發(fā)酵學滅菌演示文稿

發(fā)酵學滅菌演示文稿當前第1頁\共有77頁\編于星期五\18點發(fā)酵學滅菌當前第2頁\共有77頁\編于星期五\18點滅菌指用化學的或物理學的方法殺滅或除掉物料或設(shè)備中所有的有生命的有機體的技術(shù)或工藝過程。消毒除菌當前第3頁\共有77頁\編于星期五\18點發(fā)酵的流程空氣空氣凈化處理保藏菌種斜面活化擴大培養(yǎng)種子罐主發(fā)酵碳源、氮源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)滅菌產(chǎn)物分離純化成品當前第4頁\共有77頁\編于星期五\18點污染雜菌的危害

1.消耗營養(yǎng)物質(zhì)。2.抑制發(fā)酵菌生長。3.改變培養(yǎng)液理化性質(zhì)。4.抑制產(chǎn)物生物合成。5.噬菌體污染。當前第5頁\共有77頁\編于星期五\18點第一節(jié)滅菌的基本原理第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌第三節(jié)空氣除菌第四節(jié)無菌檢查與染菌處理第五節(jié)制服染菌的要點當前第6頁\共有77頁\編于星期五\18點一、高溫濕熱滅菌二、過濾介質(zhì)除菌三、其他滅菌方法高溫干熱滅菌化學物質(zhì)消毒和滅菌臭氧滅菌輻射滅菌靜電除菌第一節(jié)滅菌的基本原理當前第7頁\共有77頁\編于星期五\18點原理：

由于蒸汽具有很強的穿透力，冷凝時可釋放出大量潛熱，使微生物細胞中的原生質(zhì)體膠體和酶蛋白變性凝固，核酸分子的氫鍵破壞，使微生物死亡。常用方法：水煮常壓滅菌：100℃，40-60min

高壓蒸汽滅菌：一般121℃，30分鐘特點

蒸汽穿透力強，滅菌易于徹底；蒸汽來源容易，操作費用低，本身無毒一、高溫濕熱滅菌（一）概述當前第8頁\共有77頁\編于星期五\18點（二）濕熱滅菌的理論基礎(chǔ)

1.微生物的熱阻大多數(shù)微生物最適溫度為25~40℃,維持溫度為5~50℃，當溫度超過最高限溫時微生物就會發(fā)生死亡。無芽孢菌在60℃保溫10min即可全部被殺死。芽孢要在100℃下保溫10min到幾小時才能被殺死。嗜熱細菌在120℃下仍可耐受20~30min。一、高溫濕熱滅菌當前第9頁\共有77頁\編于星期五\18點熱阻：指微生物在某一種特定條件下（主要是溫度和加熱方式）的致死時間，它代表了微生物對熱的抵抗能力。相對熱阻：是指某一微生物在某條件下的致死時間與另一微生物在相同條件下的致死時間的比值。致死溫度：殺死微生物的極限溫度稱為致死溫度。致死時間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需要的時間。當前第10頁\共有77頁\編于星期五\18點一般所指的滅菌是否徹底，是以能否殺死熱阻大的芽孢桿菌為指標。當前第11頁\共有77頁\編于星期五\18點2.微生物的熱滅死定律——對數(shù)殘留定律實際設(shè)計時常用Nt＝0.001即1000批次的滅菌中只有一批失敗。對數(shù)殘留定律：在滅菌過程中，微生物個數(shù)減少速率(dN/dt)與一瞬間殘留的活菌數(shù)成正比。當前第12頁\共有77頁\編于星期五\18點k是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)相同滅菌條件下，不同微生物的k值是不同的。k值越小，熱阻越大。同一微生物在不同溫度下，K值不同。溫度越高，k值越大，滅菌時間越短3.反應(yīng)速率常數(shù)k當前第13頁\共有77頁\編于星期五\18點原理：利用微生物不能透過濾膜而達到除菌目的。方法:0.01~0.45m孔徑濾膜，使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。二、介質(zhì)過濾除菌（一）概述當前第14頁\共有77頁\編于星期五\18點濾材孔空氣過濾除菌：利用有孔介質(zhì)從氣體中除去微生物潔凈氣體含微生物的氣體（二）介質(zhì)過濾除菌機理二、介質(zhì)過濾除菌當前第15頁\共有77頁\編于星期五\18點過濾器經(jīng)常被認為是一種簡單的網(wǎng)或篩子，過濾/分離是在一個平面上進行的。當前第16頁\共有77頁\編于星期五\18點實際上，空氣過濾器的濾材具有深度：“彎曲通道”的結(jié)果對于污染物的去除起到了輔助作用。當前第17頁\共有77頁\編于星期五\18點原理：過濾介質(zhì)填充到過濾器中，空氣流過時借助慣性沖擊、阻截、擴散、重力沉降和靜電吸附等作用將塵埃微生物截留在介質(zhì)中，達到除菌的目的。當前第18頁\共有77頁\編于星期五\18點慣性沖擊當流體改變運動方向時，慣性使顆粒撞擊到濾材表面并由于吸附力而停留當前第19頁\共有77頁\編于星期五\18點直接攔截絕對截留

-顆粒被捕獲在濾材纖維之間形成的孔中當前第20頁\共有77頁\編于星期五\18點擴散攔截被隨機運動的氣體分子碰撞的顆粒撞擊到過濾介質(zhì)上并被吸附截留當前第21頁\共有77頁\編于星期五\18點過濾機理總結(jié)直接攔截慣性沖擊擴散攔截當前第22頁\共有77頁\編于星期五\18點三、其他滅菌方法在干燥高溫條件下，微生物細胞內(nèi)的各種與溫度有關(guān)的氧化反應(yīng)速度迅速增加，是微生物的致死率迅速增高的過程。常用方法：灼燒和電熱箱加熱，160℃2h使用范圍：需要保持干燥的器械、容器的滅菌。玻璃及金屬用具及沙土管滅菌1.高溫干熱滅菌當前第23頁\共有77頁\編于星期五\18點利用化學試劑（甲醛、苯酚、高錳酸鉀等）與微生物細胞中某種化學成分反應(yīng)，如使蛋白質(zhì)變性、酶類失活、破壞細胞膜通透性等殺滅微生物。

應(yīng)用：實驗室和無菌室的空間滅菌，設(shè)備、器械、雙手的消毒滅菌，但不能用于培養(yǎng)基的滅菌。三、其他滅菌方法2.化學物質(zhì)滅菌當前第24頁\共有77頁\編于星期五\18點化學物質(zhì)名稱有效濃度化學物質(zhì)名稱有效濃度新潔爾滅(苯扎溴銨)0.25%甲醛37%杜滅芬0.25%戊二醛2%高錳酸鉀0.1%-0.25%苯酚0.1%-0.15%漂白粉5%過氧乙酸0.02%-0.2%酒精75%焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（來蘇爾）1%—5%

常用的滅菌劑當前第25頁\共有77頁\編于星期五\18點臭氧在常溫常壓下不穩(wěn)定、分解為O2和O，O對細菌有極強的氧化作用。臭氧氧化分解細菌細胞內(nèi)氧化葡萄糖所必需的酶，從而直接破壞細胞膜，將細菌殺死。無污染消毒劑應(yīng)用：潔凈室、凈化設(shè)備三、其他滅菌方法3.臭氧滅菌當前第26頁\共有77頁\編于星期五\18點

4.輻射滅菌

利用高能量的電磁輻射和微粒輻射來殺滅微生物常用：紫外線、X射線和γ射線紫外線：誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復制，導致菌體死亡。波長為260nm的殺菌力最強、穿透力差。應(yīng)用：適于表面滅菌。無菌室、接種箱

三、其他滅菌方法當前第27頁\共有77頁\編于星期五\18點原理：利用靜電引力來吸附帶電粒子而達到除塵、除菌的目的。特點：阻力小，約1×105Pa；耗電少；除水、除油的效果好。設(shè)備龐大，高壓電技術(shù)。應(yīng)用：凈化空氣三、其他滅菌方法5.靜電除菌當前第28頁\共有77頁\編于星期五\18點一、溫度和時間對培養(yǎng)基滅菌的影響二、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素三、培養(yǎng)基的滅菌方法四、發(fā)酵設(shè)備的滅菌第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌當前第29頁\共有77頁\編于星期五\18點一、溫度和時間對培養(yǎng)基滅菌的影響絕大多數(shù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分的破壞和菌體死亡都屬于一級動力學反應(yīng)。第二節(jié)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌微生物營養(yǎng)成分反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù)阿累尼烏斯方程當前第30頁\共有77頁\編于星期五\18點隨溫度的升高，滅菌反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù)大于營養(yǎng)成分破壞反應(yīng)速度常數(shù)增加的倍數(shù)。Q10：溫度升高10℃時的反應(yīng)速度常數(shù)與原溫度時的反應(yīng)速度常數(shù)的比值。一般的化學反應(yīng)Q10為：1.5~2.1殺滅微生物營養(yǎng)體的反應(yīng)Q10為：5~10殺死芽孢時的反應(yīng)Q10為：35微生物營養(yǎng)成分

芽孢VB2118℃,15min99.99%10%120℃,1.5min99.99%5%當前第31頁\共有77頁\編于星期五\18點培養(yǎng)基的成分pH培養(yǎng)基的物理狀態(tài)泡沫培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量二、影響培養(yǎng)基滅菌的其他因素當前第32頁\共有77頁\編于星期五\18點三、培養(yǎng)基滅菌方法實驗室：工業(yè)上：分批滅菌、連續(xù)滅菌當前第33頁\共有77頁\編于星期五\18點（一）分批滅菌將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐中，用直接蒸汽加熱，達到滅菌要求的溫度和壓力后維持一定時間，再冷卻至發(fā)酵要求的溫度，這一工藝過程稱為分批滅菌或?qū)嵐逌缇?。當前?4頁\共有77頁\編于星期五\18點1．操作過程：空罐準備：清洗、檢修和檢測。升溫：把培養(yǎng)基加熱到滅菌所需的溫度。（預熱）保溫維持：在滅菌溫度（120℃）下保持30分鐘。冷卻保壓：把培養(yǎng)基的溫度快速降低到接種的溫度。當前第35頁\共有77頁\編于星期五\18點三路進汽：蒸汽從通風、取樣和出料口進入罐內(nèi)直接加熱，直到所規(guī)定的溫度，并維持一定的時間。這就是所謂的“三路進氣”。四路出汽：直接蒸汽從排氣、接種、進料和消沫劑管排氣2、分批滅菌設(shè)備示意圖當前第36頁\共有77頁\編于星期五\18點優(yōu)點：不需要其他附屬設(shè)備，操作簡便缺點：加熱和冷卻時間較長，營養(yǎng)成分有損失；不能采用高溫快速滅菌工藝；罐利用率低。當前第37頁\共有77頁\編于星期五\18點（二）連續(xù)滅菌培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程。當前第38頁\共有77頁\編于星期五\18點

1.由熱交換器組成的連續(xù)滅菌系統(tǒng)新鮮培養(yǎng)基第一個熱交換器（殘熱回收器）20~30s,90~120℃第二個熱交換器（加熱器）140℃,30~120s第三個熱交換器（冷卻器）20~30s含淀粉培養(yǎng)基須用酸或酶水解后再用連續(xù)滅菌1mm懸浮顆粒須增加1s，1cm須增加100s，所以培養(yǎng)基中顆粒＜2mm發(fā)酵罐當前第39頁\共有77頁\編于星期五\18點當前第40頁\共有77頁\編于星期五\18點

2.蒸汽直接加熱培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌系統(tǒng)新鮮培養(yǎng)基加熱器直接蒸汽加熱140℃殘熱回收預熱器回收熱能由于冷凝，培養(yǎng)基被稀釋，引起粘度的變化。發(fā)酵罐熱交換器冷卻當前第41頁\共有77頁\編于星期五\18點

3.由連消塔、維持罐和冷卻器組成的連續(xù)滅菌系統(tǒng)控制培養(yǎng)基輸入連消塔的速度＜0.1m/min，滅菌溫度為132℃，在塔內(nèi)的停留時間為20-30秒。當前第42頁\共有77頁\編于星期五\18點優(yōu)點：

1.可采用高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞少。

2.發(fā)酵罐非生產(chǎn)占用時間少，容積利用率高。

3.自動化，熱能利用率合理。缺點：

1.不適用于粘度大和固形物含量高的培養(yǎng)基。

2.增加設(shè)備、操作環(huán)節(jié)以及染菌機率。當前第43頁\共有77頁\編于星期五\18點注：高溫對培養(yǎng)基成分的有害影響當前第44頁\共有77頁\編于星期五\18點消除高溫有害影響的措施（1）采用特殊加熱滅菌法(連續(xù)滅菌方法）（2）對易破壞的含糖培養(yǎng)基進行滅菌時，應(yīng)先將糖液與其他成分分別滅菌后再合并；（3）對含Ca2+或Fe3+的培養(yǎng)基與磷酸鹽先作分別滅菌，然后再混合，就不易形成磷酸鹽沉淀；（4）對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基（如含糖組合培養(yǎng)基）可進行低壓滅菌當前第45頁\共有77頁\編于星期五\18點三、發(fā)酵設(shè)備的滅菌實罐滅菌：發(fā)酵罐與培養(yǎng)基一起滅菌；連續(xù)滅菌：發(fā)酵罐在培養(yǎng)基滅菌之前，直接用蒸汽進行滅菌.空消之后不能立即冷卻；發(fā)酵罐附屬設(shè)備滅菌：分空氣過濾器、補料系統(tǒng)、消沫劑系統(tǒng)等當前第46頁\共有77頁\編于星期五\18點一、概述二、空氣過濾介質(zhì)三、空氣過濾除菌的工藝流程第三節(jié)空氣除菌當前第47頁\共有77頁\編于星期五\18點1.無菌空氣的概念通過除菌處理使空氣中含菌量降低在一個極低的百分數(shù)，從而能控制發(fā)酵污染至極小機會。此種空氣稱為“無菌空氣”。一、概述當前第48頁\共有77頁\編于星期五\18點2.發(fā)酵對空氣無菌程度的要求

一般要求經(jīng)過濾后空氣的無菌程度為N=10-3空氣中微生物(包括細菌、酵母、霉菌和病毒)含量一般為103~104個／米3。一般附著在空氣中的灰塵上或霧滴上。灰塵粒子的平均大小約0.6μm左右，空氣除菌主要去除空氣中的微粒(0.6~1μm）。當前第49頁\共有77頁\編于星期五\18點加熱滅菌(蒸汽、電能、空氣壓縮）3.空氣除菌的方法介質(zhì)過濾除菌輻射滅菌化學滅菌靜電除菌當前第50頁\共有77頁\編于星期五\18點棉花活性炭過濾器平板式超細纖維過濾器金屬燒結(jié)管過濾器微孔膜過濾器二、空氣過濾介質(zhì)

除菌效率高、能耐受高溫高壓、不易被油水污染、阻力小、成本低、易更換。當前第51頁\共有77頁\編于星期五\18點當前第52頁\共有77頁\編于星期五\18點子彈狀膜過濾當前第53頁\共有77頁\編于星期五\18點三、空氣過濾除菌的工藝流程

１——粗過濾器２——壓縮機３——貯罐４——冷卻器

５——絲網(wǎng)分離器６——過濾器

1.冷熱空氣直接混合式空氣過濾除菌流程適用于中等混合量的地區(qū)。當前第54頁\共有77頁\編于星期五\18點流程的特點是：兩次冷卻，兩次分離，適當加熱。（常用）2.兩級冷卻、分離、加熱的空氣過濾除菌流程當前第55頁\共有77頁\編于星期五\18點旋風分離器——利用離心力進行沉降，對于10m以上的微粒分離效率較高。絲網(wǎng)分離器——利用慣性進行攔截，分離效率較高，能除去2～5m的細小顆粒。當前第56頁\共有77頁\編于星期五\18點特點：無菌程度高3.高效前置過濾除菌流程當前第57頁\共有77頁\編于星期五\18點注.空氣的預處理提高壓縮前空氣的潔凈度去除壓縮后空氣中的油和水冷卻當前第58頁\共有77頁\編于星期五\18點1）提高壓縮前空氣的潔凈度提高空氣吸氣口的位置在空氣入口處設(shè)置粗過濾器

——捕集較大的灰塵顆粒，并保護空壓機當前第59頁\共有77頁\編于星期五\18點高空取氣管

為遠離地面幾十米的管子。每升高3.05米，空氣中雜菌降低一個數(shù)量級。因此從高空取氣要比從低空取氣有利得多。

當前第60頁\共有77頁\編于星期五\18點2）去除壓縮后空氣中的油和水3）壓縮后空氣溫度顯著上升，需冷卻壓縮后的高溫空氣能引起過濾介質(zhì)的炭化或燃燒增大發(fā)酵罐的降溫負荷增加培養(yǎng)液水分的蒸發(fā)分離器儲氣罐中除去大的水滴和油滴當前第61頁\共有77頁\編于星期五\18點一、無菌檢查二、染菌的處理第四節(jié)無菌檢查與染菌處理當前第62頁\共有77頁\編于星期五\18點一、無菌檢查培養(yǎng)試驗：平板培養(yǎng)、肉湯培養(yǎng)顯微鏡檢查培養(yǎng)液的生化指標變化（一）無菌檢查方法當前第63頁\共有77頁\編于星期五\18點1.無菌試驗連續(xù)3個時間的酚紅肉湯無菌樣發(fā)生顏色變化或渾濁。平板上連續(xù)3個時間樣品長出雜菌檢查樣品保留，以備長期監(jiān)測。一般保留至放罐后12小時。（二）染菌的判斷當前第64頁\共有77頁\編于星期五\18點2.溶解氧水平異常變化顯示染菌發(fā)酵時間溶氧濃度正常發(fā)酵污染噬菌體發(fā)酵時間溶氧濃度正常發(fā)酵污染好氣性雜菌污染非好氣性雜菌當前第65頁\共有77頁\編于星期五\18點3.排氣中CO2異常變化顯示染菌工藝一定，尾氣中CO2量變化有一定規(guī)律污染雜菌，糖耗加快，尾氣中CO2量增加污染噬菌體，糖耗減慢，尾氣中CO2量減少當前第66頁\共有77頁\編于星期五\18點二、染菌后的處理1.種子罐染菌的處理直接滅菌后廢棄（一）污染雜菌的處理

當前第67頁\共有77頁\編于星期五\18點危害性大,采用蒸汽滅菌經(jīng)過濾處理后放掉如果危害性不大,可用重新滅菌、重新接種2.發(fā)酵罐染菌的處理（一）污染雜菌的處理

前期染菌中后期染菌加入適量的滅菌劑（抗生素）降低培養(yǎng)溫度控制補料量來控制雜菌的生長速度二、染菌后的處理當前第68頁\共有77頁\編于星期五\18點3.染菌后設(shè)備的處理用甲醛等化學物質(zhì)處理,再用蒸汽滅菌〈包括各種附屬設(shè)備〉。在再次投料之前,要徹底清洗罐體、附件,同時進行嚴密程度檢查,以防滲漏。

（一）污染雜菌的處理

二、染菌后的處理當前第69頁\共有77頁\編于星期五\18點（二）污染噬箘體的處理1.污染噬菌體的判斷噬菌體污染后往往出現(xiàn)發(fā)酵液突然轉(zhuǎn)稀在較短時間內(nèi)菌體大量自溶,最后僅殘留菌絲斷片平皿培養(yǎng)出現(xiàn)典型的噬菌斑溶氧濃度回升提前營養(yǎng)成分很少消耗,產(chǎn)物合成停止等現(xiàn)象。有無染噬菌體，根本的要做噬菌斑檢驗二、染菌后的處理當前第70頁\共有77頁\編于星期五\18點1）發(fā)酵液用高壓蒸汽滅菌后放掉,嚴防發(fā)酵液任意流失；2）全部停產(chǎn),對環(huán)境進行全面的清洗和消毒,斷絕噬菌體的寄生基礎(chǔ)；3）更換生產(chǎn)菌種,不斷篩選抗噬菌體菌種,防止噬菌體的重復污染。2.污染噬菌體的處理辦法

二、染菌后的處理