真菌毒素的檢測(cè)

真菌毒素的檢測(cè)第一頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第二頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日真菌毒素的種類黃曲霉素(AF)、赭曲霉素(OA)、單端孢酶烯族毒素、玉米赤霉烯酮(ZEA).真菌毒素毒性：（1）致DNA損傷，有的致癌；（2）細(xì)胞毒性，有的破壞質(zhì)膜和細(xì)胞酶的作用

第三頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第二節(jié)真菌毒素檢測(cè)中樣品前處理方法一、采樣和樣品的準(zhǔn)備采樣是真菌毒素測(cè)定中一個(gè)非常重要的步驟。1.采樣的地點(diǎn)根據(jù)分析目的的不同確定采樣地點(diǎn)，如：農(nóng)田、倉(cāng)庫(kù)、加工廠、運(yùn)輸工具、零售商和醫(yī)院等。第四頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.2.采樣方法（1）靜態(tài)樣品的采集靜態(tài)樣品：麻袋、箱柜和車廂等容器存放分樣品均屬靜態(tài)樣品。采樣工具：頂端尖銳的長(zhǎng)柄采樣釬子。采樣數(shù)量：（1）小批量時(shí)所采麻袋數(shù)為批內(nèi)麻袋數(shù)的1/4；（2）大批量時(shí)為整批麻袋數(shù)開平方（3）采樣量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過分析所需量時(shí)，應(yīng)將樣品充分混合后，按四分法對(duì)角連續(xù)多次分樣縮減導(dǎo)需要的量，一般，1000kg農(nóng)產(chǎn)品中的采樣量為幾百克。第五頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（2）動(dòng)態(tài)樣品的采集大批糧食在一個(gè)糧庫(kù)中從一處向另一處用傳送帶轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，利用商品化的十字交叉切分自動(dòng)采樣器從運(yùn)動(dòng)著的傳送帶上采集樣品幾乎可以達(dá)到真正意義上的隨機(jī)取樣。十字交叉切分自動(dòng)采樣器遵循的原則：（1）采樣杯的開口應(yīng)與樣品流動(dòng)方向垂直；（2）樣品必須全部流經(jīng)杯口；（3）采樣杯口應(yīng)足夠?qū)?/p>

S=DLTVS：采集樣品的大?。籇采樣口的寬度cm；L采樣量kg；T：采樣時(shí)間間隔s；V:為杯子運(yùn)動(dòng)速度，cm/s.第六頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日3.采樣量采大樣，按四分發(fā)對(duì)角連續(xù)多次分樣縮減至1－2kg，最后取代表樣全部粉碎。美國(guó)農(nóng)業(yè)部USDA的方法：成批樣每批取3份大樣，每份22kg。第七頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.4.實(shí)驗(yàn)室分析用樣品的采樣和樣品準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室分析用的樣品為1－5kg。第八頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日二.提取1.提取溶劑溶劑的選擇取決于待測(cè)毒素的種類、毒素性質(zhì)、毒素在提取溶劑中的溶解度、提取溶劑的毒性價(jià)格、非測(cè)定成分在提取溶劑中的分配系數(shù)等。選用：毒性小、極性大、價(jià)格低廉的溶劑系統(tǒng)常用溶劑：甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一種或多種不同配比的混合物。第九頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日2.提取溫度溫度影響毒素的回收率。適當(dāng)升高溫度可以增加毒素的回收率。第十頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日3.食品基質(zhì)固體食品：選用浸劑、洗脫、索氏回流等方法。液體食品：液－液分配方法。提取酸性真菌毒素時(shí)，通常需提高提取溶劑系統(tǒng)中水相的PH值，使其有效地將被提取物堿化或形成水溶性堿混合物后，再進(jìn)行提取。第十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日三.純化純化：在確保不損失待測(cè)毒素的前提下除去干擾雜質(zhì)，過程稱為純化。常用凈化方法：液－固萃取、液－液分配、化學(xué)吸附、色譜法、透析法以及SFE法等。使用最廣泛的是色譜法。第十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.色譜法：薄層色譜法（柱色譜法最常用）吸附色譜柱常用的吸附劑：硅膠、礬土、氧化鋁、活性炭、弗羅里硅土分配色譜柱常用的填充劑：硅藻土、纖維素。固相提?。◤V泛采用）免疫親和柱IAC（應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品的新技術(shù)）第十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第三節(jié)真菌毒素的儀器分析一.薄層色譜法（TLC):1.原理樣品經(jīng)提取、凈化、薄層分離后，某些真菌毒素在紫外光下，產(chǎn)生特定的熒光，以標(biāo)準(zhǔn)品作參比，根據(jù)其在薄層上顯示的熒光的最低檢出量來定量。適用于本身能夠產(chǎn)生熒光的真菌毒素。如：AFB、OTA優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、對(duì)設(shè)備和檢驗(yàn)人員要求不高。第十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日二.高效液相色譜法（HPLC）原理：樣品中的真菌毒素經(jīng)柱層析分離后，通過測(cè)量色譜峰的面積定量。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確。分析時(shí)應(yīng)考慮流動(dòng)相、色譜柱、柱溫和檢測(cè)器等分析條件，找出最佳配比。有熒光的用熒光檢測(cè)器B類單端孢霉烯族化合物本身不產(chǎn)生熒光，但C6位置上有酮基，雖不能用HPLC配熒光檢測(cè)器，但可配紫外檢測(cè)器檢測(cè)。第十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日3.應(yīng)用選用液相色譜－熒光分光光度法是定量測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮污染最可靠、亦是最常用的方法。第十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（1）玉米赤霉烯酮的測(cè)定①樣品的提取用甲醇、乙醇、水混合液提取，提取液經(jīng)液－液分配萃取，硅鎂吸附劑柱層析純化后，供液相色譜法檢測(cè)。第十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.②色譜條件：液相色譜柱：125mm×4.6mm（內(nèi)徑），不銹鋼制，內(nèi)填5umODS，操作時(shí)柱前串聯(lián)安裝40mm×4.6mm內(nèi)徑、填料20umODS的保護(hù)柱，，用反向柱ODS分離，流動(dòng)相為甲醇或甲醇與水混合液。第十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.③測(cè)定方法收集上述樣品提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40度下?lián)]發(fā)掉有機(jī)溶劑，用甲醇定容至一固定體積，取適量提取液注入到液相色譜儀中，通過工作站得到檢測(cè)值。流動(dòng)相:甲醇、水混合液提取,流速0.6mL/min,熒光分光光度檢測(cè)器波長(zhǎng)：276nm，發(fā)射波長(zhǎng)：460nm，檢測(cè)波長(zhǎng)：236nm④測(cè)定結(jié)果。第十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（2）伏馬菌素的測(cè)定由于伏馬菌素的極性較大，一般采用強(qiáng)極性溶劑萃取，然后用固體吸附劑去除雜質(zhì)，將洗脫劑蒸干后，用甲醇溶解殘?jiān)┓治鲇?。第二十?yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.①色譜條件流動(dòng)相：乙睛－水－三氯乙酸（5：95：0.025）C18柱為分離柱波長(zhǎng)：230nm直接進(jìn)行紫外檢測(cè)，乙睛－水（80：20）為流動(dòng)相，流速1mL/min，進(jìn)樣量5uL。②測(cè)定結(jié)果第二十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日三.氣相色譜法（GC）1.研究進(jìn)展單端孢菌毒素的GC分析方法得到廣泛應(yīng)用。主要用于分析分子中不含發(fā)色集團(tuán)和熒光基團(tuán)，或具有弱熒光或弱吸收的真菌毒素。第二十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.2.應(yīng)用（1）赭曲霉素的GC測(cè)定赭曲霉毒素A首先被轉(zhuǎn)化成鄰甲基赭曲霉毒素A甲醚衍生物，然后用毛細(xì)管GC－NICI-MS進(jìn)行鑒定，定量分析時(shí)，要使用多離子檢測(cè)和六氘化赭曲霉毒素A甲醚作為內(nèi)標(biāo)，MS電離方法是負(fù)離子化學(xué)電離。第二十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（2）GC（電子捕獲器）測(cè)定10種單端孢霉烯族毒素。（3）GC測(cè)定A類單端孢霉烯族真菌毒素的所有方法比較第二十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日四.免疫化學(xué)分析法免疫反應(yīng)：就是指抗原和抗體分子的結(jié)合，這種結(jié)合形式可以是游離的，也可以結(jié)合在細(xì)胞表面，抗原抗體復(fù)合物的形成要求二者分子結(jié)構(gòu)有互補(bǔ)性、抗原與抗體的結(jié)合也因此具有高度特異性。優(yōu)點(diǎn)：高度特異性、高靈敏度、快速簡(jiǎn)便等?？梢栽诮M織、細(xì)胞和生物分子等上應(yīng)用。第二十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日..免疫化學(xué)分析方法放射免疫檢測(cè)法酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）第二十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.1.放射免疫檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同位素標(biāo)記后與樣品混合，加入定量特異性抗體后對(duì)抗原抗體復(fù)合物的放射性計(jì)數(shù)，根據(jù)結(jié)果計(jì)算樣品種的抗原濃度，復(fù)合物的放射性強(qiáng)度與樣品種的抗原濃度成正比。優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)、靈敏度高缺點(diǎn)：使用放射性標(biāo)準(zhǔn)品、有放射性污染，標(biāo)準(zhǔn)試劑壽命短，必須與液體閃爍計(jì)數(shù)器等昂貴儀器聯(lián)合使用，不便在基層推廣。第二十七頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.2.酶聯(lián)免疫吸附法優(yōu)點(diǎn)：靈敏、操作簡(jiǎn)便、樣品前處理無需凈化。第二十八頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（1）酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)真菌毒素的技術(shù)要點(diǎn)：第一，抗原（抗體）能結(jié)合到固相載體的表面并保持免疫活性；第二，抗體（抗原）與酶結(jié)合所形成的結(jié)合仍然保持免疫活性和酶的活性；第三，結(jié)合物與相應(yīng)的抗原（抗體）反應(yīng)后，結(jié)合的酶仍能催化底物生成有色物質(zhì)，顏色的深淺可定量抗原（抗體）的含量。第二十九頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.要使ELISA測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，必須按規(guī)定的方法制備試劑。一般試劑：包被緩沖液、洗滌液、標(biāo)本稀釋液、結(jié)合物稀釋液、底物工作液和酶反應(yīng)終止液等。第三十頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日ELISA測(cè)定方法①加樣②保溫③洗滌④比色第三十一頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日第四節(jié)常見真菌毒素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其檢測(cè)方法一.黃曲霉素毒性：致癌性、致突變性、致畸形均居首位。無色、無嗅、無味，易溶于黃曲霉素的檢測(cè)（視頻）：ELISA第三十二頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（2）赭曲霉毒素毒性：主要對(duì)腎產(chǎn)生危害，造成腎腫大，當(dāng)濃度超過5mg/kg時(shí)，對(duì)肝臟組織和腸道產(chǎn)生破壞，引起腸炎等。無色結(jié)晶化合物，易溶于極性溶劑和稀的碳酸氫鈉水溶液腫，微溶于水，在紫外光照射下，呈綠色熒光，該化合物穩(wěn)定，在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破壞，但在谷物中隨時(shí)間延長(zhǎng)而降解。存在于：糧谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草藥、調(diào)味料、啤酒等。檢測(cè)方法：液相色譜法、薄層層析法第三十三頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（3）雜色曲酶毒素毒性：引起腫瘤污染：小麥、大麥、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等。易溶于氯仿、苯、吡啶、乙睛和二甲基亞砜，微溶于甲醇、乙醇，不溶于水和堿性溶液。在紫外線照射下，具有磚紅色熒光。檢測(cè)方法：薄層法，紫外分光光度計(jì)測(cè)定第三十四頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（4）伏馬菌素自然界中最為普遍，毒性強(qiáng)，損傷肝腎功能。白色粉末，易溶于水、甲醇、乙睛等溶劑中，在甲醇溶液中不穩(wěn)定，在乙睛水溶液中非常穩(wěn)定。檢測(cè)方法：高效液相色譜法第三十五頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（5）單端孢霉烯族化合物頭孢菌、鐮孢菌、木霉菌等。侵害玉米、小麥、大米、燕麥、大麥等。無色結(jié)晶、在常溫下非常穩(wěn)定，難溶于水，溶于極性溶劑，在烹調(diào)等加熱過程中不會(huì)被破壞，在紫外光下不顯熒光。但T-2毒素在紫外光下產(chǎn)生一種具有藍(lán)色熒光物質(zhì)檢測(cè)方法：薄層法第三十六頁(yè)，共三十八頁(yè)，編輯于2023年，星期日.（6）玉米赤霉烯酮禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、木賊鐮刀菌具有類似雌激素的作用，可與雌激素受體結(jié)合而影響細(xì)胞核的雌激素轉(zhuǎn)錄，刺激含雌激素受體的乳腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)。是一種白色結(jié)晶化合物，不溶于水、二硫化碳禾四氯化碳，微溶于石油醚（30－60），溶于堿性