激光共聚焦顯微鏡原理和操作

激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy當(dāng)前第1頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)人眼分辨率： 0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm當(dāng)前第2頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)二、原理激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)當(dāng)前第3頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)原理小結(jié):

Confocal利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)當(dāng)前第4頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)當(dāng)前第5頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)當(dāng)前第6頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像當(dāng)前第7頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片conventionalconfocal當(dāng)前第8頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別3.增加側(cè)向分辨率

當(dāng)前第9頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別4.由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響

當(dāng)前第10頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)三.激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明2.具有照明pinhole和探測(cè)pinhole3.照明pinhole和探測(cè)pinhole共軛(共焦),共焦點(diǎn)即被探測(cè)點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)——逐點(diǎn)掃描成像5.具有多個(gè)（四個(gè)）熒光通道，可同時(shí)探測(cè)多個(gè)被標(biāo)記物當(dāng)前第11頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)技術(shù)指標(biāo)（LeicaTCSSP2):

1.xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61/NA（0.25m)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18m)2.樣品的最大厚度:取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動(dòng)范圍(166m、Z-wide)3.樣品的最小光切厚度:(載物臺(tái)最小移動(dòng)距離為40nm）取決于:物鏡的NA、針孔大小Z軸的最小移動(dòng)步距:40nm Z軸的分辨率:0.35m

當(dāng)前第12頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4.激光器

Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm

激光器的特點(diǎn):1)方向性好:激光基本延直線傳播2)單色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度 集中的。4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合當(dāng)前第13頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5.四個(gè)熒光通道,一個(gè)透射光通道

即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外 還可以同時(shí)采集透射光圖像,但透射光 圖像為非共焦圖像。當(dāng)前第14頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)

6.掃描速度:slow220lines/s5125122-3秒slow2440lines/s（2：雙向掃描）

medium450lines/s5125121.7秒medium2900lines/sfast1000lines/s

5125120.7秒1281280.2秒fast22000lines/s7.掃描密度:

646412812851251210241024

20482048當(dāng)前第15頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)

激光掃描共焦顯微鏡

技術(shù)的應(yīng)用TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy當(dāng)前第16頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用功能.1.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無(wú)損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”3.真正的三維重組4.假三維圖的顯示5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進(jìn)行光切6.定量分析7.時(shí)間序列掃描:xyt、xyzt和xt掃描8.圖像處理9.旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描

當(dāng)前第17頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用應(yīng)用定位、定量三維重組動(dòng)態(tài)測(cè)量

活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化測(cè)量 (Mg2+、Zn+、Na+、K+)

自由基的檢測(cè)藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位當(dāng)前第18頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用活細(xì)胞內(nèi)H+濃度（pH值）的測(cè)量線粒體膜電位的測(cè)量熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測(cè)量籠鎖解籠鎖的測(cè)量熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測(cè)量其他應(yīng)用當(dāng)前第19頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用一、定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的 增值、分化細(xì)胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位雜交-fitc+PI熒光原位雜交：染色體基因定位

當(dāng)前第20頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用定位、定量研究中常用熒光探針1.Amine-ReactiveProbes

與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等Green

Red Fura-redFITC494/518TRITC544/572Cy5650/690(異硫氰基熒光素)(四甲基異硫氰基羅丹明)AlexaFluor488488/530PE565/578(藻紅蛋白)TexasRed595/615(德州紅)Cy3558/568BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR 592/618

當(dāng)前第21頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用1)細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白免役熒光標(biāo)記：與抗體耦聯(lián),直標(biāo):一抗+熒光探針

間標(biāo):二抗+熒光探針如:微管蛋白tublin(抗tublin抗體+熒光探針)肌動(dòng)蛋白actin(Palloidine+熒光探針)2)細(xì)胞膜表面受體 配體+熒光探針如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)標(biāo)記Gm1:霍亂毒素受體霍亂毒素+FITC

當(dāng)前第22頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針1)線粒體Mitochondria

Rodamin123505/534，可染活細(xì)胞，陽(yáng)離子,可檢測(cè)線粒體膜電位,且在多數(shù)細(xì)胞中停留時(shí)間短JC1線粒體膜電位低時(shí)為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位高時(shí)為多聚體490/590發(fā)紅光可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測(cè)線粒體膜電位最 佳探針MitotrackerGreenFM490/516,染活細(xì)胞或固定細(xì)胞, 穩(wěn)定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange還原型,只能染活細(xì)胞當(dāng)前第23頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2)溶酶體

Lysosome

中性紅541/640:微偏堿性,可標(biāo)記溶酶體等酸性器官

為非特異性AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活細(xì)胞LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

EndoplasmicReticulum

DiOC6484/500:非特異性,較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),較低濃度標(biāo)記線粒體4)高爾基體GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死細(xì)胞

當(dāng)前第24頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用細(xì)胞器的單克隆抗體5)細(xì)胞核PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死細(xì)胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/617DNA/RNA死細(xì)胞Hochest33342

352/461DNAA-T活細(xì)胞Hochest33258

352/461DNAA-T活細(xì)胞DAPI358/461DNAA-T半通透細(xì)胞ChromomycinA3450/470DNAG-CAO500/526DNA活細(xì)胞560/650RNATOTO-1514/533DNA 死細(xì)胞SYTO11~1620~24488/520活細(xì)胞SYTO11~1620~24521/556活細(xì)胞SYTO17 621/634 活細(xì)胞當(dāng)前第25頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)3.GFP綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。

將外源基因與GFPDNA相連,GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)外源基因的表達(dá).激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第26頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用GFP主要應(yīng)用:

對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá),如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可動(dòng)態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程可用于觀察分子的運(yùn)動(dòng)（FRAP）蛋白之間的相互作用（FRET）當(dāng)前第27頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用三.動(dòng)態(tài)測(cè)量Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量1).游離Ca2+測(cè)量

檢測(cè)游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測(cè)Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,Kd和很多因素有關(guān)，如pH、Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100nM)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）

當(dāng)前第28頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)熒光探針 激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng)KdFLuo3-AM,K+,dextran506nm 525nm390nM Fluo4 506nm 525nm CalciumGreen-1507nm 530nm190nMCalciumGreen-2 507nm 535nm550nMFurared 420/480nm 637nm140nMOregonGreen488 494nm 520nm 20,000nMCalciumCrimson 583nm602nm328nMIndo-1 356nm405/458nm230nMFura-2 340/380476nm145nM激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第29頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)程序化測(cè)量：用timelapse中的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測(cè) 量。

F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+濃度絕對(duì)測(cè)量1）單波長(zhǎng)公式法Fluo3:530nmKd=450nM[Ca2+]I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin:細(xì)胞內(nèi)無(wú)鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度(MnCl2)Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度(A23187)測(cè)量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值不能太低（F值不低于40）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第30頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8-10-7M）細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA-Ca2+)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度3）比例熒光的測(cè)量.雙波長(zhǎng)(比例熒光：ratio)Indo1(360,420/480),fura2(340/380,440)[Ca2+]I=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第31頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用快速Ca2+變化的測(cè)量1.改變掃描速度2.采用雙向掃描3.減少采樣點(diǎn)數(shù)(犧牲空間分辨率）4.采用線掃描(xt)當(dāng)前第32頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)細(xì)胞器的Ca2+測(cè)量1.線粒體內(nèi)游離Ca2+測(cè)量Fluo-3+TMRM(線粒體熒光探針，紅色）2.特異定位的重組水母發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白與Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測(cè)定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2+變化 目前已商品化的探針可檢測(cè)：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測(cè)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第33頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)

細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測(cè)量的應(yīng)用鈣的特性1．細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103-104倍2．細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫(kù)釋放稍有增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣明顯升高3．細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開關(guān)”細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)2．神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3．學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)4．卵子受精5．細(xì)胞分裂和再生6．細(xì)胞調(diào)亡7．細(xì)胞間通訊激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第34頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)8．細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)9.DNA合成10.基因表達(dá)細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病1．高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病—胞內(nèi)鈣濃度異常2．糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病—胞內(nèi)鈣濃度增高3．人體缺鈣—骨鈣大量丟失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高4．老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8-10-7M）細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第35頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)電刺激引起骨骼肌細(xì)胞的Ca2+振蕩激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第36頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用pH值的檢測(cè)：

Snarf-1-AM488nm580/640nm

當(dāng)前第37頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)自由基的檢測(cè)熒光探針：H2DCF-DA（504nm/529nm） 2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽胞外H2DCF-DA擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)酯酶脫乙酰DCF-H(不熒發(fā)光）DCF（發(fā)熒光）*樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察

Dihydrorhodamine123（507nm/529nm）H2rhod123被動(dòng)擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)被氧化成rod123（發(fā)光）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用當(dāng)前第38頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程及定位分布

xyzt掃描

當(dāng)前第39頁(yè)\共有46頁(yè)\編于星期五\10點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用四.膜電位的測(cè)量標(biāo)記膜電位探針(慢