中農(nóng)大環(huán)境微生物學(xué)課件第6章 微生物的生長(zhǎng)

第6章微生物的生長(zhǎng)第一節(jié)微生物的生長(zhǎng)第二節(jié)影響微生物生長(zhǎng)的環(huán)境因子第一節(jié)微生物的生長(zhǎng)微生物發(fā)揮作用是“以數(shù)取勝”或“以量取勝”的。在微生物的研究中，只有群體生長(zhǎng)才有意義。一般通過(guò)液體培養(yǎng)來(lái)研究其群體生長(zhǎng)。分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)大多數(shù)微生物采用二分裂方式繁殖，一個(gè)細(xì)胞分裂為大小相當(dāng)?shù)膬蓚€(gè)細(xì)胞。

三個(gè)過(guò)程:

細(xì)胞個(gè)體增大(cellelongation)DNA復(fù)制細(xì)胞分裂微生物的繁殖方式：二分裂一、微生物繁殖的測(cè)定微生物的生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加，因此測(cè)定生長(zhǎng)的方法是建立在計(jì)算個(gè)體數(shù)目上。測(cè)方法：

干重法直接計(jì)數(shù)法

菌落計(jì)數(shù)法

比濁計(jì)干重法

(測(cè)定細(xì)胞物質(zhì)的重量)

采用干重法，用離心或過(guò)濾的方法將菌體從菌懸液中分離出來(lái)，洗凈，烘干，稱重，求得單位容積菌懸液中細(xì)胞的干重。特點(diǎn)：直接、可靠。只適用于菌體濃度較高的樣品，而且要求樣品中不含菌體以外的其他干物質(zhì)。

在活性污泥法中常采用干重法來(lái)測(cè)定活性污泥的重量，以近似代表活性污泥中微生物的量，這一指標(biāo)稱為活性污泥濃度(符號(hào)為MLSS)，mg/L。這種測(cè)定結(jié)果既包括活菌和死菌量，又包括有機(jī)顆粒和無(wú)機(jī)鹽類的重量，因而，這一指標(biāo)隨非生物物質(zhì)含量的增加，可靠性降低。用計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法。常用的計(jì)數(shù)板為血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)法該方法得到是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)解決方法：用特殊染料對(duì)活菌染色

如：

美蘭對(duì)酵母染色：活細(xì)胞無(wú)色，死細(xì)胞蘭色

吖啶橙對(duì)細(xì)菌染色：活細(xì)胞橙色熒光(紫外光顯微鏡)死細(xì)胞綠色熒光菌落計(jì)數(shù)法用倒平板(pourplate)或涂布平板(spreadplate)的方法。把稀釋后的樣品通過(guò)澆注或涂布的方法讓其內(nèi)的微生物單細(xì)胞分散在瓊脂平板上，待培養(yǎng)后，每一活細(xì)胞形成一個(gè)單菌落，即“菌落形成單位”(colonyformingunit,CFU)。Stenotrophomonas(寡營(yíng)養(yǎng)單胞菌)Mycobacterium(分枝桿菌)

當(dāng)細(xì)胞在液體中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)懸浮在液體中，使溶液混濁.細(xì)胞的生長(zhǎng)量越高，就有越多的光散射，因此懸浮液的濁度越高。測(cè)定濁度二、微生物的生長(zhǎng)規(guī)律微生物個(gè)體生長(zhǎng)和同步生長(zhǎng)

微生物細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)也有從小到大及細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的生物化學(xué)變化和細(xì)胞學(xué)變化，這就是個(gè)體生長(zhǎng)。研究方法

用電子顯微鏡觀察細(xì)胞超薄切片

使用同步培養(yǎng)(synthronousculture)技術(shù)分批培養(yǎng)(batchculture)單細(xì)胞微生物的生長(zhǎng)曲線生長(zhǎng)：微生物細(xì)胞數(shù)量增加定義為生長(zhǎng)生長(zhǎng)速率：?jiǎn)挝粫r(shí)間微生物的數(shù)量變化世代：由一個(gè)細(xì)胞變?yōu)閮蓚€(gè)細(xì)胞稱為一個(gè)世代世代時(shí)間：一個(gè)世代所需要的時(shí)間稱為世代時(shí)間微生物群體的典型生長(zhǎng)曲線定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線，稱為生長(zhǎng)曲線(growthcurve).把少量純種單細(xì)胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中后，在適宜的溫度、通氣等條件下，該群體就會(huì)由小到大，發(fā)生有規(guī)律的增長(zhǎng)。細(xì)菌的典型生長(zhǎng)曲線Typicalgrowthcurve典型的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線可分為四個(gè)時(shí)期：延遲期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期、衰亡期

延遲期(lagphase)在開(kāi)始培養(yǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有增加的一段時(shí)期。特點(diǎn)：①生長(zhǎng)速率常數(shù)為零；②細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)③細(xì)胞內(nèi)的RNA尤其是rRNA會(huì)含量增高，原生質(zhì)呈嗜堿性④合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP的合成加速，易產(chǎn)生各種誘導(dǎo)酶⑤對(duì)外界不良條件如NaCl溶液濃度、溫度和抗生素等理、化因素反應(yīng)敏感。影響延遲期長(zhǎng)短的因素

接種齡：以生長(zhǎng)曲線上哪一階段用來(lái)作種子

接種量：接種量大，延滯期短，接種量小，延滯期長(zhǎng)

培養(yǎng)基成分：營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基比單調(diào)的培養(yǎng)基延滯期短。出現(xiàn)延滯期的原因，是由于接種到新鮮培養(yǎng)液的種子細(xì)胞中，一時(shí)還缺乏分解或催化有關(guān)底物的酶或輔酶，或是缺乏充足的中間代謝物。指數(shù)期或?qū)?shù)期(exponentialphase)

生長(zhǎng)曲線中緊接著延滯期的一段細(xì)胞數(shù)以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)的時(shí)期。

這一時(shí)期的特點(diǎn)：①生長(zhǎng)速率常數(shù)R最大，倍增時(shí)間最短；②細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體各部分的成分十分均勻；③酶系活躍，代謝旺盛。3個(gè)重要的參數(shù)：①繁殖代數(shù)(n)②生長(zhǎng)速率常數(shù)(R)③代時(shí)(世代時(shí)間G)影響代時(shí)長(zhǎng)短的因素①菌種微生物代時(shí)(min)E.coli12.5~17Bacillussubtilis26~32Saccharomycescerevisiae120Rhizobiumjaponicum344~461Mycobacteriumtuberculosis792~932Nitrobactergailis1200②營(yíng)養(yǎng)成分及營(yíng)養(yǎng)物的濃度營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，代時(shí)短，反之則長(zhǎng)。營(yíng)養(yǎng)物濃度很低時(shí)影響微生物生長(zhǎng)速率，隨營(yíng)養(yǎng)物濃度提高，生長(zhǎng)速率不受影響。③培養(yǎng)溫度又稱最高生長(zhǎng)期，其生長(zhǎng)速率常數(shù)R等于零，處于新繁殖的細(xì)胞數(shù)與衰亡的細(xì)胞數(shù)相等。這時(shí)的菌體產(chǎn)量達(dá)到了最高點(diǎn)。特點(diǎn)：①開(kāi)始積聚內(nèi)含物②芽孢開(kāi)始形成③開(kāi)始次級(jí)代謝穩(wěn)定期(stationaryphase)穩(wěn)定期到來(lái)的原因：①營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡②營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比例失調(diào)，例如C/N不合適等③酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物的累積④pH、氧化還原勢(shì)等物理化學(xué)條件越來(lái)越不適宜穩(wěn)定期也是收獲菌體或產(chǎn)物（與菌體生長(zhǎng)相平行）的時(shí)期需要采取措施延長(zhǎng)穩(wěn)定期。衰亡期

在衰亡期中，微生物的個(gè)體死亡速度超過(guò)新生速度，整個(gè)群體呈現(xiàn)負(fù)生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞形態(tài)發(fā)生多形化，如發(fā)生膨大或不規(guī)則的退化形態(tài)、因蛋白酶水解活加增強(qiáng)發(fā)生自溶、進(jìn)一步釋放抗生素、釋放芽孢等。產(chǎn)生衰亡的主要原因是外界環(huán)境對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)越來(lái)越不利，從而引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝明顯超過(guò)合成代謝，導(dǎo)致大量菌體死亡。

通過(guò)一定的方式使微生物能以恒定的比生長(zhǎng)率生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。該方法向培養(yǎng)容器中連續(xù)流加新鮮培養(yǎng)液。三、連續(xù)培養(yǎng)在典型生長(zhǎng)曲線的基礎(chǔ)上，通過(guò)相應(yīng)的措施延長(zhǎng)穩(wěn)定期，實(shí)現(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)。措施：補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）取走代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度對(duì)好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩等

最常見(jiàn)的連續(xù)培養(yǎng)設(shè)備為恒濁器和恒化器，可以控制細(xì)胞密度和生長(zhǎng)速率，這兩個(gè)參數(shù)可以由實(shí)驗(yàn)者設(shè)定。恒濁器和恒化器恒濁器(turbidostat)是根據(jù)反應(yīng)器內(nèi)微生物的生長(zhǎng)速度，控制培養(yǎng)液流速，取得菌體密度高、生長(zhǎng)速度恒定的微生物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)器。微生物連續(xù)培養(yǎng)當(dāng)培養(yǎng)基流速低于微生物生長(zhǎng)速度時(shí)，菌體密度增高，使流速加快，反之調(diào)節(jié)流速降低，最終使微生物以最高速度生長(zhǎng)。生產(chǎn)實(shí)踐中往往采用這類反應(yīng)器。恒化器(chemostat)：與恒濁相反，恒化器是設(shè)法使培養(yǎng)液的流速保持不變，使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率的條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的連續(xù)培養(yǎng)裝置。在恒化器中，一方面菌體密度會(huì)隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增高；另一方面，限制因子的濃度又會(huì)隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，兩者相互作用的結(jié)果出現(xiàn)微生物生長(zhǎng)速率與恒速流入的新鮮培養(yǎng)基的速率相平衡。恒化器主要用于實(shí)驗(yàn)室的科研工作。恒化器(chemostat)微生物的生長(zhǎng)受環(huán)境中物理、化學(xué)因素的影響。了解這些影響可以使我們掌握微生物的活動(dòng)規(guī)律，達(dá)到利用有益微生物或消滅有害微生物的目的。三個(gè)因子:

溫度,pH,氧氣.第二節(jié)影響微生物生長(zhǎng)的環(huán)境因子微生物的生長(zhǎng)溫度有最低生長(zhǎng)溫度、最適生長(zhǎng)溫度和最高生長(zhǎng)溫度三個(gè)重要指標(biāo)，即生長(zhǎng)三溫度基點(diǎn)(threecardinalpoint)。如果把微生物作為一個(gè)整體，其溫度的三基點(diǎn)極其寬，“生物之最”。一、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)最低：一般為-10~-5℃，極端為-30℃最適最高：一般為80~95℃，極端為105~150℃嗜冷菌：＜20℃(一般為15℃)中溫菌：(20~45℃)室溫菌：約25℃體溫菌：約37℃嗜熱菌：＞45℃(一般為50~60℃)

微生物生長(zhǎng)在一個(gè)溫度范圍內(nèi)，低于最低生長(zhǎng)溫度或高于最高生長(zhǎng)溫度微生物將不能生存。在生長(zhǎng)溫度范圍內(nèi)有一個(gè)最佳生長(zhǎng)溫度，微生物的繁殖最快。EnzymesexhibitaQ10sothatwithinasuitabletemperaturerangetherateofenzymeactivitydoublesforevery10'Criseintemperature.Q10：溫度系數(shù)

根據(jù)微生物的最適生長(zhǎng)溫度，可以分為：低溫菌,中溫菌、嗜溫菌和極端嗜熱菌. 二、氧氣地球表面絕大多數(shù)是有氧的環(huán)境還有許多厭氧環(huán)境：水底污泥、沼澤地、水田、垃圾填埋廠、污水處理池、動(dòng)物腸道根據(jù)微生物與氧的關(guān)系可以進(jìn)行如下分類(專性)厭氧菌：氧有害或致死，以發(fā)酵或無(wú)氧呼吸產(chǎn)能微生物與氧的關(guān)系好氧菌厭氧菌專性好氧菌：需氧，在正常大氣壓下通過(guò)呼吸產(chǎn)能微好氧菌：需在微量氧(0.01~0.03巴)下生活耐氧菌：不需氧，只以發(fā)酵產(chǎn)能，氧無(wú)毒害兼性厭氧菌以呼吸為主，兼營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)能以呼吸為主，兼營(yíng)厭氧呼吸產(chǎn)能在半固體培養(yǎng)基中氧氣濃度對(duì)不同細(xì)菌的影響(a)嚴(yán)格好氧菌僅在氧氣擴(kuò)散到的上層培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

(e)耐氧厭氧菌在整個(gè)試管中均勻生長(zhǎng)，生長(zhǎng)在培養(yǎng)表面與其他位置相同，因?yàn)樗鼈儾恍枰鯕狻?d)微好氧菌,不能耐受大氣中氧氣濃度，在試管中部薄層適宜氧氣濃度下生長(zhǎng)(c)兼性厭氧菌在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)最好，但在整個(gè)試管中都有生長(zhǎng)。

(b)嚴(yán)格厭氧菌，氧氣對(duì)其有毒，在有氧的培養(yǎng)基表面沒(méi)有生長(zhǎng)。微生物耐氧機(jī)制超氧化物歧化酶(SOD)過(guò)氧化氫酶劇毒有毒無(wú)毒微生物作為一個(gè)整體來(lái)說(shuō)，其生長(zhǎng)的pH范圍極廣(＜2~＞10)絕大多數(shù)微生物的生長(zhǎng)pH在5~9之間，與溫度三基點(diǎn)相似，不同微生物的生長(zhǎng)pH也存在最低、最適和最高3個(gè)數(shù)值。細(xì)菌中性（6.5~7.5）真菌酸性（4~6）放線菌堿性（7.5~8.0)

三、pH微生物除有最適生長(zhǎng)pH外，不同生長(zhǎng)階段和不同生理、生化過(guò)程也有不同的最適pH要求，在發(fā)酵生產(chǎn)中pH的控制尤為重要。例：Aspergillusniger(黑曲霉)在pH=2.0~2.5時(shí)，有利于合成檸檬酸；在pH=2.6~6.5時(shí)，以菌體生長(zhǎng)為主在pH=7時(shí)，合成草酸盡管微生物外界環(huán)境變化很大，但細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中的pH是穩(wěn)定的，接近于中性。免除DNA、ATP、葉綠素RNA、磷脂等重要成分被破壞。胞內(nèi)酶的最適pH也接近于中性pH還影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收微生物的生命活動(dòng)過(guò)程也會(huì)能動(dòng)地改變環(huán)境的pH培養(yǎng)基內(nèi)中性成分有機(jī)物無(wú)機(jī)鹽糖類蛋白質(zhì)發(fā)酵、氧化(NH4)2SO4脂肪有機(jī)酸胺類H2SO4NaNO3NaOH水解脫羧變酸變堿NH4+選擇吸收NO3-選擇吸收在培養(yǎng)中pH變化對(duì)微生物本身及發(fā)酵是不利的。pH調(diào)節(jié)治標(biāo)治本過(guò)酸時(shí)：加NaOH、Na2CO3等堿液中和過(guò)酸時(shí)過(guò)堿時(shí)：加H2SO4、HCl等酸液中和過(guò)堿時(shí)加適當(dāng)?shù)矗耗蛩亍aNO3、NH4OH或蛋白質(zhì)等提高通氣量降低通氣量加適當(dāng)碳源：糖、乳糖、醋酸、檸檬酸或油脂等四、其他影響因素輻射：可見(jiàn)光紫外線：形成嘧啶二聚體(TT,TC,CC)和水合物電離輻射微波化學(xué)殺菌劑和抑菌劑：消毒劑防腐劑紫外線照射形成的二聚體和光復(fù)活作用光解酶可使二聚體重新分解成單體可見(jiàn)光照射下，光解酶激活實(shí)驗(yàn)技術(shù)1：有害微生物控制技術(shù)消毒、滅菌、防腐和化療

消毒(disinfection)

消除潛在病原微生物的過(guò)程

采用較溫和的理化因素殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體或動(dòng)、植物有害的病原菌，而對(duì)被消毒對(duì)象基本無(wú)害。

紫外線、酒精等藥劑或巴氏消毒滅菌(sterilization)

用更強(qiáng)烈的手段殺死所有微生物的過(guò)程防腐(antisepsis)

利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖防止食品、生物制品等發(fā)生霉腐的措施。①低溫：冰箱②缺氧：抽真空、加除氧劑③干燥：曬干、烘干④高滲：鹽腌、糖漬⑤高酸度：泡菜⑥高醇度：白酒、黃酒⑦加防腐劑：亞硝酸鹽、山梨酸、苯甲酸化療(chemotherapy)

利用具有高度選擇毒力(selectivetoxicity)即對(duì)病原菌具高毒力而對(duì)其宿主基本無(wú)毒的化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑制宿住體內(nèi)病原微生物的生長(zhǎng)繁殖，以達(dá)到治療該宿主傳染病的一種措施具有高度選擇毒力、可用于化學(xué)治療的化學(xué)物質(zhì)稱為化學(xué)治療劑(chemotherapeutant):

化學(xué)合成藥物

抗生素、

生物藥物素、

中草藥有效成分比較項(xiàng)目滅菌消毒防腐化療處理因素強(qiáng)理化因素理化因素理化因素化學(xué)治療劑處理對(duì)象任何物體內(nèi)外生物體表，酒乳等有機(jī)質(zhì)物體內(nèi)外宿主體內(nèi)微生物類型一切微生物有關(guān)病原體一切微生物有關(guān)病原體對(duì)微生物作用徹底殺滅殺死或抑制抑制或殺死抑制或殺死實(shí)例加壓蒸汽滅菌70%酒精消毒，巴氏消毒冷藏、干燥、糖漬、缺氧、化學(xué)防腐劑抗生素、磺胺藥、生物藥物素高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)溫度達(dá)到121℃(對(duì)應(yīng)表壓為101kPa)，時(shí)間維持15~20min。滅菌在升溫之前一定要將鍋內(nèi)的空氣排盡，使鍋內(nèi)充滿蒸汽，否則達(dá)不到壓力表所對(duì)應(yīng)的溫度。有的物質(zhì)是熱敏性的，如糖類要適當(dāng)降解滅菌溫度。滅菌完畢，應(yīng)先待鍋內(nèi)壓力自然降至與外壓相同，再開(kāi)放氣閥，最后打開(kāi)容器。

使用滅菌鍋應(yīng)注意的問(wèn)題煮沸消毒：在100℃下煮沸數(shù)分鐘的方法，如飲用水消毒巴氏消毒：用于牛奶、啤酒等的低溫消毒方法低溫維持法：63℃，30min