第三部分細(xì)胞工程

第三部分細(xì)胞工程第一頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

以細(xì)胞為基本單位，在體外條件下進(jìn)行培養(yǎng)、繁殖，或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特性按人們的意愿發(fā)生改變從而達(dá)到改良生物品種和創(chuàng)造新品種，加速繁育動(dòng)、植物個(gè)體，或獲得某種有用的物質(zhì)的過(guò)程。第二頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、植物組織培養(yǎng)：

用無(wú)菌方法，使植物體的離體器官、組織和細(xì)胞在人為提供的條件下生長(zhǎng)和發(fā)育的培養(yǎng)技術(shù)的總稱。2、外植體：

由活植物體上切取下來(lái)以進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官。一、植物組織培養(yǎng)中的幾個(gè)基本概念第三頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、植株培養(yǎng)：

以具備完整植株形態(tài)的材料（如幼苗和較大的植株）為外植體的無(wú)菌培養(yǎng)。4、胚胎培養(yǎng)：

以從胚珠中分離出來(lái)的成熟或未成熟胚為外植體的離體無(wú)菌培養(yǎng)。第四頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一5、器官培養(yǎng)：

以植物的根、莖、葉、花、果等器官為外植體的離體無(wú)菌培養(yǎng)。6、組織培養(yǎng)：

以分離出植物各部位的組織（如分生組織形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮、皮層、胚乳組織、薄壁組織、髓部等），或已誘導(dǎo)的愈傷組織為外植體的離體無(wú)菌培養(yǎng)。第五頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、細(xì)胞工程的分類根據(jù)研究對(duì)象的不同：1）植物細(xì)胞工程

2）動(dòng)物細(xì)胞工程

3）微生物細(xì)胞工程第六頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一植物細(xì)胞工程包括：植物組織、器官培養(yǎng)技術(shù)；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；原生質(zhì)體融合與培養(yǎng)技術(shù)；亞細(xì)胞水平的操作技術(shù)等。第七頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一動(dòng)物細(xì)胞工程包括：

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)）；胚胎工程技術(shù)（核移植、胚胎分割等）；

克隆技術(shù)（單細(xì)胞系克隆、器官克隆、個(gè)體克?。?；細(xì)胞融合技術(shù)。第八頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一1997年2月，英國(guó)科學(xué)家Wilmut等在世界權(quán)威雜志《Nature》上首例報(bào)道了世界第一只克隆羊的誕生。第九頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一多莉羊的培育過(guò)程卵細(xì)胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠融合后的卵細(xì)胞第十頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備

和操作技術(shù)

1、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)

2、基本操作技術(shù)

3、培養(yǎng)基及其配制第十一頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)第十二頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室它必須滿足三個(gè)基本的需要，即：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（培養(yǎng)基配制，洗滌與滅菌）；無(wú)菌操作；控制培養(yǎng)。第十三頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一從總體上來(lái)分，實(shí)驗(yàn)室主要分為兩類：基本實(shí)驗(yàn)室：輔助實(shí)驗(yàn)室：實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)第十四頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、基本實(shí)驗(yàn)室：準(zhǔn)備室接種室培養(yǎng)室第十五頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

作用

植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)所需器具的洗滌、干燥和保存；培養(yǎng)基的配制、分裝和滅菌；化學(xué)試劑的配制；重蒸餾水的生產(chǎn)等。

設(shè)計(jì)要求

面積20m2左右。通風(fēng)透光，地面防滑，墻面防潮。準(zhǔn)備室第十六頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一▲實(shí)驗(yàn)臺(tái)架▲大、小水槽▲烘箱▲冰箱▲天平系列▲

pH計(jì)▲高壓消毒鍋▲各種玻璃器皿▲藥品柜▲（磁力）攪拌器▲電爐▲蒸餾水器

設(shè)備第十七頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一接種室

——也叫無(wú)菌操作室作用

供外植體的接種，培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移和原生質(zhì)體的游離培養(yǎng)操作之用。第十八頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一無(wú)菌室第十九頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一設(shè)計(jì)要求

墻壁光滑平整，地面平坦無(wú)縫，除出入口和通氣口外，應(yīng)當(dāng)密閉，空氣不能對(duì)流，或者空氣經(jīng)凈化后進(jìn)入室內(nèi)。無(wú)菌室旁邊應(yīng)設(shè)有緩沖間，緩沖間內(nèi)應(yīng)有紫外燈，隨時(shí)可進(jìn)行滅菌。第二十頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

無(wú)菌室內(nèi)的日常滅菌：定期用甲醛和高錳酸鉀混合后熏蒸，產(chǎn)生大量蒸汽，殺滅微生物。

使用前處理：用新潔爾滅（1：50）擦凈，然后用紫外燈照射滅菌至少20分鐘，操作前用70%酒精噴霧。第二十一頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一設(shè)備△紫外光燈△空調(diào)△放物架（或醫(yī)用小平車：推送、放置培養(yǎng)基用；）△無(wú)菌操作用的器具：酒精燈、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背鑷子、解剖針、剪刀等。第二十二頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一△超凈工作臺(tái)：內(nèi)設(shè)紫外燈、吹風(fēng)裝置、過(guò)濾裝置等每次實(shí)驗(yàn)前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過(guò)程中注意一直開(kāi)著吹風(fēng)機(jī)，并且一定要關(guān)掉紫外燈，過(guò)濾網(wǎng)應(yīng)經(jīng)常清洗。第二十三頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一其它部件：△離心機(jī)：分離原生質(zhì)體用；△點(diǎn)融合儀：細(xì)胞融合用。第二十四頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一3培養(yǎng)室第二十五頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

離體組織和試管苗生長(zhǎng)發(fā)育的場(chǎng)所，應(yīng)為培養(yǎng)物創(chuàng)造適宜的溫、光、氣等條件。設(shè)計(jì)要求

培養(yǎng)室內(nèi)要求內(nèi)壁保溫、光滑、室頂高2.6m左右，易于控制溫、濕度，窗上要求裝雙層密封玻璃窗，室內(nèi)有足夠電源。

作用第二十六頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一設(shè)備△

空調(diào)機(jī)：冷暖型△

加熱器△

定時(shí)裝置：控制光照時(shí)間△

培養(yǎng)架：放置培養(yǎng)瓶△

搖床和轉(zhuǎn)床：懸浮培養(yǎng)△

各種光質(zhì)燈管：光照培養(yǎng)△

溫度計(jì)：控制溫度△

遮光簾：供暗培養(yǎng)之用第二十七頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、輔助實(shí)驗(yàn)室：細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室攝影室及暗室生化分析室第二十八頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室主要設(shè)備

各種顯微鏡，顯微照相設(shè)備，切片、制片儀器設(shè)備，染色用具，暗房設(shè)備等。

作用

植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需隨時(shí)觀察記錄其細(xì)胞學(xué)和形態(tài)解剖學(xué)的變化，故要設(shè)置細(xì)胞顯微觀察室。第二十九頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三十頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一理化分析試驗(yàn)室第三十一頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一二、基本操作技術(shù)第三十二頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

基本操作技術(shù)主要是圍繞無(wú)菌操作技術(shù)展開(kāi)的一系列操作技能，內(nèi)容主要包括：一．洗滌技術(shù)二．滅菌、消毒技術(shù)三、培養(yǎng)基配置技術(shù)四、接種技術(shù)第三十三頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一（一）、洗滌技術(shù)、洗滌目的：去除雜物，降低帶菌量、根據(jù)洗滌對(duì)象的不同，主要分為：器皿洗滌（包括玻璃、塑料、搪瓷、不銹鋼器皿）培養(yǎng)材料洗滌第三十四頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

一）器皿洗滌根據(jù)洗滌對(duì)象的具體情況可分為以下三種：特殊洗滌微生物大量污染的洗滌常規(guī)洗滌第三十五頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

常規(guī)洗滌△

自來(lái)水洗去油漬、霉菌等臟物；△溫肥皂水中浸泡一定時(shí)間后用刷子刷凈；△自來(lái)水沖洗干凈，至瓶壁不掛水珠為止；△蒸餾水淋洗內(nèi)外壁△將玻璃器皿倒置：晾干或烘干（50～75℃）△放入除塵柜中備用第三十六頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

微生物大量污染的洗滌△

微生物污染器皿加壓滅菌后再洗滌特殊洗滌（如沾有蛋白質(zhì)類物質(zhì)或其它有機(jī)物時(shí))△

經(jīng)過(guò)常規(guī)洗滌未過(guò)蒸餾水的器具，浸泡入洗液（鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成）中數(shù)分至數(shù)小時(shí)；△

回收洗液，器具先用自來(lái)水洗凈，蒸餾水淋洗，烘干（75℃）第三十七頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

二）、試驗(yàn)材料的清洗

清洗目的：來(lái)自自然界的試驗(yàn)材料，包括來(lái)自土壤中的幼莖、磷莖，滋生著各種微生物，尤其是細(xì)菌的芽孢和真菌的孢子，一旦與培養(yǎng)基接觸，就會(huì)很快的繁殖起來(lái)，造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的污染。

清洗方法：先用自來(lái)水沖洗5分鐘，然后用中性洗滌劑清洗，注意勿損傷試驗(yàn)材料。再用自來(lái)水流水沖洗半小時(shí)，用于下一步的藥劑滅菌。第三十八頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）、滅菌、消毒技術(shù)

一）關(guān)于有菌和無(wú)菌的概念有菌的范疇：

凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超凈工作臺(tái)的臺(tái)面，未處理的工具和手等。第三十九頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

高壓高溫處理（工具、器皿、培養(yǎng)基等）物理或化學(xué)處理；火烤后的物體；健康的動(dòng)植物不與內(nèi)外部表面接觸的組織內(nèi)部可能是無(wú)菌的（有時(shí)也有內(nèi)生菌，但不會(huì)影響培養(yǎng)，也不會(huì)污染）無(wú)菌的范疇：第四十頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

二）滅菌、消毒技術(shù)作用和意義

植物組培中，凡用于培養(yǎng)和無(wú)菌操作的房間、器具、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)基，培養(yǎng)材料和操作者的衣物和手都應(yīng)隨時(shí)進(jìn)行滅菌，以確保不受雜菌污染，否則，由于雜菌的生長(zhǎng)繁殖速度一般都比培養(yǎng)的組織快得多，最終將把組織全部殺死，這些污染微生物還可能排泄對(duì)植物組織有毒的代謝廢物，因此在培養(yǎng)容器內(nèi)部保持一個(gè)完全無(wú)菌的環(huán)境是絕對(duì)必須的。第四十一頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

三）滅菌、消毒種類物理方法：

物理滅菌：高溫高壓滅菌（干熱/濕熱）、烘烤或灼燒滅菌、射線處理、超聲波等

物理除菌：過(guò)濾（0.25微米）、離心沉淀等；化學(xué)方法：使用滅菌劑，如薰蒸滅菌、消毒液滅菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新潔爾滅、次氯酸鈉、過(guò)氧化氫）第四十二頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一消毒、滅菌的對(duì)象：

★接種室

★材料（外植體）：★器皿用具消毒（滅菌）★培養(yǎng)基第四十三頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

四）、培養(yǎng)基、器具的滅菌

用滅菌鍋滅菌：一般121℃，滅菌20分鐘。自動(dòng)鍋：加足水后，調(diào)好時(shí)間、溫度、即可自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)。

手動(dòng)鍋：加足水后，關(guān)好，通電。待壓力升到0.5kg／C㎡時(shí)，打開(kāi)排氣閥排除鍋內(nèi)的冷空氣。然后關(guān)閉排氣閥，升至1.1kg／C㎡(121℃左右)時(shí)計(jì)時(shí)，用通電、斷電來(lái)保持20分鐘。后斷電待壓力降至?xí)r取出。

器具的滅菌：也可用烘箱160℃，90～120分鐘第四十四頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

五）、過(guò)濾除菌培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要過(guò)濾滅菌或者兩者結(jié)合。另外酶等也需要過(guò)濾滅菌；

滅菌方法：將激素或酶配成一定濃度，用注射器過(guò)慮，0.2－0.25微米。配制培養(yǎng)基時(shí)，先將培養(yǎng)基高壓滅菌，待溫度降至50℃左右時(shí)，加入適量的已過(guò)慮除菌的激素等，然后分裝。第四十五頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一

六）、外植體的消毒：

取材將老的組織去掉自來(lái)水沖洗清潔劑水洗（簡(jiǎn)單殺菌）自來(lái)水沖洗

70％酒精處理消毒劑處理滅菌蒸餾水沖洗3－5遍。

消毒時(shí)間，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，較老的材料相對(duì)殺菌時(shí)間較長(zhǎng)，反之，較短。一般殺菌，酒精10秒，升汞5－12分鐘。第四十六頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一消毒劑

使用濃度(％)消毒時(shí)間(分)效果殘液去除難易次氯酸鈣105～30好易次氯酸鈉

2～55～30好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞

0.1～12～10最好最難過(guò)氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mg/L30～60較好較難幾種常用消毒劑的效果比較第四十七頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一根據(jù)離體培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求，培養(yǎng)基至少包括：

無(wú)機(jī)鹽；

有機(jī)化合物；

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（三）、培養(yǎng)基及其配制第四十八頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一一）、培養(yǎng)基的基本成分Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B1無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、大量元素：C、H、ON、P、K、Ca、Mg、S、(Na)、微量元素：第四十九頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一無(wú)機(jī)鹽的作用：一是組成各種化合物，參與機(jī)體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；二是構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如植物激素、酶以及酶的活化劑，參與植物的代謝活動(dòng)；三是這些元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等生物電化學(xué)方面的作用；四是在發(fā)育過(guò)程中，影響組織器官的建成。第五十頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一濃度：2%-3%2有機(jī)物質(zhì)糖：作用：維持培養(yǎng)基合適的滲透壓為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量種類：蔗糖、葡萄糖麥芽糖、果糖等多糖：可溶性淀粉第五十一頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一生理活性物質(zhì)維生素：

種類：硫胺素(VB1)、煙酸（VB3）、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸銨、鈷胺素(VB12)、葉酸(VM又稱VB11)、抗壞血酸(VC)等.作用：利于細(xì)胞代謝和器官分化。B1是植物組培必須加入的維生素，其用量在0.1-30mg/L之間，當(dāng)組培中細(xì)胞分裂素特別少時(shí)，B1更為需要；煙酸和B6可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。第五十二頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（激素）

在培養(yǎng)基中，其各種成分對(duì)培養(yǎng)物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類、濃度、以及配比都會(huì)顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的分化，胚狀體的形成等；

組織培養(yǎng)中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）。第五十三頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類1、生長(zhǎng)素2、細(xì)胞分裂素3、赤霉素:GA34、脫落酸：ABA5、其它：如乙烯第五十四頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一常用的生長(zhǎng)素有：

二氯苯氧乙酸（2，4－D）

；

萘乙酸（NAA）

吲哚乙酸（

IAA）

；

吲哚－3－丁酸（IBA）

萘氧乙酸（NOA）

；

對(duì)氯苯氧乙酸（P-CPA）

三氯苯氧乙酸（2，4，5－T）；

生根粉（ABT）如：NAA、IAA、

IBA易引起生根，

2，4－D、2，4，5－T有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。第五十五頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一主要作用：是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生；作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?/p>

2，4-D>NAA>IBA>IAA第五十六頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一常用的細(xì)胞分裂素有：

6－芐基嘌呤（BAP）；

6－芐基腺嘌呤（6－BA）；

激動(dòng)素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）；

玉米素（ZT）；

異戊烯氨基嘌呤（2－IP）

噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）；

溶解方法：0.1MHCL

保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存第五十七頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一主要作用：促進(jìn)細(xì)胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老、增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成、抑制頂端優(yōu)勢(shì)、促進(jìn)側(cè)芽的生長(zhǎng)及顯著改變其他的激素作用；作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篫T>2-iP>6-BA>KT。第五十八頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一作用：提供一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性物質(zhì)和生長(zhǎng)激素等。這類物質(zhì)常指天然提取物：

麥芽提取物、

椰乳、

鮮果汁、

酵母提取物4、其它有益有機(jī)添加物或未知復(fù)合成分第五十九頁(yè)，共六十四頁(yè)，編輯于2023年，星期一瓊脂:是從海藻中提取的一種高分子碳水化合物，其主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固，但不參與代謝。

活性炭:主要目的是利用其吸附能力，減少一些有害物質(zhì)的影響，如可以防止酚類物質(zhì)污染而引起組織褐化死亡。

5、附加物