第九章原生質(zhì)體育種

第九章原生質(zhì)體育種第一頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一原生質(zhì)體育種微生物原生質(zhì)體融合育種細(xì)菌原生質(zhì)體融合育種放線菌原生質(zhì)體融合育種酵母菌原生質(zhì)體融合育種霉菌原生質(zhì)體融合育種第二頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一節(jié)原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體具有的新特性：1、對(duì)誘變劑敏感2、對(duì)噬菌體不敏感3、不受感受態(tài)影響什么是原生質(zhì)體？包括：原生質(zhì)體再生育種，原生質(zhì)體誘變育種，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種，原生質(zhì)體融合育種及其他原生質(zhì)體育種。第三頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、微生物原生質(zhì)體再生育種

1．原生質(zhì)體再生育種的一般程序：出發(fā)菌株的選擇→菌種活化和預(yù)培養(yǎng)→原生質(zhì)體制備→原生質(zhì)體再生→高產(chǎn)菌株分離（初篩）→復(fù)篩→遺傳穩(wěn)定性鑒定→菌種特性及發(fā)酵特性研究。2．原生質(zhì)體再生育種實(shí)例

小單孢菌福堤霉素微生物制備原生質(zhì)體后直接再生，從再生菌落中分離篩選變異菌株，最終得到優(yōu)良性狀提高的正突變株。

敏感，細(xì)胞壁的重建和分裂能力的再生，對(duì)數(shù)期細(xì)胞，不需要遺傳標(biāo)記第四頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、微生物原生質(zhì)體誘變育種（一）原生質(zhì)體誘變育種方法1．物理誘變劑誘變?cè)|(zhì)體的一般程序：

取10ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期微生物培養(yǎng)物，離心收集菌體，無(wú)菌水洗滌→離心，菌體沉淀物用酶液懸浮，水解去壁制成原生質(zhì)體→離心，高滲溶液洗滌原生質(zhì)體→原生質(zhì)體懸浮液稀釋至一定密度，取適量放入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)→將培養(yǎng)皿移至紫外燈下誘變處理→置暗處后處理一定時(shí)間→移入再生培養(yǎng)基中再生培養(yǎng)（由于原生質(zhì)體較脆弱，用雙層平板法再生）→分離優(yōu)質(zhì)菌株→突變株穩(wěn)定性試驗(yàn)→突變株鑒定。

是以微生物原生質(zhì)體為育種材料，采用物理或化學(xué)誘變劑處理，然后分離到再生培養(yǎng)基中再生，并從再生菌落中篩選高產(chǎn)突變菌株。第五頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一2．化學(xué)誘變劑誘變?cè)|(zhì)體的一般程序

通常操作程序包括：出發(fā)菌株培養(yǎng)和原生質(zhì)體制備及再生→選擇合適的化學(xué)誘變劑，配制成合適的濃度→加入原生質(zhì)體懸浮液，混合（含有高滲溶液，穩(wěn)定原生質(zhì)體）→誘變處理→離心棄誘變劑、原生質(zhì)體沉淀用穩(wěn)定液洗滌→稀釋、分離到再生平板上（雙層平板法）→再生培養(yǎng)→觀察、篩選突變株→復(fù)篩→突變株鑒定。

原生質(zhì)體誘變周期一般比常規(guī)誘變育種要長(zhǎng)，難度更大。第六頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）原生質(zhì)體誘變育種實(shí)例1．?dāng)U展青霉原生質(zhì)體制備2、原生質(zhì)體再生3、原生質(zhì)體誘變4、突變株篩選第七頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、微生物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種

整條DNA或DNA片段的轉(zhuǎn)化四、微生物原生質(zhì)融合育種五、其他微生物原生質(zhì)體育種第八頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二節(jié)

微生物原生質(zhì)體融合育種

用水解酶除去遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移的最大障礙—細(xì)胞壁，制成由原生質(zhì)膜包被的裸細(xì)胞，然后用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，誘導(dǎo)遺傳特性不同的兩親本原生質(zhì)體融合，經(jīng)染色體交換、重組而達(dá)到雜交的目的，經(jīng)篩選獲得具有雙親優(yōu)良性狀于一體的穩(wěn)定融合子。

聚乙二醇誘導(dǎo)和電融和

聚乙二醇種內(nèi)融合率可高達(dá)27%，種間的融合率也可達(dá)10%，比常規(guī)的雜交重組頻率提高千倍以上。電場(chǎng)誘導(dǎo)融合又將融合率提高10倍。

第九頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn)1、雜交率高2、受接合型或致育型的限制小3、遺傳物質(zhì)傳遞更為完整4、存在著兩株以上親株同時(shí)參與融合形成融合子的可能5、有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株6、提高菌株產(chǎn)量的潛力較大7、有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系第十頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一

原生質(zhì)體融合育種五大步驟：直接親本及其遺傳標(biāo)記選擇；雙親本原生質(zhì)體制備與再生；親本原生質(zhì)體誘導(dǎo)融合；融合重組體（稱為融合子）分離；遺傳特性分析與測(cè)定；

第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一

二、原生質(zhì)體制備與再生（一）原生質(zhì)體制備

最有效和最常用的是酶法。一、直接親本及其遺傳標(biāo)記的選擇一般把誘變系譜中篩選獲得的不同正突變株作為直接親本直接親本都帶有遺傳標(biāo)記

①超聲波處理菌體釋放原生質(zhì)體

②酶解脫壁釋放原生質(zhì)體

處理細(xì)菌細(xì)胞壁用酶

溶菌酶Lysozyme

處理放線菌細(xì)胞壁用酶

LyticEnzyme裂解酶、

Lysozyme溶菌酶第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一原生質(zhì)體的分離收集純化活性鑒定保存制備流程第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一纖維素酶Cellulase

酵母裂解酶Zymolyaseβ-1,3葡聚糖酶

幾丁質(zhì)酶Chitinase

商品酶

Novozyme234來(lái)自Trichodermaharzianum

Lywallzyme廣東微生物研究所溶壁酶

Glucuronidase葡聚糖苷酸酶(foryeast)

處理真菌用酶第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一原生質(zhì)體的好壞與培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件，菌齡和預(yù)處理等因素有關(guān)。

1、酶法分離原生質(zhì)體的影響因素

（1）培養(yǎng)基組成

（2）菌體培養(yǎng)方式：絲狀菌常用平板玻璃紙法，細(xì)菌和酵母菌多用振蕩沉沒(méi)培養(yǎng)法。

（3）菌體菌齡：絲狀真菌以年輕的菌絲用來(lái)分離原生質(zhì)體最佳。尤其是菌絲體尖端細(xì)胞。認(rèn)為對(duì)數(shù)期的前期和對(duì)數(shù)期效果最好。

第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一

酵母菌制備原生質(zhì)體時(shí)，要使菌體同步化，才能大幅度地提高制備率；放線菌制備原生質(zhì)體，以對(duì)數(shù)期到靜止期的轉(zhuǎn)換期比較理想，不僅制備量多，而且細(xì)胞壁再生能力也比較強(qiáng)；細(xì)菌適合在對(duì)數(shù)期分離原生質(zhì)體（4）穩(wěn)定劑：高滲溶液；無(wú)機(jī)鹽對(duì)絲狀真菌效果較好，而糖和糖醇對(duì)酵母更為合適，細(xì)菌多使用蔗糖或NaCl（5）酶解前的預(yù)處理：SH-化合物（如巰基乙醇）廣泛應(yīng)用于酵母和某些絲狀真菌中（6）酶系和酶的濃度：真菌-0.5％蝸牛酶和0.5%纖維素酶（7）酶的作用溫度和作用pH值及作用時(shí)間：通常細(xì)菌水解細(xì)胞壁的溫度在35℃左右。一般放線菌的溫度在30～32℃。霉菌一般在pH5.4-6.5，放線菌在pH6.5-7.0。作用時(shí)間也是影響原生體生成的重要因素。（8）菌體密度：（9）酶解方式：酶解時(shí)保持較好的通氣條件和適當(dāng)振蕩可促進(jìn)原生質(zhì)體釋放和分離。第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一2．原生質(zhì)體的鑒別（1）低滲爆破法：（2）熒光染色法：0.05%-0.1%的熒光增白劑（VBL）3．原生質(zhì)體的收集和純化（1）過(guò)濾法：使用砂芯漏斗。（2）密度梯度離心法：（3）界面法：（4）漂浮法：

第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一4．原生質(zhì)體的活力鑒定（1）熒光素雙醋酸鹽（FDA）染色法（2）酚藏花紅染色法（0.01%染料染色，活紅，死白）（3）伊文思籃染色法（0.25%伊文思籃，活無(wú)色，死藍(lán)色）5．原生質(zhì)體的保存

（1）立即進(jìn)行融合或其它方式育種（2）5％的二甲亞砜或甘油等其他保護(hù)劑；液氮。第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）原生質(zhì)體再生

l、原生質(zhì)體再生的影響因素①菌體生理狀態(tài)②穩(wěn)定劑③酶濃度和酶作用時(shí)間④再生培養(yǎng)基：絲狀真菌、釀酒酵母等的原生質(zhì)體僅能在固體培養(yǎng)基上再生，在液體培養(yǎng)基中細(xì)胞壁再生不徹底，不能完全復(fù)原。再生培養(yǎng)基要用穩(wěn)定劑配制，還含有Ca2+和Mg2+,濃度和原生質(zhì)體形成時(shí)的酶解液相類似，菌種不同稍有差別。⑤殘存菌體的分離⑥原生質(zhì)體密度⑦排除再生培養(yǎng)基上的冷凝水⑧再生方法大分子的合成和原生質(zhì)體生長(zhǎng)；細(xì)胞壁的合成與再生；分裂能力的恢復(fù)并開(kāi)始分裂繁殖細(xì)菌、放線菌和酵母菌多用糖醇系統(tǒng)的穩(wěn)定液；霉菌多用鹽溶液系統(tǒng)。第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一原生質(zhì)體懸浮液未酶解的細(xì)菌無(wú)菌水稀釋高滲溶液稀釋高滲溶液稀釋培養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)再生率（%）=再生培養(yǎng)基上總菌落數(shù)—酶處理后未原生質(zhì)體化菌落數(shù)原生質(zhì)體數(shù)×100%總菌落數(shù)(A)未原生質(zhì)化細(xì)胞（B)再生菌落(C)=C－BA－B×100%2．再生率及其計(jì)算第二十頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一三、原生質(zhì)體融合（一）原生質(zhì)體融合過(guò)程兩親株原生質(zhì)體混合于高滲透壓的穩(wěn)定液中，在PEG的誘導(dǎo)下，兩個(gè)或兩個(gè)以上凝聚成團(tuán)，相鄰原生質(zhì)體緊密接觸的質(zhì)膜面擴(kuò)大，相互接觸的質(zhì)膜消失，細(xì)胞質(zhì)融合，形成一個(gè)異核體細(xì)胞，異核體的細(xì)胞在繁殖過(guò)程中發(fā)生核的融合，形成雜合二倍體，通過(guò)染色體交換，產(chǎn)生各種重組體，稱為融合子

原生質(zhì)體、PEG及適量的CaCl2、MgCl2第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）原生質(zhì)體融合的影響因素

1．融合劑：

化學(xué)融合劑：不同種類微生物對(duì)PEG分子量的要求不盡相同。細(xì)菌：1500-6000；放線菌：1000-1500；真菌：4000-6000.濃度一般為30%-50%。

物理融合劑：電場(chǎng)和激光2．溫度：絲狀真菌適宜融合的溫度約為30℃；而細(xì)菌原生質(zhì)體融合的適溫往往偏低，據(jù)認(rèn)為4℃或20℃比37℃更好；放線菌通常在常溫（約20℃）下進(jìn)行融合。總的來(lái)說(shuō)在20-30℃下進(jìn)行融合效果較理想。融合處理時(shí)間從1min-1h，但大多數(shù)微生物1～10min，3、親株的親和力和原生質(zhì)體的活性4．無(wú)機(jī)離子：在PEG介導(dǎo)融合時(shí)，通常需要一定梯度的Ca2+、Mg2+有效地促進(jìn)融合5．其他條件：細(xì)胞密度，不少于106/ml；應(yīng)采用年輕的含殘余菌絲少的的原生質(zhì)體進(jìn)行融合。

第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一四、融合體再生（一）融合體再生

雙親融合后形成的融合體不等于重組體，以霉菌來(lái)說(shuō)，可能是異核體或雜合二倍體或重組體，它們?nèi)诤虾鬆I(yíng)養(yǎng)互補(bǔ)，經(jīng)過(guò)再生，均可在基本培養(yǎng)基上形成菌落。

融合體的再生包括融合體細(xì)胞壁的合成、重建和融合體的再生。

酵母菌、細(xì)菌常用雙層平板法，與融合前原生質(zhì)再生率測(cè)定相同。霉菌和放線菌除了用雙層平板法外，也可把原生質(zhì)體直接分離到高滲培養(yǎng)基平板上，同樣能得到再生菌落。復(fù)原：原生質(zhì)體本身形成細(xì)胞壁，而且還能從原生質(zhì)體細(xì)胞上長(zhǎng)出有細(xì)胞壁的菌絲體第二十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）融合體的檢出與分離1．利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記選擇融合體2．利用抗性選擇融合體3．用滅活原生質(zhì)體檢出融合體4．利用熒光染色法選擇融合體5．雙親對(duì)碳源利用不同而檢出融合體6．融合體的其他選擇方法①對(duì)昆蟲(chóng)的毒力測(cè)定進(jìn)行融合體的選擇②利用形態(tài)差異選擇③生化測(cè)定指標(biāo)選擇融合體

第二十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一

五、融合重組體檢出與遺傳分析分離重組體，并試驗(yàn)其遺傳穩(wěn)定性研究

（一）重組體的檢出和鑒別的方法1．直接法2．間接選擇法3．鈍化選擇法

直接分離在基本培養(yǎng)基上或選擇培養(yǎng)基上。但是難以檢測(cè)表型延遲而又基因重組的融合體

先分離到完全培養(yǎng)基上，然后再影印到選擇培養(yǎng)基上。這種方法可以檢測(cè)表型延遲重組體。第二十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）融合率

如采用直接法，融合率的計(jì)算公式為：融合率（％）=基本培養(yǎng)基上再生的菌落/完全培養(yǎng)基上再生的菌落數(shù)×100%

如采用間接法．融合率的記算公式為：融合率（%）＝重組體后代總數(shù)/所有后代總數(shù)×