生化分離高級(jí)純化技術(shù)

生化分離高級(jí)純化技術(shù)第一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第一節(jié)層析技術(shù)概述一、層析技術(shù)的原理二、層析技術(shù)的類別三、大規(guī)模生物分子純化層析方法

第二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日一、層析技術(shù)的原理1、層析的由來：

層析分離始于20世紀(jì)初，1903年俄國(guó)植物學(xué)家向填充碳酸鈣的柱中注入植物色素的石油醚萃取物，發(fā)現(xiàn)柱中出現(xiàn)數(shù)條相互分離的色帶，層析法（Chromatography）的命名由此開始，又稱色譜或色層。

2、層析技術(shù)的原理

根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不混溶的兩相之間分配的差別，引起移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離的方法（如下圖）?；ゲ幌嗳艿膬上喾謩e稱固定相（stationaryphase）和流動(dòng)相（mobilephase）。料液中溶質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間發(fā)生擴(kuò)散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡。分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相上存在的幾率大，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度小，溶質(zhì)之間的移動(dòng)速度的不同而分離。第三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日柱層析設(shè)備和操作示意圖收集器料液流動(dòng)相三通閥泵泵層析柱ABCD濃度時(shí)間（或洗脫液體積）ABCD第四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日二、層析技術(shù)的類別1、流動(dòng)相與固定相

A、根據(jù)流動(dòng)相的相狀態(tài)：氣相層析法、液相層析法、超臨界流體層析法。

B、固定相為固體、液體和以固體為載體的液體薄層，分別為：吸附層析法、液體的分配層析法、液體薄層的分配層析法。2、固定相的形狀

固定相或?qū)游鲅b置形狀不同，液相層析法又分：

紙層析法（Paperchromatography）薄層層析法（Thin-layerchromatography）柱層析法（Columnchromatography）第五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日3、壓力

以固體（包括以固體為載體的液體薄層）為固體相的液相柱層析中，根據(jù)操作壓力不同，分為：

低壓（小于0.5MPa）液相層析法

中壓（0.5－4.0MPa）液相層析法

高壓（4.0－40MPa）液相層析法4、分配機(jī)理根據(jù)溶質(zhì)和固定相之間的相互作用機(jī)理（液液分配、各種吸附作用），液相層析法可分為：

凝膠過濾層析親和層析離子交換層析反相層析疏水性相互作用層析第六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日5、分離操作方式

操作方式不同：

洗脫展開層析（elutiondevelopment）（洗脫層析）

迎頭分析（frontalanalysis）

頂替展開（displacementdevelopment）

6、料液流向：軸向流層析徑向流層析第七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日三、適用于大規(guī)模生物分子純化的層析方法分離方法分離原理特點(diǎn)應(yīng)用凝膠過濾分子大小分辨率為中等，但對(duì)脫鹽效果優(yōu)良；流速較低，容量受樣本體積的限制大規(guī)模純化的最后步驟，任一階段可脫鹽，尤其適用于兩種緩沖液交替離子交換電荷分辨率高，流速快，容量很高，體積不受限制最適用于大量樣品處理的前階段聚焦層析等電點(diǎn)分辨率高，流速快，容量很高，柱大小限制體積適用于純化后階段疏水層析疏水性分辨率好，流速很快，容量高，體積不受限制適用于分離任一階段，樣品離子強(qiáng)度高時(shí)，即在鹽析、離子交換或親和層析后使用親和層析親和性分辨率非常高，流速高，樣品體積不受限制適用于分離任一階段，尤其樣品體積大、濃度很低而雜質(zhì)含量很高時(shí)第八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)凝膠過濾層析一、凝膠過濾層析的原理二、凝膠過濾層析介質(zhì)三、凝膠過濾層析的應(yīng)用和特點(diǎn)第九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日一、凝膠過濾層析的原理1、原理：凝膠過濾層析（Gelfiltrationchromatography，GFC）又稱分子排阻層析、分子篩層析，以凝膠顆粒為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相層析，當(dāng)料液通過層析柱時(shí)，大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，被凝膠孔排阻，只能在膠外顆粒之間的孔隙中流動(dòng)和分配，流經(jīng)路程短，很快被洗脫出來。小于凝膠孔的分子進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠孔內(nèi)外分配，在凝膠孔內(nèi)部穿行，移動(dòng)速度慢，滯后流出，大小不同的分子得以分離。

分離原理第十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日洗脫體積（Ve）：在凝膠過濾層析中，使溶質(zhì)從柱中流出時(shí)所通過的流動(dòng)相體積；

外水體積（V0）：凝膠顆粒之間的空隙的總體積；

柱總體積（Vt）：Vt=V0＋Vi＋Vm

內(nèi)水體積（Vi）：凝膠顆粒內(nèi)部空隙總體積；

凝膠體積（Vm）：凝膠顆?；|(zhì)本身所占的體積；

在限定的層析條件下，Vt和V0都恒定值，而Ve隨水分離物分子質(zhì)量的變化而變化。其分離效果可用分配系數(shù)（Kav）來表示，第十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（1）Kav＝0時(shí)，則Ve＝V0

，洗脫體積等于孔隙體積，完全排阻（組分Ⅰ）；（2）Kav＝1時(shí)，則Ve＝V0

＋Vi

，洗脫體積等于孔隙體積和內(nèi)水體積之和，小分子完全進(jìn)入凝膠內(nèi)部（組分Ⅲ）；（3）0＜Kav＜1，內(nèi)水體積只有一部分被組分利用，擴(kuò)散滲透（組分Ⅱ）。料液體積小于洗脫體積時(shí)，兩種溶質(zhì)才可能完全分離。溶質(zhì)的分配系數(shù)只與相對(duì)分子質(zhì)量、分子形狀、凝膠結(jié)構(gòu)（孔徑大?。┯嘘P(guān)，與洗脫液的PH值和離子強(qiáng)度等物性無關(guān)。討論：第十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日洗脫曲線第十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2、凝膠過濾介質(zhì)

（1）介質(zhì)種類A、瓊脂糖凝膠（Sepharose）：除凝膠過濾層析(GFC)外，瓊脂糖凝膠化學(xué)修飾后主要用于離子交換層析、疏水性相互作用層析及親和層析。B、SephadexG：利用葡聚糖交聯(lián)制備。交聯(lián)劑一般用環(huán)氧氯丙烷（epichloryohdrin）,用量越大，交聯(lián)度越高，凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水量小，分為G10—200八種型號(hào)。C、聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel-P）：第十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（2）凝膠特性參數(shù)A、排阻極限（exclusionlimit）：是指不能擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的最小分子的相對(duì)分子量。不同凝膠介質(zhì)具有不同的排阻極限。如SephadexG50的分子排阻為30KD。B、分級(jí)范圍（fractionationrange）：能為凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離的溶質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍。SephadexG-50的分級(jí)范圍為1.5—30KD。C、溶脹率:每克干凝膠溶脹后所吸收水分的百分?jǐn)?shù)，即溶脹率＝100％×(溶脹平衡后重量－干燥重量)/干燥重量SephadexG-50的溶脹率為500％±30％第十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日D、床體積（bedvolume）：1g干燥凝膠溶脹后所占的體積。SephadexG-50的床體積為9—11cm3/g干膠。E、空隙體積（voidvolume）：層析柱中凝膠之間孔隙的體積(V0)，一般用平均相對(duì)分子量為2，000KD的水溶性藍(lán)色葡聚糖（bluedextran）測(cè)定。F、凝膠粒徑：凝膠一般為球形，粒徑越小分離效率越高。粒徑多用篩目或微米表示。如軟凝膠粒徑為50—150μm(100—200目)。第十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日特點(diǎn)：

操作簡(jiǎn)便、過濾介質(zhì)相對(duì)價(jià)廉，適合大規(guī)模分離純化。但僅根據(jù)溶質(zhì)相對(duì)分子量的差別進(jìn)行分離，選擇性低，料液處理量小。3、凝膠過濾的特點(diǎn)及應(yīng)用第十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

（1）分離純化：用于相對(duì)分子量從幾百到106數(shù)量級(jí)的物質(zhì)分離純化，是蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、抗生素、糖類、核酸以及病毒（50—400nm）的分離與分析使用的方法。如圖GFC分離鼠血清IgG。又如利用SephadexG25凝膠柱處理青霉素溶液中高分子雜質(zhì)。應(yīng)用：第十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（2）脫鹽：經(jīng)鹽析沉淀獲得的蛋白質(zhì)溶液中鹽濃度很高，一般不能直接進(jìn)行離子交換層析分離，可首選GFC脫鹽。

（3）相對(duì)分子量的測(cè)定：在凝膠過濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)（或洗脫體積）與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。用于未知物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。首先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分布凝膠過濾試驗(yàn)確定分配系數(shù)與相對(duì)分子量關(guān)系，推算未知蛋白質(zhì)相對(duì)分子量。第十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（1）求出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量與洗脫體積的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量lgMVe藍(lán)色葡聚糖200005.30120牛血清蛋白670004.82637胃蛋白酶360004.55644Cytc130004.11450（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量與洗脫體積標(biāo)準(zhǔn)曲線圖lgMVe（3）根據(jù)未知蛋白質(zhì)洗脫體積求出相對(duì)分子量第二十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第二節(jié)親和純化技術(shù)一、生物親和作用二、親和層析原理三、親和層析介質(zhì)四、親和層析分離過程五、親和層析柱的再生六、純化大分子物質(zhì)實(shí)例

第二十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日親和結(jié)合(affinitybinding)：通過親和作用發(fā)生的結(jié)合稱為特異性結(jié)合（specificbinding）或親和結(jié)合(affinitybinding)。生物親和作用（bioaffinity）：生物分子能夠區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結(jié)合的這種特異性相互作用稱生物親和作用（bioaffinity）或簡(jiǎn)稱親和作用(affinity)。親和純化技術(shù)（Affinitypurification）：

利用生物分子間的這種特異性結(jié)合作用的原理進(jìn)行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)稱為親和純化技術(shù)（Affinitypurification）;親和層析法（Affinitychromatography）為代表。第二十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日一、生物親和作用

A、靜電作用：親和作用分值對(duì)的結(jié)合部位上帶有相反電荷，產(chǎn)生靜電引力。在中性PH下，蛋白質(zhì)分子上的谷氨酸、半胱氨酸等酸性氨基酸殘基可帶負(fù)電荷，而精氨酸、賴氨酸、組氨酸等堿性氨基酸殘基可帶正電荷。B、氫鍵：親和作用分子對(duì)的一方分子中含有氧原子或氮原子，結(jié)合部位之間可以產(chǎn)生氫鍵作用。

C、疏水性相互作用：親和作用分子對(duì)的一方分子中含有芳香環(huán)或羥基鏈等疏水基，另一方的結(jié)合部位上也含有疏水區(qū)，兩者之間發(fā)生疏水性相互作用。如亮氨酸、甲硫氨酸等氨基酸殘基含有碳?xì)滏湥奖彼?、色氨酸等含有芳香環(huán)。

D、配位鍵：E、弱共價(jià)鍵：1、親和作用的本質(zhì)第二十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2、生物常見親和關(guān)系

A、酶：底物、底物類似物、抑制劑、輔酶、金屬離子；B、抗體：抗原、病毒、細(xì)胞；C、激素：受體蛋白、載體蛋白；D、外源凝集素（Lectin）：多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體蛋白、細(xì)胞；E、核酸：互補(bǔ)堿基鏈段、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白；F、細(xì)胞：細(xì)胞表面特異蛋白、外源凝集素。

第二十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日3、影響親和作用的因素

A、離子強(qiáng)度：親和結(jié)合作用源于靜電引力，則提高離子強(qiáng)度就會(huì)減弱或破壞親和作用；如源于疏水性相互作用，則隨離子強(qiáng)度提高而增大。B、PH值：蛋白質(zhì)為多價(jià)兩性電解質(zhì)，含有許多解離基團(tuán)，不同解離基團(tuán)的解離常數(shù)（pka）不同。C、抑制氫鍵形成的物質(zhì)：脲和鹽酸胍的存在可抑制氫鍵的形成。D、溫度：溫度升高使分子原子熱運(yùn)動(dòng)加劇，結(jié)合部位的靜電作用、氫鍵及金屬配位鍵將弱。但可使疏水性作用增強(qiáng)。E、螯合劑：親和分子對(duì)金屬離子形成的配位鍵，加入EDTA等螯合劑除去金屬離子，可使親和結(jié)合作用消失。第二十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日二、親和層析原理把具有特異親和力的一對(duì)分子的一方作為配基（ligand），與不溶性載體結(jié)合，使之固定化，裝入層析柱，然后把含有目的物質(zhì)的混合物作為流動(dòng)相，在有利于固定相配基和目的物質(zhì)形成絡(luò)合物的條件下進(jìn)入層析柱?；旌衔镏兄挥心芘c配基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成絡(luò)合物的目的物質(zhì)被吸收，不能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的雜質(zhì)分子則直接流出。變換通過層析柱的溶液組成，促使配基與親合物（目的物）解離，即可獲得純化目的產(chǎn)物。第二十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日親和層析操作示意圖目標(biāo)產(chǎn)物雜蛋白第二十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日三、親和層析介質(zhì)

A、親和配基：

酶抑制劑：生物體內(nèi)蛋白酶的抑制劑可與蛋白酶的活性部位結(jié)合，抑制酶的活性。抗體：利用抗體為配基的親和層析又稱免疫親和層析（Immunoaffinitychromatography），抗原與抗體之間具有高度特異性結(jié)合能力。第二十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

A蛋白（proteinA）：相對(duì)分子量42KD，與免疫球蛋白G具有很強(qiáng)的親和作用，1個(gè)A蛋白質(zhì)分子能與5個(gè)IgG的Fc片段結(jié)合部位結(jié)合。不能與抗體的抗原結(jié)合部位結(jié)合。

凝集素：是與糖特異結(jié)合的蛋白質(zhì)（酶和抗體除外），含有兩個(gè)以上的糖結(jié)合部位，不同的凝集素與糖結(jié)合的特異性不同。輔酶和磷酸腺苷：三嗪類色素：過渡金屬離子：肝素：第二十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日B、親和吸附介質(zhì)將親和配基共價(jià)偶聯(lián)在固體粒子的表面（孔內(nèi)），該固體粒子通常稱配基的載體（carriersupport），親和層析介質(zhì)又稱親和載體（affinitycarrier,affinitysupport）。作為載體的固體粒子應(yīng)該滿足的條件：具有親水多孔結(jié)構(gòu)，無非特異性吸附，比表面積大；理化穩(wěn)定性高，機(jī)械強(qiáng)度高，使用壽命長(zhǎng)；含可活化的反應(yīng)基團(tuán)，用于親和配體的固定化；粒徑均一的球形粒子。合成氫和介質(zhì)的方法：溴化腈活化法、環(huán)氧劑活化法、硅膠活化法第三十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日四、親和層析分離過程A、特異性吸附：A、樣品開始加到親和層析柱時(shí)，欲分離的大分子物質(zhì)在柱中的濃度等于零；開始進(jìn)入柱中時(shí)，配體和與分離的大分子物質(zhì)間相互接觸，并形成復(fù)合物，也有部分復(fù)合物分解。B、樣品不斷通過柱時(shí)，欲分離的大分子物質(zhì)與配體形成的復(fù)合物濃度越來越大。C、由于配體的存在使欲分離的大分子物質(zhì)受阻，導(dǎo)致產(chǎn)生緊密的復(fù)合帶。樣品中有效成分在層析過程是持久逐步遞增累積得以分離純化。第三十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

樣品中有效成分在層析過程的吸附量，除了與其親合力有密切關(guān)系外，還與樣品的PH值和離子強(qiáng)度有關(guān)。第三十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日B、分離大分子物質(zhì)

樣品通過親和層析柱后，用大量的平衡液即起始緩沖液洗去雜蛋白，也可用不同的緩沖液洗滌，柱上只有專一吸附的大分子物質(zhì)。洗脫專一吸附大分子物質(zhì)的條件，要能使復(fù)合物完全分離，根據(jù)親合力來決定：①親合力較小時(shí)，可以連續(xù)用大體積平衡緩沖液洗脫，得到遲緩的大分子物質(zhì)峰。②親和力一般時(shí)，主要改變緩沖液的性質(zhì)（改變PH值、離子強(qiáng)度等），使復(fù)合物之間的親合力下降到足以分離的程度。③親合力較強(qiáng)時(shí)，用與配體競(jìng)爭(zhēng)的溶液或用蛋白質(zhì)變性劑洗脫。a、競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑；b、劇烈的洗脫條件（即蛋白質(zhì)變性）條件。第三十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日五、親和層析柱的再生洗脫結(jié)束后，應(yīng)連續(xù)用大量的洗脫液或高濃度的鹽溶液徹底洗滌柱子，再用平衡緩沖液將層析柱重新平衡。一般親和層析柱都可反復(fù)使用多次。木瓜蛋白酶的親和吸附劑（甘氨酰甘氨酰酪氨酰精氨酸－瓊脂糖）在4個(gè)月內(nèi)可使用20次。第三十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日六、純化大分子物質(zhì)實(shí)例

抗體、抗原及其結(jié)合物用于純化抗體、抗原及其結(jié)合物的配體主要由抗原（純化抗體）、抗體（純化抗原）和金色葡萄球菌蛋白A第三十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第四節(jié)離子交換層析一、離子交換層析的基本原理二、離子交換劑的分類、性質(zhì)三、離子交換劑與緩沖液的選擇四、離子交換劑的處理、再生、轉(zhuǎn)型五、分離物質(zhì)的交換六、物質(zhì)的洗脫與收集七、離子交換層析的應(yīng)用第三十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2、離子交換劑對(duì)溶液中離子的結(jié)合力：離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行，并都是可逆的。

RA＋B＋＝RB＋A＋

第三十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（1）離子交換劑的選擇性決定：結(jié)合力由平衡常數(shù)表示：若溶液中[A＋]的摩爾濃度與［B＋］相等時(shí)，則：①若K＞1，即［RB］＞［RA］，表示離子交換劑的結(jié)合力：B＋＞A＋；②若K＝1，即［RB］＝［RA］，表示離子交換劑的結(jié)合力：B＋＝A＋；③若K＜1，即［RB］＜［RA］，表示離子交換劑的結(jié)合力：B＋＜A＋；第三十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（2）反離子電荷平衡：①?gòu)?qiáng)酸性（陽性）離子交換劑對(duì)H＋的結(jié)合力比對(duì)Na＋的??；弱酸性離子交換劑相反；②強(qiáng)堿性（陰性）離子交換劑對(duì)OH－的結(jié)合力比對(duì)Cl－的??；弱堿性離子交換劑相反；第三十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日(3)與水合離子有關(guān)：A、與水合離子的電量成正比，而與離子半徑的平方成反比。B、離子間電荷相同時(shí)，則離子的原子序數(shù)越高，水合離子半徑越小，結(jié)合力也越大。C、稀溶液中離子發(fā)生水化時(shí)，各種陰、陽離子結(jié)合力大小的排列：一價(jià)離子：Li+

＜Na+

＜K+

＜Rb+

＜Cs+(對(duì)陽離子交換劑)二價(jià)離子：Mg2+

＜Ca2+

＜Sr2+

＜Ba2+(對(duì)陽離子交換劑)一價(jià)陰離子：F－＜Cl－

＜Br－

＜I－(對(duì)陰離子交換劑)不同價(jià)陽離子：Na+

＜Ca2+

＜Al3+

＜Ti4+(對(duì)陽離子交換劑)第四十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（4）兩性離子的蛋白質(zhì)、酶類、多肽、核苷酸等物質(zhì)

與離子交換劑的結(jié)合力主要取決于該物質(zhì)的理化性質(zhì)和在特定PH條件下呈的離子狀態(tài):當(dāng)pH低于pI時(shí)，物質(zhì)被陽離子交換劑吸附；當(dāng)pH高于pI時(shí)，物質(zhì)被陰離子交換劑吸附;若在相同的pH條件下，且PI大于PH時(shí)，PI越高，堿性越強(qiáng)就越容易被陽離子交換劑吸附;對(duì)呈膠體狀態(tài)的大分子物質(zhì)一般采用選擇性好的弱酸性離子交換劑。

第四十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日3、基本原理

離子交換層析（Ionexchangechromatography,IEC）是根據(jù)離子交換劑對(duì)各種無機(jī)離子、有機(jī)離子和生命大分子的結(jié)合力不同，弱結(jié)合力物質(zhì)先洗脫出，強(qiáng)結(jié)合力后洗脫出。離子交換層析示意圖平衡階段：離子交換劑與反離子結(jié)合吸附階段：樣品與反離子交換再生階段：起始平衡液洗滌解吸附階段第四十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日二、離子交換劑的分類、性質(zhì)1、分類：根據(jù)離子交換劑中基質(zhì)的組成和性質(zhì)，可分為兩大類：疏水性離子交換劑和親水性離子交換劑（1）疏水性離子交換劑：基質(zhì)是人工能夠合成、與水結(jié)合力小的樹脂物質(zhì)（苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物），交換樹脂引入的電荷基團(tuán)不同：A、陽離子交換劑：電荷基團(tuán)帶負(fù)電，反離子帶正電。可以與溶液中的正電荷化合物或陽離子進(jìn)行交換反應(yīng)。又可分為強(qiáng)酸型、中強(qiáng)酸型、弱酸型。第四十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

疏水性離子交換劑因含有大量活性基團(tuán)、交換容量高、機(jī)械強(qiáng)度大、流動(dòng)速度快，主要用于分離無機(jī)離子、有機(jī)酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物質(zhì)；其次可用于從蛋白質(zhì)溶液中除去表面活性劑、尿素和兩性電解質(zhì)或分離不易變性的蛋白質(zhì)。B、陰離子交換劑：樹脂中分別引入季胺、叔胺、仲胺和伯胺基團(tuán)構(gòu)成。引入季胺、叔胺基團(tuán)，分別為強(qiáng)、中強(qiáng)陰性離子交換劑；引入仲胺和伯胺基團(tuán)時(shí)，為弱陰性離子交換劑。第四十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日（2）親水性離子交換劑：常用基質(zhì)有纖維素、交聯(lián)纖維素、交聯(lián)葡聚糖和交聯(lián)瓊脂糖。A、纖維素離子交換劑：按引入基團(tuán)的性質(zhì)可分為強(qiáng)酸性、弱酸性、強(qiáng)堿性、弱堿性離子交換劑。如弱陰離子交換劑DEAE－C或DEAD－Sephacel；B、交聯(lián)葡聚糖離子交換劑：以交聯(lián)葡聚糖G－25和G－50為基質(zhì)，引入電荷基團(tuán)制成，有交聯(lián)葡聚糖陽性和陰性交換劑。對(duì)蛋白質(zhì)和核酸等大分子有較高的結(jié)合量，流速比纖維素離子交換劑快。C、瓊脂糖離子交換劑：以交聯(lián)瓊脂糖CL-6B（SepharoseCL-6B）等為基質(zhì)，如DEAE－SepharoseCL-6B為陰離子交換劑，CM－SepharoseCL-6B為陽離子交換劑。第四十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2、性質(zhì)：（1）顏色和形狀（2）交聯(lián)度（3）吸水量或膨脹度：基質(zhì)、電荷基團(tuán)、溶液離子強(qiáng)度和PH（4）交換容量：（5）穩(wěn)定劑：（6）比重（7）流速第四十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日三、離子交換劑與緩沖液的選擇1、離子交換劑的選擇A、分離物質(zhì)帶正電荷，選擇陽離子交換劑；B、分離物質(zhì)帶負(fù)電荷，選擇陰離子交換劑；C、分離物質(zhì)為兩性離子，應(yīng)根據(jù)其在穩(wěn)定的PH范圍內(nèi)所帶電荷來選擇。如一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5，若該物質(zhì)在PH5－8穩(wěn)定，應(yīng)選陰離子交換劑，否則PH在5以下穩(wěn)定時(shí)，應(yīng)選擇陽離子交換劑。（1）陰、陽離子交換劑的選擇（2）強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇生物樣品通常采用弱性離子交換劑。（3）不同離子型交換劑的選擇

取決于離子交換劑對(duì)反離子的結(jié)合力，一般選擇結(jié)合力較小的反離子，以便提高交換容量。如強(qiáng)陽性和強(qiáng)陰性離子交換劑應(yīng)分別選擇H型和OH型，弱酸性和弱堿性離子交換劑應(yīng)分別選擇Na型和Cl型。（4）不同基質(zhì)離子型交換劑的選擇

在分離生命大分子物質(zhì)時(shí)，一般認(rèn)為親水性離子交換劑比疏水性離子交換劑更優(yōu)越，對(duì)大分子物質(zhì)的吸附和洗脫更溫和。

第四十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2、緩沖液的選擇

選用的起始緩沖液，其PH值和離子強(qiáng)度等能使樣品中有效成分與離子交換劑結(jié)合，而不能使樣品中雜質(zhì)與離子交換劑結(jié)合時(shí)，PH值一般比有效成分的PI值高一個(gè)單位（宜選用陰離子交換劑）或低一個(gè)單位（宜選陽離子交換劑），離子強(qiáng)度為0.1時(shí)，很快把有效成分和雜質(zhì)分開。選用的洗脫液，離子強(qiáng)度和PH值應(yīng)使有效成分從離子交換劑上解離下來，一般離子強(qiáng)度比起始緩沖液高，PH值是隨離子交換劑性質(zhì)變化而變化。第四十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日選擇緩沖液PH值的簡(jiǎn)便方法取10支5ml試管，各加入0.1gSephadex或1.5mlSepharose離子交換劑；用不同PH值（陰離子交換劑選PH5－9，陽離子交換劑選PH4－8）0.5mol/L緩沖液分別洗滌10次；用不同對(duì)應(yīng)的PH值0.05mlo/L(對(duì)Sephadex)或0.01mol/L(對(duì)Sepharose)緩沖液平衡5次（洗滌、平衡離心除去上清體）；加等量的待分離樣品于各管，緩慢混合5－10min，靜止沉淀；測(cè)定各管有效成分含量，繪制相應(yīng)圖譜，有效成分全部吸附的緩沖液的PH值。第四十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日2、離子交換劑的再生：

使用過的離子交換劑，可采用一定的方法使其恢復(fù)原來的性狀的這一過程。

離子交換劑由一種反離子轉(zhuǎn)到另一種反離子的過程。如使陽離子交換劑轉(zhuǎn)成鈉型，則用NaOH處理，轉(zhuǎn)成帶銨離子，則用NH4OH或NH4Cl處理。3、離子交換劑的轉(zhuǎn)型：第五十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日五、分離物質(zhì)的交換1、層析法（動(dòng)態(tài)法）：2、分批法（靜態(tài)法）：第五十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日六、物質(zhì)的洗脫與收集

常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，溶液的梯度則由鹽濃度或酸堿性的變化形成的，即增加離子強(qiáng)度的梯度溶液和改變PH值的梯度溶液（若為陽離子交換劑，PH值應(yīng)從低到高遞增；陰離子交換劑，則由高到低遞減）。收集洗脫體積一般以柱體積的1－2％為宜。第五十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日七、應(yīng)用1、制備、純化生化物質(zhì)例1：強(qiáng)陽離子交換樹脂732型分離單核苷酸AMP、CMP、GMP和UMP：樹脂用PH1.5的鹽酸溶液平衡，單核苷酸溶液用6mol/mlHCl調(diào)PH為1.5上柱。此PH時(shí)，AMP、CMP、GMP分子上的氨基酸解離帶正電荷，被樹脂吸附。而UMP無氨基則不解離，不被樹脂吸附直接流出。當(dāng)用無離子水洗脫時(shí)，隨著PH升高，GMP、CMP和AMP分子上的氨基酸解離程度產(chǎn)生差異，并按失去電荷的先后依次從樹脂上洗脫下來，分別吸收用紫外分光光度計(jì)測(cè)定含量。第五十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日例2：可以選擇的吸附分離多種離子型抗生素具有酸性基團(tuán)的抗生素：芐基青霉素、新生霉素（在中性或弱堿性條件下以負(fù)離子的形式存在，以陰離子交換劑樹脂提取分離）。具有堿性基團(tuán)的抗生素：紅霉素、鏈霉素、卡那霉素（在中性或弱酸性條件下以陽離子形式存在，以陽離子交換劑樹脂提取分離）。具有兩性的抗生素：四環(huán)素（在不同的PH條件下可形成正離子或負(fù)離子，可用陰離子交換樹脂或陽離子交換樹脂進(jìn)行分離與純化）第五十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日

根據(jù)蛋白質(zhì)與離子交換劑之間的結(jié)合力受PH影響的原理，其操作步驟：取400mg的QAE-SephadexA-50或SP-SephadexC-50浸泡在蒸餾水中進(jìn)行膨脹、漂洗；經(jīng)抽濾后，精確稱取500mg濕膠若干份，分別裝入5ml試管，每管用不同PH緩沖液洗滌5－10次，最后離心（2000rpm）除去上清液；分別加入1ml樣品溶液（用平衡液配制）反應(yīng)約10min。離心，取上清液加適量高濃度的緩沖液（PH7.0）,使各管溶液的PH一致，然后測(cè)定消光值（A280）或活力單位。以消光值為縱坐標(biāo)，以PH為橫坐標(biāo)，作圖測(cè)出樣品最高和最低的消光值對(duì)應(yīng)的PH值分別為YH和YL，則等電點(diǎn)PI為：

PI＝（YH＋YL）／22、測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)第五十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)電泳技術(shù)一、電泳技術(shù)基本原理二、聚丙烯酰胺凝膠電泳三、瓊酯糖凝膠電泳第五十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期日電泳分類顯微電泳：自由界面電泳：

膠體溶液的溶質(zhì)顆粒經(jīng)過電泳后，在膠體溶液和溶劑之間形成界面的電泳過程。區(qū)帶電泳：

樣品物質(zhì)在惰性支持物上進(jìn)行電泳形成不同的帶狀區(qū)間的電泳。根據(jù)支持物性質(zhì)不同:（1）僅起支持作用和抗擴(kuò)散、抗對(duì)流作用的物