生化工藝第三章培養(yǎng)基的選擇與滅菌

第六節(jié)

培養(yǎng)基的滅菌方法及原理問(wèn)題1在發(fā)酵生產(chǎn)中，為什么要進(jìn)行滅菌操作？P491、由于雜菌的污染，使生物反應(yīng)中的培養(yǎng)物質(zhì)因雜菌的消耗而損失，造成生產(chǎn)能力的下降；2、由于雜菌所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，或在染菌后改變了培養(yǎng)液的某些理化特性，使產(chǎn)物的提取和分離變得困難，造成收率降低或使產(chǎn)品的質(zhì)量下降；3、雜菌會(huì)大量繁殖，會(huì)改變反應(yīng)介質(zhì)的PH值，從而使生物反應(yīng)發(fā)生異常變化；4、雜菌可能會(huì)分解產(chǎn)物，從而使生產(chǎn)過(guò)程失??；5、發(fā)生噬菌體污染，微生物細(xì)胞被裂解，而使生產(chǎn)失敗，等等。1、培養(yǎng)基如何分類？在發(fā)酵生產(chǎn)中常用的固體還是液體培養(yǎng)基？2、說(shuō)說(shuō)培養(yǎng)基的六大營(yíng)養(yǎng)要素？復(fù)習(xí)根據(jù)培養(yǎng)基的用途(特殊用途)不同，可將培養(yǎng)基分成：孢子\種子\發(fā)酵

增殖、選擇和鑒別培養(yǎng)基

根據(jù)培養(yǎng)基狀態(tài)不同，可將培養(yǎng)基分成：

固體、液體和半固體培養(yǎng)基

根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源不同，培養(yǎng)基可分為：

天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基

當(dāng)前第1頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)一、滅菌的方法

問(wèn)題2為防止雜菌的污染，整個(gè)生化生產(chǎn)過(guò)程哪些需要注意滅菌？消毒與滅菌的區(qū)別？

消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中均有廣泛應(yīng)用。消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。例如，用于消牛奶、啤酒和釀酒原汗等的巴氏消毒法，是將物料加熱至60℃維持30min，以殺死不耐高溫的物料中的微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。

滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物，包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。

消毒不一定能達(dá)到滅菌要求，而滅菌則可達(dá)到消毒的目的。

培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣、菌種制作基本概念當(dāng)前第2頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)控制有害微生物主要有以下幾種措施

當(dāng)前第3頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)1、滅菌（sterilization）采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施，稱為滅菌，例如各種高溫滅菌措施等。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。當(dāng)前第4頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第5頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)2、消毒（disinfection）從字義上來(lái)看，消毒就是消除毒害，這里的“毒害”就是指?jìng)魅驹椿蛑虏【囊馑?，英文中的“dis-infection”也是“消除傳染”的意思。所以，消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的病原菌，而對(duì)被消毒的物體基本無(wú)害的措施。當(dāng)前第6頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)3、防腐（antisepsis）防腐就是利用某種理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到防止食品等發(fā)生霉腐的措施。（1）低溫（2）缺氧（3）干燥

（4）高滲

（5）高酸度

（6）防腐劑當(dāng)前第7頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)4、化療（chemotherapy）化療即化學(xué)治療。它是利用具有高度選擇毒力（即對(duì)病原菌具有高度毒力而對(duì)宿主無(wú)顯著毒性）的化學(xué)物質(zhì)來(lái)抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長(zhǎng)繁殖，借以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。用于化療目的的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)治療劑。最重要的化學(xué)治療劑如各種抗生素、磺胺類藥物和中草藥中的有效成分等。

當(dāng)前第8頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)1、化學(xué)試劑滅菌法化學(xué)試劑：甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等適用范圍：環(huán)境空氣、皮膚及器械的表面消毒2、射線滅菌法3、干熱滅菌法電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)適用范圍：無(wú)菌室、接種箱常用烘箱，滅菌條件為在160℃下保溫1h適用范圍：金屬或玻璃器皿當(dāng)前第9頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)4、濕熱滅菌法利用飽和蒸汽進(jìn)行滅菌、條件為：121℃，30min適用范圍：廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌

例：高壓滅菌鍋5、過(guò)濾除菌法利用過(guò)濾方法阻留微生物適用范圍：制備無(wú)菌空氣6、火焰滅菌法火焰適用范圍：接種針、玻璃棒、三角瓶口酒精燈當(dāng)前第10頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)滅菌方法連線題接種針、試管口環(huán)境空氣、皮膚表面無(wú)菌室、接種箱培養(yǎng)基的滅菌空氣過(guò)濾除菌法火焰滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法化學(xué)試劑滅菌法比較各種微生物對(duì)熱的抵抗能力大小營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢、病毒或孢子當(dāng)前第11頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)二、濕熱滅菌原理濕熱滅菌原理P50滅菌條件滅菌不利方面由于蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力，而且在冷凝時(shí)會(huì)放出大量的冷凝熱(潛熱)，很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。121℃，30min。同時(shí)也會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，甚至?xí)a(chǎn)生不利于菌體生長(zhǎng)的物質(zhì)。因?yàn)?，在工業(yè)培養(yǎng)過(guò)程中，除了盡可能殺死培養(yǎng)基中的雜菌外，還要盡可能減少培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的損失當(dāng)前第12頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)1、衡量熱滅菌指標(biāo)P51

熱死時(shí)間：即在規(guī)定溫度下殺死一定比例的微生物所需要的時(shí)間。致死溫度：殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間：在此溫度下，殺死全部微生物所需要的時(shí)間。P51表3－15和3－16熱阻：對(duì)熱的抵抗力，指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻：幾種微生物對(duì)熱的相對(duì)抵抗能力。指微生物在某一特定條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。表3-17列出了某些微生物的相對(duì)熱阻。

滅菌方式大腸桿菌霉菌孢子細(xì)菌芽孢噬菌體或病毒干熱滅菌12-1010001濕熱滅菌12-103×1051-5苯酚11-21×10930甲醛12-102502紫外線15-1002-55-10當(dāng)前第13頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)從表中可看出

芽孢或孢子的熱阻要比生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的熱阻大得多，這是由于芽孢或孢子內(nèi)吡啶二羧酸含量對(duì)熱阻的增加有關(guān)。另外，芽孢子中蛋白質(zhì)含水量較營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞低（特別是游離水分少），也是芽孢耐熱強(qiáng)的一個(gè)原因。圖3-3和圖3-4分別為大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和FS7954芽孢桿菌的芽孢在不同溫度下的死亡情況。

10t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-42468106058565410t(min)N/N0嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-4510152025121116110108105從表中可看出問(wèn)題說(shuō)說(shuō)芽孢或孢子的熱阻要比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的熱阻大的原因？當(dāng)前第14頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)比較熱阻大小營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢、病毒或孢子說(shuō)說(shuō)工業(yè)化生產(chǎn)中廣泛使用濕熱滅菌法優(yōu)缺點(diǎn)？問(wèn)題當(dāng)前第15頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第16頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)受熱時(shí)間如何確定？在發(fā)酵工業(yè)中，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌，廣泛使用濕熱滅菌法。工廠里，蒸汽比較容易獲得，控制操作條件方便，是一種簡(jiǎn)單而又價(jià)廉、有效的滅菌方法。用濕熱滅菌的方法處理培養(yǎng)基，其加熱受熱時(shí)間與滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞都有關(guān)系。營(yíng)養(yǎng)成分的減少將影響菌種的培養(yǎng)和產(chǎn)物的生成，所以滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞成為滅菌工作中的主要矛盾，恰當(dāng)掌握加熱受熱時(shí)間是滅菌工作的關(guān)鍵。當(dāng)前第17頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)2、微生物的死亡速率：對(duì)數(shù)殘留定律P52

微生物受熱死亡的原因，主要是因高溫使微生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì)，如酶等，發(fā)生凝固、變性，從而導(dǎo)致微生物無(wú)法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力，但其物理性質(zhì)不變。

在一定溫度下，微生物的受熱死亡遵照分子反應(yīng)速度理論。在滅菌過(guò)程中，活菌數(shù)逐漸減少，其減少量隨殘留活菌數(shù)的減少而遞減，即微生物的死亡速率與任一瞬時(shí)殘存的活菌數(shù)成正比，

當(dāng)前第18頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)式中，N—?dú)埓娴幕罹鷶?shù)；t—滅菌時(shí)間（s）；K—滅菌速度常數(shù)（s-1），也稱反應(yīng)速度常數(shù)或比死亡速度常數(shù)，此常數(shù)的大小與微生物的種類與加熱溫度有關(guān)；dN/dt—活菌數(shù)瞬時(shí)變化速率，即死亡速率。積分得：

式中：N0—開(kāi)始滅菌（t=0）時(shí)原有活菌數(shù)；Nt----經(jīng)時(shí)間t后殘存活菌數(shù)。微生物的死亡速率與任一瞬時(shí)殘存的活菌數(shù)成正比

上式是計(jì)算滅菌的基本公式，滅菌速度常數(shù)K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。各種微生物在同樣的溫度下K值是不同的，K值愈小，則此微生物愈耐熱。當(dāng)前第19頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)10t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-424681060嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線58565410t(min)N/N010-110-210-310-4510152025121116110108105從表中可看出問(wèn)題在121度，枯草桿菌FS5230的K為0.047s-1，梭狀芽孢桿菌PA3679的K值為0.03s-1，請(qǐng)問(wèn)哪一種微生物更耐熱？1）如微生物存在芽孢，其死亡速率呈現(xiàn)非對(duì)數(shù)死亡定律;2)培養(yǎng)液中油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會(huì)增加微生物的耐熱性；高濃度鹽類、色素能削減其耐熱性;3）工程上，在進(jìn)行滅菌的設(shè)計(jì)時(shí)，常認(rèn)為N/N0=0.001，即在1000次滅菌中，允許有一次失敗;4)同一種微生物在不同的滅菌溫度下，k值不同，滅菌溫度愈低，k值愈小；溫度愈高，k值愈大。注：從上述的微生物對(duì)數(shù)死亡規(guī)律和非對(duì)數(shù)死亡動(dòng)力學(xué)模型方程式可知，如果要達(dá)到徹底滅菌，即滅菌結(jié)束時(shí)殘留的活微生物數(shù)等于0，則滅菌所需的時(shí)間應(yīng)為無(wú)限長(zhǎng)，這在實(shí)際中是不可能的。當(dāng)前第20頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)3、滅菌溫度和時(shí)間的選擇微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng)，其滅菌速率常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示：A---頻率常數(shù)，也稱阿累尼烏斯常數(shù)，s-1；R---氣體常數(shù)，8.314J/mol·K；T---絕對(duì)溫度，K；ΔE---微生物死亡活化能，J/mol。K—滅菌速度常數(shù)（s-1），也稱反應(yīng)速度常數(shù)或比死亡速度常數(shù).上面說(shuō)過(guò)，當(dāng)培養(yǎng)基被加熱滅菌時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)這樣的矛盾，這就是，加熱時(shí)，微生物固然會(huì)被殺死，但培養(yǎng)基中的有用成分也會(huì)隨之遭到破壞，那么有何良策可以既達(dá)到滅菌要求，同時(shí)又不破壞或盡可能少破壞培養(yǎng)基中的有用成分呢？實(shí)踐證明，在高壓加熱的情況下，培養(yǎng)基中的氨基酸和維生素極易被破壞，如在121℃，僅20min，就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被破壞，蛋氨酸和色氨酸也有相當(dāng)數(shù)量被破壞。因此，必須選擇一個(gè)既能滿足滅菌需要，又可使培養(yǎng)基的破壞盡可能養(yǎng)活的滅菌工藝條件。當(dāng)前第21頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)K`與溫度之間的關(guān)系也可用阿累尼烏斯公式表示：K`---培養(yǎng)基內(nèi)易被破壞成分的分解速率常數(shù)；A`---頻率常數(shù)，也稱阿累尼烏斯常數(shù)，s-1；R---氣體常數(shù)，8.314J/mol·K；T---絕對(duì)溫度，K；ΔE`---培養(yǎng)基成分分解所需活化能，J/mol。

當(dāng)培養(yǎng)基成分從T1上升到T2時(shí)，微生物的死亡速率與培養(yǎng)基的分解有如下關(guān)系：從上式可知，K值的大小與微生物的種類與加熱溫度有關(guān)當(dāng)前第22頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定可知：

滅菌時(shí)殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分的破壞活化能值，因此：即隨著溫度的上升，微生物的死亡速率常數(shù)增加倍數(shù)要大于培養(yǎng)基成分的破壞速率的增加倍數(shù)。也就是說(shuō)，結(jié)論1：當(dāng)滅菌溫度上升時(shí)，微生物死亡速率的提高要超過(guò)培養(yǎng)基成分的破壞速率的增加。從上述的分析可知，在熱滅菌過(guò)程中，同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過(guò)程，且這兩種過(guò)程的進(jìn)行速度都隨溫度的升高而加速，但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。據(jù)測(cè)定，每升高10℃時(shí)一般化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率的增加倍數(shù)是1.5-2.0，而殺死芽孢為5-10，殺死微生物細(xì)胞為35左右。。當(dāng)前第23頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)

由此可見(jiàn)，若要減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，可升高溫度滅菌。結(jié)論2：在滅菌時(shí)選擇較高的溫度、較短的時(shí)間，這樣便既可達(dá)到需要的滅菌程度，同時(shí)又可減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。

滅菌溫度℃滅菌時(shí)間（分）營(yíng)養(yǎng)成分破壞量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0

表3-21滅菌溫度、時(shí)間與營(yíng)養(yǎng)成分破壞量的關(guān)系（N/No=0.001）

當(dāng)前第24頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)問(wèn)題滅菌要達(dá)到殺死99.99%的細(xì)菌芽孢，有兩種方法可以采用，一種是118℃滅菌15min，另一種是128℃滅菌5min。哪一種方法好，為什么？答：從理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐都可證明，在滅菌過(guò)程中，同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過(guò)程，且這兩種過(guò)程的進(jìn)行速度都隨溫度的升高而加速，但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。

因此，對(duì)于同一滅菌效果，選擇較高的溫度、較短的時(shí)間，這樣便既可達(dá)到需要的滅菌程度，同時(shí)又可減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。當(dāng)前第25頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)第七節(jié)培養(yǎng)基的濕熱滅菌方式及滅菌時(shí)間的計(jì)算1、間歇滅菌（分批滅菌、實(shí)消）P56定義：將配制好的培養(yǎng)基同時(shí)放在發(fā)酵罐或其他裝置中，通入蒸汽將培養(yǎng)基和所用設(shè)備一起進(jìn)行加熱滅菌的過(guò)程，通常也稱為實(shí)罐滅菌。（常用）24016012080時(shí)間（min)050100150溫度升溫冷卻保溫過(guò)程包括：升溫、保溫和冷卻等三個(gè)階段。

各階段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn)：20%、75%、5%圖為培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中的溫度變化情況。1）基本概念一、培養(yǎng)基的濕熱滅菌方式當(dāng)前第26頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)

在實(shí)際生產(chǎn)中，也可能遇到所供蒸汽不足、溫度不夠高的情況，這時(shí)可以適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。生產(chǎn)上甚至有用100℃蒸煮而達(dá)到徹底滅菌的實(shí)例。如要做固體曲而沒(méi)有高溫蒸汽時(shí)，可將原料用100蒸汽蒸30min，殺死其中的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，但孢子與細(xì)菌的芽孢沒(méi)有被殺死。將蒸過(guò)的原料置于室溫下過(guò)夜，未被殺死的孢子便發(fā)芽生長(zhǎng)，芽孢發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，再30min便可殺死。如此連續(xù)反復(fù)進(jìn)行2-3次，亦可達(dá)到徹底滅菌的目的。

從以上分析可知，滅菌過(guò)程中加熱和保溫階段的滅菌作用是主要的，而冷卻階段的滅菌作用是次要的，一般很小，可以忽略不計(jì)。此外，還應(yīng)指出的是，應(yīng)當(dāng)避免長(zhǎng)時(shí)間的加熱階段，因?yàn)榧訜釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不僅破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且也有可能引起培養(yǎng)液中某些有害物質(zhì)的生成，從而影響培養(yǎng)過(guò)程的順利進(jìn)行。問(wèn)題

在實(shí)際生產(chǎn)中，如果遇到所供蒸汽不足，如何有用100℃蒸煮而達(dá)到徹底滅菌？家用土蒸鍋對(duì)食用菌三級(jí)種進(jìn)行滅菌當(dāng)前第27頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)2）間歇滅菌的操作間歇滅歇是在所用的發(fā)酵罐或其他培養(yǎng)裝置中進(jìn)行的，它是在配制罐中配好培養(yǎng)基后，通過(guò)專用管道輸入發(fā)酵罐等培養(yǎng)設(shè)備中，然后開(kāi)始滅菌。在進(jìn)行培養(yǎng)基的間歇滅菌之前，通常先將發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置的分空氣過(guò)濾器進(jìn)行滅菌，并且用空氣將分過(guò)濾器吹干。開(kāi)始滅菌時(shí)，應(yīng)先放去夾套或蛇管中的冷水，開(kāi)啟排氣管閥，通過(guò)空氣管向發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基通入蒸汽進(jìn)行加熱，同時(shí)，也可在夾套內(nèi)通蒸汽進(jìn)行間接加熱。當(dāng)培養(yǎng)基溫度升到70左右時(shí)，從取樣管和放料管向罐內(nèi)通入蒸汽進(jìn)一步加熱，當(dāng)溫度升至120℃，罐壓為1*105Pa（表壓）時(shí)，打開(kāi)接種、補(bǔ)料、消泡劑、酸、堿等管道閥門進(jìn)行排汽，當(dāng)然在保溫過(guò)程中，應(yīng)注意凡在培養(yǎng)基液面下的各種進(jìn)口管道都應(yīng)通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道則應(yīng)排放蒸汽，這樣才能不留死角，從而保證滅菌徹底。保溫結(jié)束后，依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥門，待罐內(nèi)壓力低于空氣壓力后，向罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣，在夾套或蛇管中通冷水降溫，使培養(yǎng)基的溫度降到所需的溫度，進(jìn)行下一步的發(fā)酵和培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基的間歇滅菌不需要專門的滅菌設(shè)備，投資少，對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，對(duì)蒸汽的要求也比較低，且滅菌效果可靠，因此，間歇滅菌是中小型生產(chǎn)工廠經(jīng)常采用的一種培養(yǎng)基滅菌方法。

當(dāng)前第28頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)2、連續(xù)滅菌（連消）P57

1）定義：將配制好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時(shí)進(jìn)行加熱、保溫和冷卻而進(jìn)行滅菌。左圖為連續(xù)滅菌過(guò)程中溫度的變化情況。由圖可以看出，連續(xù)滅菌時(shí)，培養(yǎng)基可在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫溫度，并且能很快地被冷卻，因此可在比間歇滅菌更高的溫度下進(jìn)行滅菌，而由于滅菌溫度很高，保溫時(shí)間就相應(yīng)地可以很短，極有利于減少培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞。當(dāng)前第29頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)發(fā)酵罐蒸汽蒸汽冷卻水無(wú)菌培養(yǎng)基配料罐泵加熱塔維持罐冷卻管

連續(xù)滅菌的基本設(shè)備一般包括（1）配料預(yù)熱罐，將配制好的料液預(yù)熱到60-70，以避免連續(xù)滅菌時(shí)由于料液與蒸汽溫度相差過(guò)大而產(chǎn)生水汽撞擊聲；（2）連消塔，連消塔的作用主要是使高溫蒸汽與料液迅速接觸混和，并使料液的溫度很快升高到滅菌溫度（126-132）；（3）維持罐，連消塔加熱的時(shí)間很短，光靠這段時(shí)間的滅菌是不夠的，維持罐的作用是使料液在滅菌溫度下保持5-7min，以達(dá)到滅菌的目的；（4）冷卻管，從維持罐出來(lái)的料液要經(jīng)過(guò)冷卻排管進(jìn)行冷卻，生產(chǎn)上一般采用冷水噴淋冷卻，冷卻到40-50后，輸送到預(yù)先已經(jīng)滅菌過(guò)的罐內(nèi)。當(dāng)前第30頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)噴射加熱連續(xù)滅菌流程滅菌介質(zhì)原料介質(zhì)蒸汽T=140度保溫段真空

流程中采用了蒸汽噴射器，它使培養(yǎng)液與高溫蒸汽直接接觸，從而在短時(shí)間內(nèi)可將培養(yǎng)液急速升溫至預(yù)定的滅菌溫度然后在該溫度下維持一段時(shí)間滅菌，滅菌后的培養(yǎng)基通過(guò)一膨脹閥進(jìn)入真空冷卻器急速冷卻，從圖中可以看出，由于該流程中培養(yǎng)基受熱時(shí)間短，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失也就不很嚴(yán)重，同時(shí)該流程保證了培養(yǎng)基物料先進(jìn)先出，避免了過(guò)熱或滅菌不徹底等現(xiàn)象。分別說(shuō)出優(yōu)點(diǎn)當(dāng)前第31頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)薄板換熱器連續(xù)滅菌流程進(jìn)料35℃100℃120℃維持罐120℃蒸汽147℃120℃55℃出料35℃水20℃31℃流程中采用了薄板換熱器作為培養(yǎng)液的加熱和冷卻器，蒸汽在薄板換熱器的加熱段使培養(yǎng)液的溫度升高，經(jīng)維持段保溫一定時(shí)間后，培養(yǎng)基在薄板換熱器的冷卻段進(jìn)行冷卻，從而使培養(yǎng)基的預(yù)熱、加熱滅菌及冷卻過(guò)程可在同一設(shè)備內(nèi)完成。該流程的加熱和冷卻時(shí)間比噴射加熱連續(xù)滅菌流程要長(zhǎng)些，但由于在培養(yǎng)基的預(yù)熱過(guò)程同時(shí)也起到了滅菌后培養(yǎng)基的冷卻，因而節(jié)約了蒸汽和冷卻水的用量。

分別說(shuō)出優(yōu)點(diǎn)當(dāng)前第32頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)3、間歇滅菌與連續(xù)滅菌的比較

間歇滅菌或連續(xù)滅菌都有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，現(xiàn)比較如下：滅菌方式優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)連續(xù)滅菌1.

滅菌溫度高，可減少培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失2.

操作條件恒定，滅菌質(zhì)量穩(wěn)定3.

易于實(shí)現(xiàn)管道化和自控操作4.

避免了反復(fù)的加熱和冷卻，提高了熱的利用率5.

發(fā)酵設(shè)備利用率高1.

對(duì)設(shè)備的要求高，需另外設(shè)置加熱、冷卻裝置2.

操作較麻煩3.

染菌的機(jī)會(huì)較多4.

不適合于含大量固體物料的滅菌5.

對(duì)蒸汽的要求高間歇滅菌1.

設(shè)備要求低，不需另外設(shè)置加熱、冷卻裝置2.

操作要求低，適于手動(dòng)操作3.

適合于小批量生產(chǎn)規(guī)模4.

適合于含有大量固體物質(zhì)的培養(yǎng)基的滅菌1.

培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失較多，滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量下降2.

需進(jìn)行反復(fù)的加熱和冷卻，能耗較高3.

不適合于大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程的滅菌4.

發(fā)酵罐的利用率較低加熱器、維持罐（管）和冷卻器以及發(fā)酵罐等都應(yīng)先進(jìn)滅菌由表可見(jiàn)，無(wú)論在理論上或者在實(shí)踐上，與間歇滅菌過(guò)程相比，連續(xù)滅菌的優(yōu)點(diǎn)十分明顯。因此，連續(xù)滅菌越來(lái)越多地被用培養(yǎng)基的滅菌。當(dāng)前第33頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)二、滅菌時(shí)間計(jì)算與影響因素

A、分批滅菌（實(shí)罐滅菌）

一般可以不計(jì)升溫階段所殺滅的菌數(shù)，把培養(yǎng)基中所有的菌均看作是在保溫階段（滅菌溫度）被殺滅，這樣可以簡(jiǎn)單地利用式5-4，粗略地求得滅菌所需的時(shí)間1、培養(yǎng)基滅菌時(shí)間的計(jì)算當(dāng)前第34頁(yè)\共有41頁(yè)\編于星期四\19點(diǎn)例：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，在121溫度下進(jìn)行實(shí)罐滅菌。原污染程度為每1mL有2*105個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢，121度時(shí)滅菌速度常數(shù)為