維生素類藥物的分析

1第十三章維生素類藥物的分析2維生素：是維持人體正常代謝機能所必需的微量營養(yǎng)物質，人體不能合成維生素。各種維生素的化學結構以及性質雖然不同，但它們卻有著以下共同點：①維生素大多以維生素原（維生素前體）的形式存在于食物中。7-脫氫膽固醇

β-胡蘿卜素維生素A代謝維生素D3代謝3②維生素不是構成機體組織和細胞的組成成分，它也不會產(chǎn)生能量，它的作用主要是參與機體代謝的調節(jié)。③大多數(shù)的維生素，機體不能合成或合成量不足，不能滿足機體的需要，必須經(jīng)常通過食物中獲得。④人體對維生素的需要量很小，日需要量常以毫克（mg）或微克（μg）計算，但一旦缺乏就會引發(fā)相應的維生素缺乏癥，對人體健康造成損害。4

維生素A、D2、D3、E、K1等脂溶性水溶性維生素B族（B1、B2、B6、B12）

維生素C、葉酸、煙酸、煙酰胺、泛酸維生素M維生素PP維生素分類（按溶解性分）：5-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:第一節(jié)維生素A的分析一、結構與性質（一）結構環(huán)己烯共軛多烯醇側鏈1.溶解性不溶于水，乙醇中微溶，與三氯甲烷、乙醚、環(huán)己烷和石油醚任意互溶（二）性質71.具有共軛多烯側鏈（二）性質存在多種立體異構化合物8維生素A325.5新維生素Aa328新維生素Ab320.5新維生素Ac310.5異維生素Aa323異維生素Ab324具有UV吸收特性：在325～328nm間有最大吸收9易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應去氫維生素A（A2）去水維生素A（A3）鯨醇10

易被氧化△或有金屬離子存在時氧化↑113.與三氯化銻發(fā)生呈色反應三氯甲烷中紫紅藍色?CHCl3??3SbCl維生素A12三氯化銻反應UVTLC

二、鑒別試驗13（一）三氯化銻反應（Carr-Price反應）條件：無水、無醇藍色紫紅維生素ASbCl514方法取維生素A油溶液1滴，加氯仿10ml，振搖溶解，取出兩滴，加氯仿2ml，與25%三氯化銻氯仿溶液0.5ml反應，成藍色，漸成紫紅色。155個共軛雙鍵λmax為326nm一個吸收峰（二）UV法6個共軛雙鍵λmax為350～390nm三個吸收峰，且在332nm的波長處有較低的吸收峰或拐點。溶劑：無水乙醇-鹽酸（100:1）16（三）TLC法對照品法USP顯色劑磷鉬酸

規(guī)定斑點顏色和Rf值BP

顯色劑三氯化銻17紫外分光光度法三氯化銻比色法HPLC法三、含量測定18（一）UV法（三點校正法）測定依據(jù)：維生素A分子結構中多烯共軛體系，具有紫外吸收特性，在325-328nm處有最大吸收。立體異構體（新維生素Aa、Ab和Ac，異維生素Aa和Ab）、氧化產(chǎn)物（環(huán)氧化物、維生素A醛和維生素A酸）、光照產(chǎn)物（鯨醇）、合成中間體、去氫維生素A、去水維生素A等雜質會有紫外吸收，干擾維生素A在紫外區(qū)的測定。為了得到準確的測定結果，消除非維生素A產(chǎn)生的無關吸收所引起的誤差，故采用“三點校正法”測定。19物質對光的吸收具有加和性。雜質的吸收在310～340nm波長范圍內呈一條直線，隨波長的增大而吸收度變小。

1.測定原理雜質維生素A純品維生素A樣品21（三）生物效價及換算因數(shù)維生素A含量是用生物效價表示

單位

IU/g（國際單位）221g維生素A醋酸酯相當?shù)膰H單位數(shù)為1g維生素醇相當?shù)膰H單位數(shù)為23(VitA酯)(VitA醇)242.波長的選擇（1）三點波長的選擇原則為：一點選擇在維生素A的最大吸收波長處（即1）維生素A的max（2）23

分別在1的兩側各選一點25測定對象：純度高的維生素A醋酸酯第一法等波長差法3-1=1-21=328nm2=316nm3=340nm△=12nm26第二法等吸收度法(皂化法)測定對象：維生素A醇1=325nm2=310nm3=334nm273.測定方法和計算方法（1）第一法：直接測定法 ——純度高的維生素A醋酸酯

方法：28

判斷是否在326～329nm之間改用第二法是否

求算并與規(guī)定值比較29

規(guī)定值差值30

判斷差值是否超過有一個以上超過無超過計算A328（校正）用A328計算3103%－15%－3%第二法第二法32（2）第二法：皂化法——維生素A醇的測定水溶性脂溶性第一法無法消除雜質干擾時用此法33

判斷max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定

計算是否34

判斷A300/A325是否小于或等于0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定計算A325(校正)3503%－3%36色譜條件：固定相：硅膠流動相：正己烷-異丙醇（997:3）流速：1ml/min檢測波長：325nm（二）HPLC法適用于維生素A醋酸酯原料及其制劑中維生素A的含量測定系統(tǒng)適應性試驗：維生素A醋酸酯主峰與其順式異構體峰的分離度應大于3.037（三）三氯化銻比色法原理：維生素A與三氯化銻的無水氯仿溶液作用，產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍色，在618nm~620nm波長處有最大吸收，符合Beer定律。方法：取維生素A對照品，制成系列濃度的氯仿溶液，加入一定量的三氯化銻無水氯仿溶液，在5s～10s內，于620nm波長處測定吸收度，繪制標準曲線。按同法測定供試液的吸收度，根據(jù)標準曲線計算含量。38注意事項：①呈色不穩(wěn)定，要求操作迅速，一般規(guī)定加入三氯化銻后應在5s~10s內測定。②水分干擾測定，三氯化銻水解產(chǎn)生SbOCl而使溶液渾濁，影響比色。③溫度影響較大，樣品測定時的溫度與繪制標準曲線溫差≤1℃。④專屬性差，常使測定結果偏高。⑤三氯化銻有腐蝕性。39維生素A脫氫——去氫維生素A氧化——環(huán)氧化物立體異構體UV——鑒別和含量測定與三氯化銻呈色——鑒別和含量測定脫水——去水維生素A氧化——維生素A醛、酸40第二節(jié)維生素B1的分析廣泛存在于米糠、麥麩和酵母中。具有維持糖代謝及神經(jīng)傳導與消化的功能，主要用于治療腳氣病、多發(fā)性神經(jīng)炎和胃腸道疾病。41一、結構及性質(一)結構氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)（季銨堿）鹽酸硫胺42（二）性質1.溶解性維生素B1為白色結晶或結晶性粉末，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。水溶液呈酸性。2.硫色素反應噻唑環(huán)在堿性介質中開環(huán)，再與嘧啶環(huán)上的氨基環(huán)合，經(jīng)鐵氰化鉀等氧化劑氧化成具有熒光的硫色素。

3.UV共軛λmax=246nm434.堿性與酸成鹽與生物堿沉淀試劑（碘化汞鉀、三硝基酚、碘溶液、硅鎢酸等）反應，生成組成恒定的沉淀，可用于鑒別和含量測定。5.鹽酸根呈氯化物的特性反應，用于鑒別嘧啶環(huán)——伯氨噻唑環(huán)——季銨44二、鑒別試驗（一）硫色素反應——維生素B1的專屬反應熒光消失正丁醇藍色熒光H+OH-45[O]-2H硫色素46方法取本品約5mg，加氫氧化鈉2.5ml，加鐵氰化鈉試液0.5ml與正丁醇5ml,強烈振搖2min,放置分層，上面醇層顯強烈藍色熒光。加酸消失，再加堿又重現(xiàn)。47（二）沉淀反應維生素B1具有嘧啶環(huán)和氨基，顯生物堿特征，可與生物堿沉淀或顯色劑反應。48（三）氯化物反應49（四）硫元素反應（五）IR本品的紅外光譜圖應與對照圖譜一致50三、含量測定非水溶液滴定法——原料藥UV法——制劑硫色素熒光法——USP51（一）非水溶液滴定法原理：維生素B1分子含有2個堿性的已成鹽的伯胺和季銨基團，在非水溶液中均與HClO4作用，根據(jù)消耗HClO4的量可以計算維生素B1的含量。反應摩爾比1:252（二）UV法共軛雙鍵結構，UV特征紫外吸收峰隨PH變化而變化

溶劑pHλmax

水7232-3345鹽酸2246421ChP片劑、注射劑含量計算（每片）相當于標示量的%=規(guī)格g/片g54NaOH（三）硫色素熒光法原理激發(fā)波長365nm發(fā)射波長435nm通過與對照品熒光強度的比較即可測得供試品含量可用于維生素B1及其制劑的含量測定55SdAb+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇對照液+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇供試液計算56特點專屬性反應靈敏度高，線性范圍寬代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析可用CNBr為氧化劑，反應定量完全，適合于生物樣本分析。57維生素B1嘧啶環(huán)與生物堿沉淀劑或顯色劑反應——鑒別UV——鑒別和含量測定氨基堿性——和酸成鹽非水滴定——含量測定噻唑環(huán)季銨堿——和酸成鹽，含量測定硫色素反應——鑒別和含量測定硫元素反應——鑒別鹽酸鹽——鑒別58L－抗壞血酸第三節(jié)維生素C的分析γ-內酯**一、結構及性質(一)結構烯二醇結構59(二)性質1.溶解性維生素C易溶于水，微溶于乙醇，不溶于三氯甲烷和乙醚。2.酸性C3－OH的酸性較強pK1=4.17，C2－OH的酸性較弱pK2=11.57。故表現(xiàn)為一元酸的性質，能與碳酸氫鈉成鈉鹽。3.旋光性維生素C有2個手性碳原子，有4個光學異構體。604.還原性維生素C中的烯二醇基具有強還原性，易被氧化為二酮基而成為去氫抗壞血酸。烯二醇結構二酮基結構[o]-2H+2H61有生物活性無生物活性L－抗壞血酸去氫抗壞血酸二酮古洛糖酸[O]H+OH-625.水解性維生素C中的內酯環(huán)在強堿中可水解，生成酮酸鹽。Na2CO3NaOH636.糖類的性質

維生素C結構與糖類相似，有糖類的顯色反應。7.UV具有共軛雙鍵，其稀HCl溶液在243nm處有最大吸收。在中性或堿性條件下，紅移至265nm。64二、鑒別試驗（一）與氧化劑反應651.與AgNO3反應維生素C中有烯二醇基，具有強還原性，可被AgNO3氧化，產(chǎn)生黑色金屬銀沉淀。

方法：取本品0.2g，加水l0ml溶解。取該溶液5m1，加硝酸銀試液0.5m1，即生成銀的黑色沉淀。662.與2,6-二氯靛酚反應氧化型玫瑰紅色還原型藍色OHˉ（玫瑰色）（無色）方法：取本品0.2g，加水l0ml溶解。取該溶液5m1，加2,6-二氯靛酚試液1～2滴，試液的顏色即消失。673.與其他氧化劑反應亞甲藍或高錳酸鉀維生素C褪色堿性酒石酸銅維生素C磚紅色Cu2O沉淀磷鉬酸維生素C鉬藍68（三）糖類的反應或鹽酸吡咯50℃（二）薄層色譜法ChP2010采用TLC對維生素C制劑進行鑒別69-3H2O70（四）UV維生素C在0.0lmol/L鹽酸液中，在243nm波長處有惟一的最大吸收，利用此特征進行鑒別。

BP中采用該法，并規(guī)定其百分吸收系數(shù)應為545-585。71三、雜質檢查（一）溶液的澄清度與顏色檢查： ——有色雜質，分光光度法（二）鐵、銅離子：原子吸收分光光度法（三）草酸的檢查：與鈣形成沉淀72（一）碘量法四、含量測定1.原理：維生素C在醋酸酸性條件下，可被碘定量氧化。根據(jù)消耗碘的體積，可以計算維生素C的含量。淀粉指示液，終點至藍色不消失反應摩爾比1∶1732.方法：取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍色，在30秒內不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當于8.806mg的C6H8O6。743.討論（1）酸性環(huán)境

——減慢VitC被O2氧化速度（2）新沸冷H2O ——趕走水中O2（3）立即滴定 ——減少O2的干擾75（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過濾注射劑——抗氧劑——丙酮Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O576（二）2,6-二氯靛酚滴定法1.原理自身指示終點法終點：顯示過量的2,6-二氯靛酚的顏色（粉紅色）2.方法（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc ——穩(wěn)定VitC（2）快速滴定2min內

——防止其他還原性物質干擾（3）滴定液需經(jīng)常標定 ——2,6-二氯靛酚不穩(wěn)定，貯存≤一周（4）剩余比色測定77（定量過量）（測剩余染料）3.討論78（三）HPLC法79維生素C烯二醇基酸性——可與堿成鹽與硝酸銀反應——鑒別與二氯靛酚鈉反應——鑒別和含量測定碘量法——含量測定共軛雙鍵——UV，鑒別酯鍵——水解糖的性質——鑒別旋光性**HPLC——含量測定80第四節(jié)維生素D的分析維生素D是一類抗佝僂病維生素的總稱。ChP2010主要收載有：維生素D2、D3原料藥，維生素D2膠丸和注射劑，維生素D3注射劑等。81一、結構及性質(一)結構維生素D2（9,10-開環(huán)麥角甾-四烯-3β-醇）（骨化醇）維生素D3（9,10-開環(huán)膽甾-三烯-3β-醇）（膽骨化醇）開環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應。1234567810982(二)性質1.性狀

維生素D2、D3均為無色針狀結晶或白色結晶性粉末；無臭，無味。2.溶解性

維生素D2、D3不溶于水，溶于三氯甲烷、乙醇、乙醚和丙酮。3.不穩(wěn)定性

維生素D2、D3含多個雙鍵，不穩(wěn)定，遇光或空氣及其他氧化劑易氧化變質。4.旋光性

維生素D2有6個手性碳原子

維生素D3有5個手性碳原子5.顯色反應

甾醇類化合物共有6.UV共軛多烯83二、鑒別試驗（一）顯色反應三氯化銻反應橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應綠色84（二）比旋度鑒別維生素D2維生素D3溶劑

濃度比旋度值無水乙醇無水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°注意事項：應于容器開啟30分鐘內取樣在溶液配制后30分鐘內測定+105°～+112°85（三）區(qū)別反應以96%乙醇為溶劑，加乙醇和85%硫酸D2顯紅色，在570nm處有最大吸收D3顯黃色，在495nm處有最大吸收（四）其他方法

TLC、HPLC、制備衍生物測熔點86三、雜質檢查維生素D2中麥角甾醇的檢查：加洋地黃皂苷溶液，混合，放置18h不得發(fā)生渾濁或沉淀。前維生素D的光照產(chǎn)物87四、含量測定方法ChP：采用正相高效液相色譜法測定維生素D的含量，定量方法為內標法。內標物：鄰苯二甲酸二甲酯

固定相：硅膠

流動相：正己烷-正戊醇（997：3）USP：化學法、色譜法和微生物法BP：化學法、色譜法和光譜法88第五節(jié)維生素E的分析維生素E是α-生育酚及其各種酯類。一、結構及性質(一)結構苯并二氫吡喃醇α-生育酚12345678α-生育酚醋酸酯89（二）性質1.溶解性

維生素E為微黃色或黃色透明的粘稠液體，易溶于乙醇、丙酮和乙醚等有機溶劑，不溶于水。2.水解性

H+或OH-Δ游離生育酚[O]3.氧化性

生育醌904.UV特征芳環(huán)其無水乙醇溶液在284nm處有最大吸收，吸收系數(shù)為41.0-45.0。91（一）硝酸反應二、鑒別試驗HNO3水解維生素Eα-生育酚HNO375℃，[O]生育紅方法：取本品30mg，加無水乙醇l0ml溶解后，加硝酸2ml，搖勻，在75℃。加熱約15分鐘，溶液應顯橙紅色。本法簡便、快速，呈色反應明顯。ChP2010和JP15均采用本法鑒別。92（二）三氯化鐵反應KOHΔ維生素Eα-生育酚Fe3+對-生育醌Fe2++紅色93方法：取本品10mg，加乙醇KOH試液2ml，煮沸5分鐘，放冷，加水4ml和乙醚10ml，振搖，靜置分層；取乙醚液2ml，加2,2’-聯(lián)吡啶的乙醇溶液數(shù)滴和FeCl3的乙醇溶液數(shù)滴，應顯血紅色。94

=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無水乙醇溶液（三）UV法95薄層板硅膠G展開劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7（四）TLC法（五）GC、IR96三、雜質檢查ChP規(guī)定本品須檢查酸度、游離生育酚、有關物質和殘留溶劑。（一）酸度

目的：檢查維生素E制備過程中引入的游離醋酸。

方法：以NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定。971.原理利用游離生育酚的還原性，將硫酸鈰還原成硫酸亞鈰（二）生育酚

鈰量法檢查游離生育酚反應摩爾比1:2試劑：硫酸鈰滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黃→灰紫）+2Ce4++2Ce3+982.方法取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用0.01mol/L硫酸鈰液滴定，消耗硫酸鈰液≤1.0ml。99（三）有關物質

方法取本品，用正己烷稀釋成每1ml含2.5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，用正己烷稀釋成1ml含25μg的溶液，作為對照溶液。用氣相色譜測定。限量α-生育酚的峰面積不得大于對照溶液主峰面積其他單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1.5倍各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的2.5倍(1.0%)(1.5%)(2.5%)100（四）殘留溶劑（正己烷）

方法取本品，用二甲基甲酰胺稀釋成每1ml含50mg的溶液，作為供試品溶液；另取正己烷，加二甲基甲酰胺稀釋成1ml含10μg的溶液，作為對照品溶液。照殘留溶劑測定法（毛細管柱頂空進樣等溫法）試驗，含正己烷應符合規(guī)定。101四、含量測定硫酸鈰直接滴定法比色法GCHPLC熒光分光光度法102（一）GC法特點選擇性好靈敏度高速度快分離效能好ChP收載的維生素E原料藥及其制劑均采用本法測定103內標法加校正因子載氣：氮氣固定相：硅酮（OV—17）檢測器：氫火焰離子化檢測器柱溫：265℃柱效：理論塔板數(shù)按維生素E峰計算應不低于500分離度：維生素E峰與內標物質峰的分離度應大于2內標物：正三十二烷

104（二）HPLC法JP15采用HPLC法測定維生素E含量，以外標法定量。固定相：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相：甲醇-水（49:1）檢測波長：292nm系統(tǒng)適用性試驗：R＞2.6，RSD≤0.8%1.色譜條件2.方法取維生素E供試品和生育酚對照品各0.05g，溶于無水乙醇，并稀釋至50ml，即得供試品溶液和對照品溶液；精密吸取兩種溶液各20μl，注入HPLC儀，記錄色譜圖。105（三）熒光分光光度法采用同步熒光掃描法測定血清中VitE的含量常用熒光測定方法：是確定激發(fā)（或發(fā)射）波長在一定波長范圍內掃描發(fā)射（或激發(fā)）光譜。同步熒光掃描技術：是同時掃描激發(fā)和發(fā)射波長，由此測得熒光強度與對應的激發(fā)波長（或發(fā)射波長）構成的圖譜。維生素E的熒光峰和溶劑的拉曼光譜重疊，影響測定的靈敏度和準備度?？上軇├庾V的干擾，提高測定的靈敏度和準備度。106激發(fā)波長

295nm發(fā)射波長325nm普通熒光同步熒光(恒波長，Δλ=40nm)107維生素E水解性氧化性與硝酸反應——鑒別與三氯化鐵反應——鑒別和含量測定與硫酸鈰反應——雜質檢查和含量測定UV——鑒別108維生素A維生素B維生素C維生素E

A.氨基嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)

B.共軛多烯側鏈

C.苯并二氫吡喃

D.烯二醇和內酯環(huán)

E.β-內酰胺環(huán)和氫化噻唑環(huán)練習題BADC1092.維生素A的含量測定方法有A.汞量法

B.三點校正紫外分光光度法

C.碘量法D.雙相滴定法

E.三氯化銻比色法

1103.下列藥物的堿性溶液，加入鐵氰化鉀后，再加正丁醇，顯藍色熒光的是A.維生素AB.維生素B1

C.維生素CD.維生素D