生物物理學(xué)圓二色光譜

生物物理學(xué)圓二色光譜第一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日UVmChiral第二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日UVmPlane(linearly)polarizedlightChiral橢圓偏振光mOpticallyActiveSample第三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日m？第四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日4.1圓二色光譜的基本原理4.2圓二色光譜分析在生物學(xué)研究中的應(yīng)用4.3圓二色光譜實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)第五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日4.1圓二色光譜的基本原理4.2圓二色光譜分析在生物學(xué)研究中的應(yīng)用4.3圓二色光譜實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)第六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日WhatisaLight?

日月之輝第七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日第八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日16世紀(jì),Newton,光譜光譜：復(fù)色光經(jīng)色散系統(tǒng)分光后，按波長（或頻率）的大小依次排列的圖像上帝說要有光,于是有了牛頓。第九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日1916年,Einstein,激光1960-70,下村修,綠色熒光蛋白第十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日第十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日波長λ5×10-3～0.10.1～1010～200200～400名稱γ射線x射線遠(yuǎn)紫外光近紫外光波長λ400～750750～1.0×1061.0×106～1.0×1091.0×109～1.0×1012名稱可見光紅外光微波無線電波電磁波譜：將電磁輻射按照波長或頻率的大小順序排列起來即稱為電磁波譜第十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日1、自然光光具有波、粒二象性，是橫電磁波。只有橫波才有偏振現(xiàn)象:光矢量的振動(dòng)方向與光的傳播方向垂直，

在垂直于光傳播方向的平面內(nèi),有不同的振動(dòng)方向。電場(chǎng)矢量E和磁場(chǎng)矢量H互相垂直、相位相同。v0HE第十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日第十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日雙折射現(xiàn)象：一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光。自然光入射到某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）時(shí)，晶片吸收振動(dòng)面與晶軸垂直的光，而只允許振動(dòng)面平行于晶軸的光通過。2、光的偏振第十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日自然光平面偏振光起偏器檢偏器晶軸相互平行時(shí)，透射光強(qiáng)度最大；晶軸相互垂直時(shí)，透射光強(qiáng)度為零；晶軸夾角為α?xí)r，透射光強(qiáng)度與cos2α成正比。.................第十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日也稱線（完全）偏振光，簡(jiǎn)稱偏振光。它的振動(dòng)面稱為其偏振面。振動(dòng)方向保持不變振幅發(fā)生周期性變化E之端點(diǎn)在空間的軌跡為一平面正弦曲線投影到垂直于光傳播方向的平面上為一直線段3、平面偏振光（Planepolarizedlight）第十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日振幅保持不變，而方向周期變化，電場(chǎng)矢量繞傳播方向螺旋前進(jìn)4、圓偏振光（Circularpolarizedlight）第十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日朝光源看，電場(chǎng)矢量方向按順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為右圓偏振光；電場(chǎng)矢量方向按逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為左圓偏振光。第十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日一束自然光可以看作是兩束相互垂直而沒有相位關(guān)系的平面偏振光的加和。平面偏振光可以分解成兩束相位相等而旋轉(zhuǎn)方向相反的圓偏振光的加和。兩束相互垂直且相位相差1/4波長的平面偏振光可以加和成一束圓偏振光。當(dāng)振幅相等，并同步的左、右圓偏振光相加，則產(chǎn)生平面偏振光；如果這兩束圓偏振光的振幅不等則產(chǎn)生橢圓偏振光(ellipticallypolarizedlight)。5、光的疊加原理第二十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日XY頻率相同

方向相反振幅相同

相位相同線偏振光參照面第二十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日頻率相同

方向相反振幅相同相位不同線偏振光2參照面1第二十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日振幅相等、振動(dòng)方向相互垂直、相位相差1/4波長的兩平面偏振光合成圓偏振光右旋第二十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日yy’axx’RL橢圓偏振光頻率相同

方向相反振幅不同

相位不同參照面21第二十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日旋轉(zhuǎn)方向相反的左、右圓偏振光透過一光學(xué)活性物質(zhì)后透過的左、右圓偏振光振幅相位矢量和相等相同平面偏振光相等不同平面偏振光，方向改變不等相同橢圓偏振光不等不同橢圓偏振光，方向改變第二十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日旋光性：光學(xué)活性分子對(duì)左、右圓偏光的折射率不同，透射光雖然仍然為平面偏振光，但其偏振面旋轉(zhuǎn)了一定的角度。旋光物質(zhì)又稱為光學(xué)活性物質(zhì)。旋光度：偏振面旋轉(zhuǎn)的角度

旋光色散：不同波長的偏振光的旋轉(zhuǎn)角度不同。旋光儀是測(cè)量旋光性與波長的函數(shù)關(guān)系，從而得到一個(gè)旋光色散譜。6、旋光色散（Opticalrotatorydispersion）第二十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)A雙折射：某個(gè)物質(zhì)對(duì)于左、右圓偏振光的折射率分別為nL和nR，

若

nL=nR，則為光學(xué)各向同性物質(zhì)；若

nL≠nR，則為光學(xué)各向異性物質(zhì)；左、右圓偏振光的相位改變，若nL＞nR，透射光的偏振面右旋。若nL＜nR，透射光的偏振面左旋。旋光現(xiàn)象是圓雙折射的一種特殊形式。旋光物質(zhì)使左、右圓偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，旋光現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于光學(xué)各向異性物質(zhì)的折射率nL≠nR的結(jié)果。第二十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日光的吸收若溶液中的溶質(zhì)對(duì)某一波長的入射光有吸收，則透射光的光強(qiáng)度小于入射光。7、光的吸收和圓二色性（Circulardichroism，CD）第二十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日橢圓偏振光OpticallyActiveSampleChiralPlane(linearly)polarizedlightRightandLefthandcircularlypolarizedlightPreferentialabsorptionoflefthandpolarized?第二十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)A二色性的存在將通過該物質(zhì)傳播的左、右圓偏振光變成橢圓偏振光，并且只在發(fā)生吸收的波長處才能觀察到。第三十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)A二色性與橢圓率

A=lgI0/I=(1/2,303)lnI0/I=εCLBeer-LanmbertLaw

=2.303

A/4(弧度)ΔA=AL-

AR=Δε

C

LLOpticalactiveobjectEx=E0

cos[ωt-(2L/λ)n

+φ0]

?第三十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日C:

摩爾濃度L:

光程(dm)[]l:

[deg?mol-1?cm-1]

or

[deg?cm2?dmol-1]

摩爾橢圓率[],[]

l

themolarellipticity[]lMRw

=MRw

[y]l

/100比橢圓率[y]l

thespecificellipticity平均殘基橢圓率[]lMRw

themeanresidue

ellipticity[]l=Mw

[y]l

/100[]

=

/CL第三十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日同時(shí)產(chǎn)生包括同樣的分子結(jié)構(gòu)信息：光學(xué)活性物質(zhì)分子中的不對(duì)稱生色團(tuán)。CD反映光與分子間能量的交換，旋光性則是與分子中電子的運(yùn)動(dòng)有關(guān)?？梢杂蒏ronig-Krammers轉(zhuǎn)換方程相互轉(zhuǎn)換。8、ORD與CD光譜第三十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日CD譜的極值處與吸收峰一致（科頓效應(yīng)，cottoneffect），因而分子中不同生色團(tuán)對(duì)于譜的貢獻(xiàn)比在ORD中更容易分辨。ORD是漸近線，兩端不回歸ORDCD吸收帶附近，旋光度由負(fù)到正正Cotton效應(yīng)正CD帶吸收帶附近，旋光度由正到負(fù)負(fù)Cotton效應(yīng)負(fù)CD帶第三十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日CD比ORD容易辨別重疊峰CD比ORD弱帶易檢測(cè)CD比ORD更容易擬合CD比ORD提供較多意義明確的信息表明有三個(gè)生色團(tuán)，其中兩個(gè)有光學(xué)活性第三十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日S1-S2:第一級(jí)單色器；S2-S3:第二級(jí)單色器;M：球面反光鏡；P：晶體石英棱鏡；L:透鏡；F:濾光器；9、J-810圓二色光譜儀第三十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日PeltierCellHolderCD/TotalFluorescenceFMOStoppedFlow-20～200℃第三十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日4.1圓二色光譜的基本原理4.2圓二色光譜分析在生物學(xué)研究中的應(yīng)用4.3圓二色光譜實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)第三十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Thepeptidebondisinherentlyasymmetricandisalwaysopticallyactive蛋白質(zhì)的光學(xué)活性第三十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日1、氨基酸的圓二色性可見光區(qū)：各種氨基酸都沒有光吸收。紫外光區(qū)：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。氨基酸分子內(nèi)的紫外生色基團(tuán)：吲哚基、酚羥基、苯基、二硫鍵、咪唑基和羧基等。2、肽的圓二色譜活性肽構(gòu)象與其生理功能的關(guān)系肽的構(gòu)象也是蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種模型。肽的圓二色性為研究肽在溶液中的構(gòu)象提供了重要信息。第四十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Far-UV(250-170nm)

SecondaryStructure:α-helix,β-sheet,β-turn,random

TertiaryStructureClass:all-α,α+β,α/β,all-βI,all-βIINear-UV(320-250nm)：aromaticsidechainNear-UV~Near-infrared(300-1000nm)：coloredproteins第四十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日苯丙氨酸（phenylalanine，

Phe）：255、261和268nm附近；酪氨酸（tyrosine，

Tyr）：277nm左右；色氨酸（tryptophan，

Trp）：279、284和291nm附近；二硫鍵的變化反映在整個(gè)近紫外區(qū)。芳香氨基酸殘基及二硫鍵處于不對(duì)稱微環(huán)境時(shí)，在近紫外區(qū)表現(xiàn)出CD信號(hào)第四十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日NearUVCDspectrum蛋白質(zhì)中芳香氨基酸殘基，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫鍵處于不對(duì)稱微環(huán)境時(shí)，在近紫外區(qū)250～320nm，表現(xiàn)出CD信號(hào)。Phe殘基:255、261和268nm附近；Tyr殘基:277nm左右；而在279、284和291nm是Trp殘基的信息；二硫鍵的變化信息反映在整個(gè)近紫外CD譜上。近紫外CD譜可作為一種靈敏的光譜探針，反映Trp、Tyr和Phe及二硫鍵所處微環(huán)境的擾動(dòng)，能用來研究蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)精細(xì)變化。第四十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日FarUVCDspectraofpoly-L-Lys1、100%α-螺旋2、100%β-折疊3、100%無規(guī)卷曲第四十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日CDapplicationSecondarystructureofmacromoleculea-helixa-helix:19xnm(+)208nm,222nm(-)[q]xE-30200210220230240nmb-sheet:195nm(+)antiparallel:redshiftparallel:blueshift215-7nm(-)b-sheetUnorderedstructure:(-)below200nm(+)218nmweakbandunorderedb-turn:180-190nm(-)200-205nm(+)225nm(+)band,weakredshift第四十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日MainCDfeaturesofprotein2ndarystructures-band(nm)+band(nm)α-helix222208192β-sheet216195β-turn220-230(weak)180-190(strong)205polyproIIhelix190210-230weakRandomcoil200212第四十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日第四十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日3、估算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量?jī)H適合α-Helix含量較高的蛋白質(zhì)！將測(cè)得的CD曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。xa+xb+xc=1.0qt=xaqa+xbqb+xcqc改變xa、xb和xc，使qt與樣本曲線最佳擬合（最小二乘法，leastsquaresminimization）未知結(jié)構(gòu)的蛋白的CD信號(hào)第四十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日myoglobin

qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith

xa=80%

xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coilForfurtherdetails:/cd/cdtutorial.htm第四十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日GCN4-p1

0oC：100%helix 75oC：0%helixwhatabout50oC?

qt=xoqo+x75q75fitsbestwith

xo

=50%

x75=50%

Showsthatat50oC

1/2ofpeptidea-helixdimer 1/2ofpeptiderandomcoilmonomer第五十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日BestfittingproceduresusemanydifferentproteinsforstandardspectraTherearemanydifferentalgorithms.Allrelyonusingupto20CDspectraofproteinsofknownstructure.Bymixingthesetogetherafitspectraisobtainedforanunknown.Forfulldetailssee Dichroweb:theonlineCDanalysistool

www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/Cangenerallygetaccuraciesof

0.97forhelices, 0.75forbetasheet, 0.50forturns,and 0.89forotherstructuretypes(Manavalan&Johnson,1987,Anal.Biochem.167,76-85).第五十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日LimitationsofCDsecondarystructureanalysisThesimpledeconvolutionofaCDspectruminto4or5componentswhichdonotvaryfromoneproteintoanotherisagrossover-simplification.ThereferenceCDspectracorrespondingto100%helix,sheet,turnetcarenotdirectlyapplicabletoproteinswhichcontainshortsectionsofthevariousstructurese.g.TheCDofanα-helixisknowntoincreasewithincreasinghelixlength,CDofβ-sheetsareverysensitivetoenvironment&geometry.FarUVcurves(>275nm)cancontaincontributionsfromaromaticamino-acids,inpracticeCDismeasuredatwavelengthsbelowthis.TheshapesoffarUVCDcurvesdependontertiaryaswellassecondarystructure.第五十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日ApplicationsofCDinstructuralbiologyDeterminationofsecondarystructureofproteinsthatcannotbecrystallisedInvestigationoftheeffectofe.g.drugbindingonproteinsecondarystructureDynamicprocesses,teinfoldingStudiesoftheeffectsofenvironmentonproteinstructureSecondarystructureandsuper-secondarystructureofmembraneproteinsStudyofligand-inducedconformationalchangesCarbohydrateconformationInvestigationsofprotein-proteinandprotein-nucleicacidinteractionsFoldrecognition

第五十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日克山病探究-硒缺乏模型動(dòng)物心肌線粒體膜的CD譜[]正常對(duì)照病區(qū)糧病區(qū)糧,補(bǔ)加蔬菜第五十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日煙草花葉病毒侵染膜蛋白第五十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Aβ40蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變--------withcholesterolwithoutcholesterol第五十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Unfolding/folding216nm222nm第五十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Conformationalvaries190200210220230240250260-1.5-1.0-0.50.00.51.01.52.0

a5in5%SDS/PBSa5in50%TFE/PBSa5inpH7a5in50%TFE/H2Oa5inH2O[|è]X1E-4deg.cm2/dmol-1wavelength(nm)216nm第五十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日

CDspectraofGCN4leucinezipperinthepresenceofdifferentconcentrationsofSDSLeucinezipperpeptidewastreatedwithSDSfor5min.ItsCDspectrawasthenmeasuredatafinalpeptideconcentrationof20μM.ThefinalSDSconcentrationswere0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.6,1.0,1.2mMforcurves1,2,3,4,5,6,7,and8,respectively.Curve9isforthecompletelyunfoldedpeptidetreatedwith4Mguanidiniumchloride.Theexperimentswerecarriedoutat20oC.第五十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Conformationaltransition:

fromalpha-helixrichtobeta-sheetrichPrPc

PrPscScout第六十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日NearUVspectra:toinvestigatethetertiarystructure第六十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日

Lau,TanejaandHodges(1984)J.Biol.Chem.259:13253-13261螺旋二聚體分解為單螺旋三氟乙醇（trifluoroethanol，TFE）誘導(dǎo)肽鏈形成螺旋TFE對(duì)卷曲螺旋（coiled-coil）的影響第六十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日——chymotrypsin(allβ)——lysozyme(α+β)——triosephosphateisomerase(α/β)——myoglobin(allα)CDsignalofaproteindependsonits2ndarystructure第六十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日pH變化引起的肌球素變性前后CD譜的動(dòng)力學(xué)變化第六十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日稀釋前后的熒光和CD譜從伸展到折疊α螺旋含量的變化的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)KineticTraceat222nm(secondarystructureregion)Unfoldingstate(random)Refoldingstate(α-Helix)第六十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Kinetictracesat289nm(Aromaticsidechainregion)細(xì)胞色素c伸展和折疊狀態(tài)的CD和熒光光譜反映了芳環(huán)側(cè)鏈（色氨酸殘基）的變化鹽酸胍中的細(xì)胞色素c(伸展?fàn)顟B(tài))與PBS混合后的CD和熒光光譜第六十六頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日4.1圓二色光譜的基本原理4.2圓二色光譜分析在生物學(xué)研究中的應(yīng)用4.3圓二色光譜實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)第六十七頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日SampleconcentrationAgoodsuggestionistoruninadvanceanabsorptionUV-VISspectra.CDspectroscopycallsforsamerequirementsasUV-VIS:bestS/Nisobtainedwithabsorbancelevelintherange0.6to1.2.It’susuallydifficulttogetproperdatawhenabsorbance(ofsample+solvent)isover2O.D.第六十八頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日樣品杯：高度均勻的熔融石英，不會(huì)帶來附加的圓二色性。光程：0.01cm-1cm，為了降低溶劑影響，一般提高樣品濃度，用短光程。cellpathlength第六十九頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日NitrogenflushingFlushingtheopticswithdrynitrogenisamust:Xelamphasaquartzenvelope,soifoperatedinairit’lldevelopalotofozone,harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiation第七十頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日HTplotTheHTplotisveryimportant,sincereadingsabove600-650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired.theHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample,sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance.BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible.AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection,loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel.第七十一頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日第七十二頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Bandwidth(SBW)selectionSettingofslitsshouldbeaslargeaspossible(todecreasenoiselevel),butcompatibletothenaturalbandwidth(NBW)ofthebandstobescanned.AsaruleSBWshouldbekeptatleast1/10oftheNBW,otherwisethebandwillbedistorted.IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection.Tradeinofaccuracyversussensitivity(i.e.theuseoflargerthantheoreticalSBW)isoccasionallyrequired.2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion(wherefinestructuresmaybepresent),optimalband-pass(aslargeaspossible,butnotloosinginformation)canbedeterminedafteratrial第七十三頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日標(biāo)準(zhǔn)操作時(shí)譜帶寬度選為1nm；遠(yuǎn)UV區(qū)（2nm），芳香族氨基酸區(qū)（1nm）高分辨率測(cè)量用較窄的狹縫寬度，此時(shí)PMT電壓較高，信噪比差；當(dāng)樣品的光密度很高、CD很小時(shí)，就要保持測(cè)試CD峰多需要的足夠濃度，并用較寬的狹縫寬度。此時(shí)，由于樣品OD值過高，可能存在有熒光或雜散光引起的某些假象。第七十四頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日Numberofdatapointdatapitch,i.e.numberofdatapointspernm,willnotdirectlyinfluencethenoiselevel.Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise,it’sadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithm第七十五頁，共八十一頁，編輯于2023年，星期日AccumulationanotherwaytoimproveS/Nistoaveragemorespectra.HeretootheS/Nwillimprovewiththesquareroo