應]蘇丹黑陽性反應的細胞類型、反應強度與POX基本一致。第十六頁，共77頁。1、粒細胞系統(tǒng)分化差的原粒細胞為陰性，分化好的原粒細胞至中性成熟粒細胞均為陽性，且隨著細胞的成熟陽性程度逐漸增強。2、單核細胞系統(tǒng)呈陰性或弱陽性。3、其他細胞淋巴細胞系統(tǒng)、紅細胞系統(tǒng)及巨核細胞系統(tǒng)的細胞均呈陰性，漿細胞、組織細胞也呈陰性，吞噬細胞有的呈陽性。第十七頁，共77頁。[臨床評價]本染色臨床意義與POX染色基本相似，兩者是同一類細胞化學染色，但POX染色的特異性高于SBB染色（極少數(shù)急性淋巴細胞白血病SBB染色可陽性），而SBB染色的敏感性高于POX染色（急性粒細胞白血病POX染色陰性者其SBB染色可陽性），并且SBB染色較繁瑣。所以臨床上常首選POX染色，當POX染色陰性者可再加作SBB染色。SBB染色可用陳舊的涂片，而POX染色要求涂片新鮮。第十八頁，共77頁。三、中性粒細胞堿性磷酸酶染色

[原理]中性粒細胞堿性磷酸酶（neutrophilicalkalinephosphatase,NAP）染色的方法有Gomori鈣-鈷法和Kaplow偶氮偶聯(lián)法，因為鈣-鈷法操作較為繁瑣且所需時間長，而偶氮偶聯(lián)法的試劑盒操作方便，染色時間短，故目前國內常用偶氮偶聯(lián)法。偶氮偶聯(lián)法成熟中性粒細胞堿性磷酸酶在PH9.6左右的堿性環(huán)境中，能水解基質液中的磷酸萘酚鈉底物，釋放出萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質酶活性所在之處。不同的底物與重氮鹽的組合不同，化學反應過程以a-醋酸萘酚鈉為例（圖4-1）。第十九頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]1、NAP主要存在于中性成熟粒細胞（包括中性桿狀核粒細胞和分葉核粒細胞），故呈陽性反應，其他細胞基本呈陰性。2、成熟中性細胞堿性磷酸酶積分值的計算：在油鏡下，計數(shù)100個成熟中性粒細胞（包括中性分葉核粒細胞和中性桿狀核粒細胞），分別記錄其分級情況（-）（+）（++）（+++）（++++）

，全部陽性反應的細胞之和陽性率，將所有的陽性反應細胞均以“+”級表示后，計算其總積分值。第二十頁，共77頁。第二十一頁，共77頁。[參考值]NAP的積分值為35-70分（各單位應建立本實驗室參考值）第二十二頁，共77頁。[臨床評價]臨床上NAP染色應用較廣泛，但由于每個觀察者的記分標準有所不同，易受主觀因素影響，因此參考值范圍較大，所以NAP積分明顯增高或明顯減低，其臨床意義較大，同時要排除生理影響。第二十三頁，共77頁。1、生理性變化（1）年齡變化：新生兒活性增加，以后下降。兒童各年齡大致相似，成人較兒童活性減低，老年期更低。（2）應激狀態(tài)下的變化：緊張、恐怖、激烈運動等NAP活性可增加。（3）月經(jīng)周期中的變化：經(jīng)前期增高、行經(jīng)后降低，經(jīng)后期恢復。第二十四頁，共77頁。（4）妊娠期的變化：妊娠2-3個月的NAP積分值輕度增高，以后逐月增高，分娩時達高峰，產后則恢復正常。第二十五頁，共77頁。2、病理性變化（1）NAP積分增加：見于細菌性感染、再障、某些骨髓增殖性疾?。ㄈ缏?、骨髓纖維化、真性紅細胞增多癥、原發(fā)性血小板增多癥）、急淋、慢淋、惡性淋巴瘤、骨髓轉移癌、腎上腺糖皮質激素及雄激素治療后。（2）NAP積分下降：慢粒（慢性期）、NPN、MDS、惡組等。第二十六頁，共77頁。3、疾病的鑒別（1）類白血病反應與慢粒：前者明顯增加，后者明顯下降且常為零分。（2）慢性粒細胞白血?。云冢┡c慢性中性粒細胞白血?。呵罢呙黠@下降，后者明顯增加（常在300分以上）。（3）細菌性感染與病毒性感染：前者明顯增加（尤其是化膿性感染），后者常無明顯變化。第二十七頁，共77頁。（4）再障與NPN；前者常增加，后者常下降。（5）急性白血病類型的鑒別：急粒常下降，急淋常增加，急單不一定。（6）惡性淋巴瘤與惡組：前者常增加，后者常下降。（7）惡組與反應性組織細胞增多癥：前者常下降，后者無明顯變化。第二十八頁，共77頁。（8）真性紅細胞增多癥與繼發(fā)性紅細胞增多癥：前者常增加，后者無明顯變化。（9）原發(fā)性PC增多癥與繼發(fā)性PC增多癥，前者常增加，后者無明顯變化。第二十九頁，共77頁。四、酸性磷酸酶染色（ACP）第三十頁，共77頁。五、過碘酸-雪夫反應

[原理]過碘酸是氧化劑，使含有乙二醇基（—CHOH-CHOH）的多糖類物質（糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白及糖脂等）氧化，形成雙醛基（——CHO-CHO）。醛基與雪夫試劑中的無色品紅結合，使無色的品紅變成紫紅色化合物，定位于含有多糖類的細胞內。過碘酸-雪夫反應（periodicacid-Schiffreaction,PAS）以前又稱為糖原染色。PAS化學反應過程見圖4-2。第三十一頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]

1、粒細胞系統(tǒng)分化差的原粒細胞為陰性，分化好的原粒細胞至中性分葉核粒細胞均呈陽性反應，并隨著細胞的成熟，陽性反應程度逐漸增強，陽性呈細顆粒、均勻紅色；嗜酸性粒細胞中的嗜酸性顆粒本身不著色，而顆粒之間的胞質呈紅色；嗜堿性粒細胞中的嗜堿性顆粒呈陽性，而顆粒之間的細胞不著色。2、紅細胞系統(tǒng)幼紅細胞及紅細胞均呈陰性。3、單核細胞系統(tǒng)分化差的原單細胞呈陰性，其他為陽性，絕大多數(shù)陽性呈細顆粒狀，有時分布于細胞邊緣的陽性顆粒較粗大。第三十二頁，共77頁。4、淋巴細胞系統(tǒng)大多數(shù)淋巴細胞系統(tǒng)的細胞呈陰性，少數(shù)淋巴細胞呈陽性（陽性率常小于0.20），陽性呈粗顆粒狀或塊狀。5、巨核細胞系統(tǒng)巨核細胞系統(tǒng)的細胞（包括血小板）呈陽性，陽性呈顆粒狀或塊狀。6、其他細胞漿細胞一般呈陰性，少數(shù)呈陽性，呈細顆粒狀；巨噬細胞可為陽性，呈細顆粒狀。第三十三頁，共77頁。[臨床評價]1、紅細胞系統(tǒng)疾病紅血病、紅白血病、骨髓增生異常綜合征中幼紅細胞可陽性（呈均勻紅色或塊狀），有時幼紅細胞陽性反應強且陽性率高，甚至紅細胞也呈陽性。在某些紅系良性疾病，如缺鐵性貧血、地中海貧血中幼紅細胞也可呈陽性，有時陽性率也較高；巨幼細胞貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血等中幼紅細胞常呈陰性，有時個別細胞可呈陽性。第三十四頁，共77頁。2、白細胞系統(tǒng)疾病

主要用于輔助鑒別急性白血病的細胞類型等作用，因為不同細胞類型的急性白血病其陽性反應可不同。急性淋巴細胞白血病時原淋及幼淋巴細胞的陽性率升高，呈粗顆粒狀或塊狀；急性粒細胞白血病時少數(shù)原粒細胞呈陽性，陽性呈細顆粒狀或均勻紅色；急性單核細胞白血病時原單及幼單細胞可呈陽性，陽性呈細顆粒狀、彌散分布，有時胞質邊緣處顆粒較粗大。慢性淋巴細胞白血病時淋巴細胞的陽性率增加，呈粗顆粒狀或塊狀；惡性淋巴瘤時淋巴瘤細胞陽性率高、陽性強，呈塊狀或粗顆粒狀。

第三十五頁，共77頁。3、其他細胞

戈謝細胞呈強陽性，尼曼-皮克細胞呈陰性或弱陽性；巨核細胞強陽性，Reed-Sternberg細胞陰性或弱陽性；骨髓轉移性腺癌細胞呈強陽性。

第三十六頁，共77頁。六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色[原理]血細胞內的氯乙酸AS-D萘酚酯酶（naphytholAS-Dchloroacetate-esterase,AS-DNCE）水解基質液中的氯乙酸AS-D萘酚，產生AS-D萘酚，進而與基質液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質內酶所在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢紫醬GBC，形成的有色沉淀為紅色。NAS-DCE幾乎僅出現(xiàn)在粒細胞、其特異性高，因此又稱為“粒細胞酯酶”“特異性酯酶”?；瘜W反應過程見圖4-3。第三十七頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]

1、粒細胞系統(tǒng)分化差的原粒細胞呈陰性，分化好的原粒細胞呈陽性，自早幼粒細胞至成熟中性粒細胞均呈陽性，但酶活性并不隨著細胞的成熟而增強。嗜酸性粒細胞呈陰性或弱陽性，嗜堿性粒細胞呈陽性。2、單核細胞系統(tǒng)絕大多數(shù)為陰性，僅個別單核細胞系統(tǒng)的細胞呈弱陽性。3、肥大細胞陽性。4、其他細胞如淋巴細胞、漿細胞、巨核細胞、幼紅細胞、血小板等均呈陰性。第三十八頁，共77頁。[臨床評價]AS-DNCE染色是粒系特異性的酯酶，主要用于輔助鑒別急性白血病細胞類型，是急性白血病的常規(guī)細胞化學染色。（1）急性粒細胞白血病：原粒細胞呈陽性或陰性，所以染色結果為陰性者不能排除急粒的可能性；（2）急性早幼粒細胞白血病：顆粒異常增多的早幼粒細胞呈強陽性；（3）急性單核細胞白血?。涸瓎渭坝讍渭毎麕缀蹙赎幮裕瑐€別細胞弱陽性；（4）急性粒、單細胞白血?。涸＜霸缬琢＜毎赎栃?，原單及幼單細胞呈陰性；（5）急性淋巴細胞白血病和急性巨核細胞白血?。喊籽〖毎赎幮?。第三十九頁，共77頁。七、a-醋酸萘酚酯酶染色[原理]血細胞內的a-醋酸萘酚酯酶（a-naphythyolacetateesterase,a-NAE）在PH中性的條件下水解基質液中的a-醋酸萘酚，釋放出a-萘酚，進而與基質液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質內酶所在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢藍B，形成的有色沉淀為棕黑色或灰黑色，化學反應過程見圖4-4。A-NAE存在于單核細胞、粒細胞和淋巴細胞中，故它是一種中性非特異性的酯酶。單核系細胞的陽性可被氟化鈉抑制，所以作a-NAE染色時，通常同時作氟化鈉抑制試驗。第四十頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]1、單核細胞系統(tǒng)分化差的原單細胞呈陰性，分化好的原單細胞呈陽性（常較強），幼稚及成熟的單核細胞也呈陽性，單核系細胞的陽性反應能被氟化鈉抑制。所謂抑制是指氟化鈉試驗的抑制率大于50%，抑制率的計算公式為：氟化鈉抑制率=(抑制前陽性率或陽性積分-抑制后陽性率或陽性積分/抑制前陽性率或陽性積分)×100%

第四十一頁，共77頁。2、粒細胞系統(tǒng)各期粒細胞陰性，有時少數(shù)粒細胞呈弱陽性，陽性反應不能被氟化鈉抑制。3、淋巴細胞系統(tǒng)各期淋巴細胞多數(shù)陰性，少數(shù)弱陽性，陽性反應不能被氟化鈉抑制。4、其他細胞巨核細胞和血小板呈陽性，陽性反應不能被氟化鈉抑制；幼紅細胞大多數(shù)陰性，少數(shù)呈弱陽性，陽性反應不能被氟化鈉抑制；將細胞呈陰性。[臨床評價]a-NAE染色的是一種非特異性酯酶染色。非特異性酯酶染色是急性白血病的常規(guī)細胞染色。第四十二頁，共77頁。1、主要用于輔助鑒別急性白血病細胞類型①急性單核細胞白血病，單核系細胞大多數(shù)呈陽性，陽性反應能被氟化鈉抑制；②急性粒細胞白血病，原粒細胞呈陰性或陽性，陽性反應不能被氟化鈉抑制；③急性早幼粒細胞白血病，早幼粒細胞呈強陽性，陽性反應不能被氟化鈉抑制；④急性淋巴細胞白血病，原始及幼稚淋巴細胞呈陰性或陽性，陽性反應不能被氟化鈉抑制。⑤急性粒-單細胞白血病，原粒細胞呈陰性至陽性，陽性反應不被氟化鈉抑制；原始及幼稚單核細胞呈陽性，單核系細胞陽性反應能被氟化鈉抑制。但有時單核系細胞或粒系細胞、淋系細胞陽性較強，因此加氟化鈉后的抑制情況難以判斷，且有時陽性細胞是由于假陽性所致。2、輔助診斷紅血病和紅白血病異常幼紅細胞可呈陽性，陽性反應不能被氟化鈉抑制。第四十三頁，共77頁。八、醋酸AS-D萘酚酯酶染色

[原理]血細胞內的醋酸AS-D萘酚酯酶（naphythyolAS-Dacetateesterase,AS-DNAE）在PH中性的條件下水解基質液醋酸AS-D萘酚，釋放出AS-D萘酚，進而與基質液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細胞質內酶所在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢藍BB，形成的有色沉淀為藍色，化學反應過程見圖4-5。A-NAE存在于單核細胞、粒細胞和淋巴細胞中，故它是一種中性非特異性的酯酶。單核系細胞的陽性可被氟化鈉抑制，所以作NAS-DAE染色時，通常同時作氟化鈉抑制試驗。第四十四頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]

1、粒細胞系統(tǒng)原粒細胞陰性或陽性，自早幼粒細胞至成熟中性粒細胞均為陽性，此反應不被氟化鈉抑制。2、單核細胞系統(tǒng)原單核細胞呈陰性或陽性，幼單核細胞和單核細胞均呈陽性，此反應能被氟化鈉抑制。3、淋巴細胞淋巴細胞陰性或弱陽性，此反應不被氟化鈉抑制。4、紅細胞系統(tǒng)早期幼紅細胞可呈陽性，隨著細胞的成熟陽性反應程度逐漸減弱，此反應不被氟化鈉抑制。5、巨核細胞系統(tǒng)巨核細胞和血小板均呈陽性。第四十五頁，共77頁。[臨床評價]臨床意義a-NAE染色，用以輔助鑒別急性白血病的細胞類型。①急性粒細胞白血病，原粒細胞可陽性，此反應不被氟化鈉抑制；②急性早幼粒細胞白血病，顆粒異常增多的早幼粒細胞呈強陽性，此反應不被氟化鈉抑制；③急性單核細胞白血病，單核系細胞陽性，此反應能被氟化鈉抑制；④急性粒單細胞白血病，部分白血病細胞呈陽性，其中部分陽性反應能被氟化鈉抑制而部分陽性反應不能被氟化鈉抑制；⑤急性淋巴細胞白血病，原幼淋巴細胞呈弱陽性或陽性，此反應不被氟化鈉抑制。第四十六頁，共77頁。九、a-丁酸萘酚酯酶染色[原理]血細胞內的a-丁酸萘酚酯酶(a-naphythyolbutyrateesterase,a-NBE)在PH堿性的條件下水解基質液中的a-丁酸萘酚，釋放出a-萘酚，后者與基質液中的重氮鹽偶聯(lián)形居不溶性的有色沉淀，定位于細胞質內酶所在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢紫醬GBC，形成的有色沉淀為紅色?；瘜W反應過程見圖4-6。A-NBE主要存在于單核細胞中，其陽性產物能被氟化鈉抑制，而其他細胞系列的陽性產物不能被氟化鈉抑制。第四十七頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]1、粒細胞系統(tǒng)各期粒細胞均呈陰性。2、單核細胞系統(tǒng)分化差的原單細胞呈陰性，分化好的原單細胞呈陽，幼稚及成熟的單核細胞呈陽性，陽性反應能被氟化鈉抑制。3、淋巴細胞系統(tǒng)外周血的T淋巴細胞、非T非B淋巴細胞可呈陽性，B淋巴細胞呈陰性。4、其他細胞巨核細胞、幼紅細胞、漿細胞呈陰性或弱陽性；組織細胞也可呈陽性，但不被氟化鈉抑制。第四十八頁，共77頁。[臨床評價]與a-NBE染色的臨床意義相同，敏感性不如a-NAE，而特異性較a-NAE高，是急性白血病常用的細胞化學染色。1、輔助鑒別急性白血病細胞類型①急性單核細胞白血病，單核系細胞大多數(shù)呈陽性，陽性反應能被氟化鈉抑制；②急性粒細胞白血病，原粒細胞一般呈陰性；③急性早幼粒細胞白血病，早幼粒細胞常呈陰性；④急性粒單細胞白血病，部分白血病細胞陽性，部分白血病細胞陰性；⑤急性淋巴細胞白血病，原始及幼稚淋巴細胞一般呈陰性。第四十九頁，共77頁。2、急性單核細胞白血病有地須與惡性組織細胞病相鑒別，異常組織細胞也可呈陽性，但陽性反應不能被氟化鈉抑制。

第五十頁，共77頁。十、酸性a-醋酸萘酚酯酶染色[原理]血細胞中的酸性a-醋酸萘酚酯酶（acida-naphythyolacetateesterase,ANAE）在PH弱酸性（PH5.8）的條件下，水解基質液中的a-醋酸萘酚，產生a-萘酚，萘酚再與六偶氮付品紅形成紅色沉淀，定位于胞質中酶活性處。第五十一頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]1、單核細胞系統(tǒng)單核系細胞常呈強陽性。2、淋巴細胞系統(tǒng)T淋巴細胞陽性，B淋巴細胞多數(shù)為陰性。3、其他細胞粒系細胞、紅系細胞、巨核系細胞含量較少。[臨床評價]ANAE染色臨床上主要用于鑒別T、B細胞，而目前淋巴細胞的分類常用流式細胞儀，所以ANAE染色應用較少。1、有助于鑒別T、B細胞成熟T細胞呈點狀顆粒或塊狀陽性，B細胞大多呈陰性，偶見稀疏、彌散的細小顆粒。2、有助于鑒別急性白血病類型急性T細胞白血病常呈點狀或塊狀陽性，急性粒細胞白血病常呈陰性或弱陽性，急性顆粒異常增多的早幼粒細胞白血病呈陽性較強（呈彌散分布），急性單核細胞白血病呈強陽性（呈彌散分布）。第五十二頁，共77頁。十一、酯酶雙染色在同一張涂片上進行兩種酯酶染色的方法稱為酯酶雙染色。一般采用一種特異性酯酶加一種非特異性酯酶染色，故常用的有a-醋酸萘酚酯酶與氯乙酸AS-D萘酚酯酶雙染色，a-丁酸萘酚酯酶與氯乙酸AS-D萘酚酯酶雙染色等。反應的原理基本上同各自的染色原理，但同一張涂片上的血細胞要分別在兩種不同的基質液中作用一定時間，最后復染、顯微鏡觀察。酯酶雙染色對診斷急性粒-單細胞白血病的診斷具有獨特的價值，即在同一張片中出現(xiàn)兩種酯酶染色陽性的細胞或同一種細胞同時出現(xiàn)兩種酯酶染色的陽性結果。第五十三頁，共77頁。從上述細胞化學染色可以看出，不同細胞系列的細胞，其各種細胞化學染色的結果不同，見表4-10。四種常見類型急性白血病細胞化學染色結果見表4-11，雖然不同的細胞化學染色在不同的細胞系列中表現(xiàn)各有不同，但有時會出現(xiàn)結果模棱兩可的現(xiàn)象，所以根據(jù)細胞形態(tài)學和細胞化學染色并不能對所有急性白血病細胞類型進行正確的判斷。第五十四頁，共77頁。十二、鐵染色

[原理]正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細胞中。骨髓中的鐵在酸性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位。鐵染色（ferricstain）化學反應過程如下：4Fe3++3K4[Fe(CN)6]酸性Fe4[fe(CN)6]3+12K+(含鐵物質）（亞鐵氰化鉀）（亞鐵氰化鐵）第五十五頁，共77頁。[正常血細胞的染色反應]骨髓中的貯存鐵分為細胞外鐵和細胞內鐵。細胞外鐵主要存在于骨髓小粒的巨噬細胞中，細胞內鐵是指存在于中幼紅細胞、晚幼紅細胞及成熟紅細胞中的鐵（包括鐵粒幼紅細胞、環(huán)形鐵粒幼紅細胞及鐵粒紅細胞）。1、細胞外鐵觀察骨髓小粒中的鐵，呈彌散藍色、顆粒狀、小珠狀或塊狀。根據(jù)骨髓小粒中鐵的存在方式及量將細胞外鐵分為（-）、（+）、（++）、（+++）、（++++）。2、細胞內鐵觀察100個中幼紅細胞和晚幼紅細胞計算出鐵粒幼紅細胞的百分比。鐵粒幼紅細胞是指胞質中出現(xiàn)藍色鐵顆粒的幼紅細胞，根據(jù)藍色鐵顆粒多少、粗細分為I型、II型、III型、IV型及環(huán)形鐵粒幼紅細胞。環(huán)形鐵粒幼紅細胞是指幼紅細胞胞質內藍色顆粒在6顆以上，圍繞核周1/2以上者。成熟紅細胞中出現(xiàn)鐵顆粒稱為鐵粒紅細胞。第五十六頁，共77頁。第五十七頁，共77頁。[臨床評價]鐵染色是臨床應用最廣泛的細胞化學染色之一。其細胞內鐵易受外界鐵的污染，使內鐵陽性率增高；而細胞外鐵雖也會受污染，但較易辨認。鐵染色主要用于缺鐵性貧血和環(huán)形鐵粒幼紅細胞增多的貧血診斷，而對于臨床不明原因的貧血除作鐵染色外，還應作NAP染色和PAS染色。1、缺鐵性貧血其細胞外鐵明顯減低甚至陰性，細胞內鐵陽性率減低或為零。經(jīng)鐵劑治療有效后，其細胞外鐵、內鐵增多。因此鐵染色可作為診斷缺鐵性貧血及指導鐵劑治療的重要方法。第五十八頁，共77頁。2、鐵粒幼細胞貧血鐵粒幼紅細胞增多，其中的環(huán)形鐵粒幼紅細胞增多，有時可見到鐵粒紅細胞，細胞外鐵也常明顯增多。因此鐵染色可作為診斷本病的重要方法。3、骨髓增生異常綜合征伴環(huán)形鐵粒幼紅細胞增多的難治性貧血，其環(huán)形鐵粒幼紅細胞大于15%，細胞外鐵也常增加。4、非缺鐵性貧血溶性性貧血、巨幼細胞性貧血、再生障礙性貧血、多次輸血后和白血病等，細胞外鐵和內鐵正?；蛟黾?；感染、肝硬化、慢性腎炎、尿毒癥、血色病等，細胞外鐵明顯增加而鐵粒幼紅細胞可減少。第五十九頁，共77頁。第三節(jié)骨髓組織病理學檢驗

一、骨髓活體組織檢查骨髓穿刺檢查在大部分病人能成功地取出供細胞學檢查所用的骨髓，但在原發(fā)性或繼發(fā)性骨髓纖維化（尤其是惡性腫瘤如肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等骨髓轉移所致），某些白血?。ㄈ缍嗝毎籽。┮约傲馨土龅炔∪?，骨髓穿刺常不能成功。即使在部分骨髓“干抽”的情況下仍可拔出穿刺針，用針芯擠出針管內的存留物，并可涂片一張或數(shù)張以供染色、鏡檢，但終因取材少而難有陽性結果。而采用骨髓活體組織檢查（bonemarrowbiopsy,BMB），簡稱骨髓活檢，能夠彌補骨髓穿刺的不足。骨髓活檢的優(yōu)點在于取材多，且活組織切片不僅能保持骨髓結構，顯示骨髓細胞之間及組織之間的相互關系，骨髓組織中造血細胞的密度及所占百分比，造血組織的分布，還能顯示骨小梁，血管，脂肪和結締組織基質間的解剖學關系，使人們能全面了解骨髓病理學改變。第六十頁，共77頁。骨髓干抽常見于下列情況

骨髓增生低下：骨髓幾乎全被脂肪組織所取代，造血細胞空虛，無細胞可抽，例如再生障礙性貧血。

骨髓間質細胞增多：骨髓病理切片顯示成纖維細胞和網(wǎng)狀纖維彌漫增生，甚至部分骨質硬化，造血組織萎縮被固定在堅韌的纖維組織中，如骨髓纖維化，是最常見的引起骨髓干抽的疾病。

骨髓增生極度活躍：骨髓內細胞過多，排列緊密，細胞與細胞間幾無空隙，不易被抽吸造成干抽。如慢性粒細胞性白血病、急性非淋巴細胞性白血病、骨髓增生異常綜合征、急性淋巴細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓轉移瘤等。

骨髓壞死：嚴重感染或骨髓轉移瘤等原因導致骨髓內細胞溶解破壞時也常抽不出骨髓。第六十一頁，共77頁。（一）適應征1、骨髓穿刺多次失敗（懷疑骨髓纖維化，骨髓轉移癌，多發(fā)性骨髓瘤，多毛細胞白血病，某些急、慢性白血病及骨髓硬化癥等）。2、血象顯示全血細胞減少，反復骨髓穿刺均為“骨髓稀釋”或骨髓增生低下，臨床懷疑再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征及低增生性白血病的患者。3、某些貧血、原因不明的發(fā)熱、脾或淋巴結腫大，骨髓涂片檢查不能確診者。4、對白血病療效的觀察有指導價值。骨髓涂片已達到完全緩解，但有時骨髓活檢切片內仍可檢出白血病原始細胞簇。在AML的緩解后化療及長期無病生存期間，應定期作骨髓雙標本取材。第六十二頁，共77頁。（二）檢驗方法1、方法取材部位常選擇髂后上棘和髂前上棘，病人的體位、局部消毒、穿刺技術基本上與骨髓穿刺相相似。不同之處在于骨髓活檢選用活檢穿刺針，以一定方向旋轉入骨皮質，活檢針固定后，拔出連手柄針芯，套入長（或短）按柱，將針芯插入針座和針套筒內，再以一定方向旋轉推進一定深度（約1cm），以一定方向轉動幾周，然后以一定方向旋轉退針，將針管內的骨髓組織塊（約米粒大?。┯冕樞就瞥?，放入10%甲醛液（或95%酒精）的小瓶內，備切片用。亦可采取一步法抽吸-活檢技術，在同一穿刺點先作骨髓抽吸物涂片，后再作環(huán)鉆活檢，但因活檢針管徑較大（0.2cm），骨髓涂片易發(fā)生血液稀釋；活檢標本中也可能出現(xiàn)人為的增生減低以及活組織塊內部出血。第六十三頁，共77頁。2、注意事項①同骨髓穿刺注意事項；②開始進針不宜太深，否則難以取出骨髓組織；③如遇出血趨勢較重的病人，取材后穿刺部位需加壓壓迫局部，以免出血過多。第六十四頁，共77頁。（三）骨髓活檢報告的書寫1、鏡下觀察結果的描寫顯微鏡的觀察常先用低倍鏡，后轉高倍鏡，必要時用油鏡觀察。鏡下觀察結果的描寫內容包括：①骨髓組織的整個結構，包括骨小梁，造血細胞，間質反應（如炎癥反應，壞死，肉芽腫，網(wǎng)狀纖維增加及纖維化，血管病變）等；②各系血細胞之間的比例及血細胞與脂肪細胞之間的比例；③各系（主要指紅系、粒系和巨核系）不同成熟階段細胞的形態(tài)學；④有無外源性病理細胞及寄生蟲。第六十五頁，共77頁。2、病理診斷

（1）診斷注意點：必須與骨髓片、血涂片及臨床資料密切結合，才能作出正確診斷，其中以骨髓切片與涂片檢查的綜合分析尤為重要，因為骨髓涂片檢查只能診斷50%~70%的病例，如二者結合應用，其診斷率可達90%左右。（2）診斷的分類：①陰性診斷：指正常骨髓組織象或未取到病灶；②確定診斷：指僅根據(jù)骨髓活檢即獨立作出診斷；③協(xié)助診斷：指協(xié)助涂片檢查而確立診斷。3、備注說明骨髓活檢有一定的局限性，如骨髓病變未達到彌漫性時，活檢可能取不到病變組織，再加上人為因素，如取材失敗或制片不佳等均可影響診斷。這些情況盡可能加以說明，以便于臨床參考。第六十六頁，共77頁。（四）正常骨髓組織學特點骨髓由造血組織和非造血組織（骨質和間質）構成。不同年齡健康人的造血組織，其增生程度（指骨髓活檢切片內造血組織與脂肪組織的容量之比）與年齡有相關性。第一期（30歲以前），造血組織容量（vol)有進行性下降趨勢，平均值為79（32~95）vol%；第二期（30~70歲），造血組織保持相對穩(wěn)定，其容量平均值為47（16.3~81.3）vol%；第三期（大于70歲），造血組織增生度出現(xiàn)第二次下降，其平均容量為29(11.3~47)vol%。第六十七頁，共77頁。造血組織主要由網(wǎng)狀結締組織和造血細胞組成。網(wǎng)狀細胞和網(wǎng)狀纖維構成造血組織的支架，網(wǎng)眼中充滿著處于不同發(fā)育階段的各種血細胞，少量造血干細胞，巨噬細胞，脂肪細胞及未分化的間充質細胞等，且發(fā)育中的各種血細胞在骨髓造血組織內的分布有一定規(guī)律，在H-E染色切片中，紅系細胞染色較深，粒系細胞染色較淺，巨核細胞體積較大，這樣就構成了細胞很不一致的骨髓切片圖像。骨髓活檢切片中亦可見到骨質（包括皮質骨及網(wǎng)狀骨質兩種構形）及間質成分。脂肪細胞，血管，神經(jīng)纖維，結締組織，網(wǎng)狀纖維（一般需經(jīng)特殊染色才能顯示出來）及網(wǎng)狀-巨噬細胞共同構成造血組織的間質。

第六十八頁，共77頁。二、臨床評價

骨髓活檢能夠彌補骨髓涂片檢查的不足，骨髓活檢與穿刺涂片聯(lián)合檢測的結果是血液病診斷的“金標準”，也是更復雜診斷技術探索的重要起點。（一）骨髓活檢的臨床意義1、可確切地了解骨髓增生程度，粒/紅比值及骨髓內鐵儲存情況，對于某些疾?。ㄈ缭偕系K性貧血，缺鐵性貧血及骨髓增生異常綜合征）及化療后骨髓抑制程度有明確的診斷價值。2、可以發(fā)現(xiàn)骨髓穿刺涂片檢查不易發(fā)現(xiàn)的病理變化（如骨髓纖維化，骨髓壞死，膠樣變性及肉芽腫等），對相關疾病的診斷，骨髓造血微環(huán)境及骨髓移植的研究有重要意義。第六十九頁，共77頁。3、對各種急，慢性白血病和骨髓增生異常綜合征有確診和判定預后的意義，對骨髓轉移癌，惡性組織細胞病，戈謝病和尼曼-匹克病等診斷的陽性率比骨髓涂片高。4、可協(xié)助診斷慢性骨髓增生性疾病，如真性紅細胞增多癥，原發(fā)性血小板增多癥，骨髓纖維化等。第七十頁，共77頁。（二）常見血液病的骨髓組織病理學特點1、再生障礙性貧血①造血組織減少而致骨髓增生減退，造血組織與脂肪組織的容積百分比降低（小于34vol%），脂肪細胞與基質增多；②紅系、粒系、巨核系細胞均減少，淋巴細胞相對增多，典型病例可見殘存的孤立性幼紅細胞島，即所謂“熱點”(hotspot)，常局限于靜脈竇附近；③間質內漿細胞、肥大細胞、網(wǎng)狀細胞等非造血細胞增多，并可有間質水腫，出血甚至液性脂肪壞死。2、巨幼細胞貧血①骨髓增生明顯或極度活躍，造血組織容積百分比≥90vol%，以不同發(fā)育階段紅細胞增生為主，脂肪細胞減少；②處于不同發(fā)育階段的巨幼細胞彌漫性浸潤，粒/紅比值降低；③分裂象易見。第七十一頁，共77頁。3、缺鐵性貧血①骨髓增生明顯活躍或極度活躍，以不同發(fā)育階段的紅細胞增生為主，粒/紅比值降低；②切片內幼紅細胞島豐富，以中、晚幼紅細胞增生占優(yōu)勢，細胞核小而致密，胞質量少，邊緣常不整齊；③間質可有輕度水腫及出血（慢性病伴營養(yǎng)不良者）；④切片鐵染色比骨髓涂片更能反映體內實際鐵貯存情況。4、溶血性貧血