第一章細胞培養(yǎng)技術的基本理論知識演示文稿

第一章細胞培養(yǎng)技術的基本理論知識演示文稿當前第1頁\共有62頁\編于星期五\21點（優(yōu)選）第一章細胞培養(yǎng)技術的基本理論知識當前第2頁\共有62頁\編于星期五\21點三種培養(yǎng)方式的來源廣泛，既可以是胚胎和成體的組織和器官，亦可是活檢或手術取下組織或器官。組織或器官去除筋膜，脂肪組織后進行粗切器官培養(yǎng)組織培養(yǎng)（1mm3）細胞培養(yǎng)（單細胞）細切酶消化當前第3頁\共有62頁\編于星期五\21點二、細胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點優(yōu)點：

1.能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結構、生命活動等。2.選擇對象均一，重復；物理、化學、生物等因素可控；可采用各種研究技術、記錄方法。3.可提供大量、同時、重復性好的、生物學性狀相似的實驗對象。4.可作為制備生物制品、單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程制品等的生產(chǎn)手段。當前第4頁\共有62頁\編于星期五\21點缺點：人工所模擬的條件與體內(nèi)實際相比仍有很大差異，當細胞被置于體外培養(yǎng)后,生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中久了，必然發(fā)生變化。體外培養(yǎng)相對孤立、相對單一，缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響，導致原有組織結構和細胞形態(tài)變化，分化減弱或不顯，細胞趨向單一化。注意：體外培養(yǎng)細胞是一種特定條件下生長的細胞群體，體外實驗結果不能與體內(nèi)實驗結果完全等同??！當前第5頁\共有62頁\編于星期五\21點

第二節(jié)培養(yǎng)細胞生物學一、體內(nèi)外細胞分化的差異1.細胞增殖和分化：增殖使細胞數(shù)量增多；分化使機體結構和功能多樣化，最后演變成完整的有機體.接觸抑制和密度抑制2.體內(nèi)外細胞的差異：細胞在體外培養(yǎng)后，一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細胞間相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化則是必然。細胞最多見的表現(xiàn)是：返祖（Atavism）現(xiàn)象，即失去原有組織結構和細胞形態(tài)；分化減弱或不顯、細胞趨單一化、不死性、惡性狀。。

當前第6頁\共有62頁\編于星期五\21點當前第7頁\共有62頁\編于星期五\21點二、培養(yǎng)細胞的分化不適應（Deadaption）細胞在體內(nèi)時所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉移酶的特性。脫分化（去分化）（Dedifferentiation）由于基因變異而使細胞失去分化能力。如肝細胞失掉產(chǎn)生精氨酸酶及氨基酸轉移酶的特性后，儲存肝糖元的能力喪失，并很難再現(xiàn)。當前第8頁\共有62頁\編于星期五\21點三、體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)1.貼壁型

2.懸浮型上皮型細胞成纖維細胞型游走細胞型多形型細胞絕大多數(shù)有機體細胞屬粘附型細胞。

當前第9頁\共有62頁\編于星期五\21點(1)上皮型細胞(2)成纖維型細胞(3)游走型細胞(4)多形型細胞

1234當前第10頁\共有62頁\編于星期五\21點貼壁型細胞：必須貼附于底物才能生長的細胞稱為貼壁型細胞貼壁是大多數(shù)有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式，細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼壁型細胞。目前已有很多種細胞能在體外培養(yǎng)生長，包括正常細胞和腫瘤細胞。例如：成纖維細胞、骨骼組織(骨及軟骨)、心肌與平滑肌、肝、肺、腎、乳腺、皮胺、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、內(nèi)分泌細胞、黑色素細胞及各種腫瘤細胞等。當前第11頁\共有62頁\編于星期五\21點

上皮樣細胞型名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實際上不完全等于來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細胞（個別例外）如：皮膚及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡，上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細胞扁平，不規(guī)則，多角形中有圓形核當前第12頁\共有62頁\編于星期五\21點生長特點易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—鋪路石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動

當前第13頁\共有62頁\編于星期五\21點

成纖維細胞型名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞，心肌，平滑肌，成骨細胞形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細胞的形態(tài)

胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起，中有卵圓形核當前第14頁\共有62頁\編于星期五\21點

生長特點排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起

當前第15頁\共有62頁\編于星期五\21點體外培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細胞當前第16頁\共有62頁\編于星期五\21點

體外培養(yǎng)的平滑肌細胞（免疫組織化學染色顯示肌動蛋白）當前第17頁\共有62頁\編于星期五\21點游走型細胞本型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片。細胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規(guī)則。當前第18頁\共有62頁\編于星期五\21點多形型細胞多形型細胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細胞。其細胞一般分胞體和胞突兩部分。胞突為細長形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形，但沒有成纖維細胞型那樣規(guī)則。體外培養(yǎng)中呈現(xiàn)多形型的細胞最常見的類型是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞

。當前第19頁\共有62頁\編于星期五\21點注意：細胞形態(tài)并非固定不變，可隨培養(yǎng)條件、生長時期、細胞數(shù)量等而變化，細胞形態(tài)只是對培養(yǎng)物判斷或識別的參考指標。

血清

Hela高血清低血清

成纖維細胞樣上皮樣細胞

pHHela太酸或太堿標準pH

成纖維細胞樣上皮樣細胞

細胞密度

3T3低密度高密度

成纖維細胞樣上皮樣細胞當前第20頁\共有62頁\編于星期五\21點懸浮型細胞：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源：來自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞腫瘤細胞也可能特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲缺點：觀察不方便，純化不方便，不能通過離心將死、活細胞分離當前第21頁\共有62頁\編于星期五\21點四、細胞的生長和增殖過程培養(yǎng)細胞一代生存期僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。細胞傳一代有可能倍增3-6代。傳代是將細胞從一個培養(yǎng)瓶皿轉移到另一培養(yǎng)瓶皿內(nèi)生長的過程。當前第22頁\共有62頁\編于星期五\21點1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）階段或稱初代培養(yǎng)。從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代，隨不同的組織時間長短不一，一般為1-4w。細胞結構和形態(tài)與體內(nèi)最接近、細胞群異質(zhì)，細胞分裂但不旺盛，克隆形成率差。當前第23頁\共有62頁\編于星期五\21點2.傳代培養(yǎng)（Subculture）階段或稱繼代培養(yǎng)。也就是細胞系（Cellline）階段，細胞增殖旺盛，一般細胞可傳代10-50代。應在初代培養(yǎng)后期或傳代早期對細胞進行凍存。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)基的性質(zhì)。接種數(shù)量的多少和細胞的增值速度相關。當前第24頁\共有62頁\編于星期五\21點游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）每代貼壁細胞的生長過程當前第25頁\共有62頁\編于星期五\21點游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。時間：10分鐘一4小時貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結束。底物：玻璃、塑料、膠原、其它細胞等當前第26頁\共有62頁\編于星期五\21點潛伏期：細胞有生長活動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。停滯期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度限制當前第27頁\共有62頁\編于星期五\21點原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)選取生長良好的細胞加入胰蛋白酶消化液鏡下觀察倒去酶液，加入培養(yǎng)液反復吹打制成細胞懸液按比例分裝后培養(yǎng)當前第28頁\共有62頁\編于星期五\21點3.衰退期此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，細胞形態(tài)輪廓增強，最后衰退凋亡。當前第29頁\共有62頁\編于星期五\21點第三節(jié)培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境與條件１．細胞的營養(yǎng)需要：１）基本營養(yǎng)物質(zhì)：

氨基酸（１２種＋谷氨酰胺）維生素葡萄糖、核糖、脫氧核糖等無機離子等２）促細胞生長因子：多由血清提供

當前第30頁\共有62頁\編于星期五\21點２．細胞的生存環(huán)境１）溫度條件對細胞生長的影響不同生物來源的組織細胞培養(yǎng)溫度不同；體外培養(yǎng)動物細胞最常用的溫度是37℃。耐低溫不耐高溫！培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強；當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡;相反，溫度不低于0℃時，對細胞代謝雖有影響，但并無傷害作用。在生理溫度范圍內(nèi)，溫度與細胞生長率之間存在正相關關系。當前第31頁\共有62頁\編于星期五\21點２）氣相環(huán)境對細胞生長的影響動物細胞培養(yǎng)的氣相環(huán)境都是采用5%CO2與95%空氣（提供氧）的混合氣體。

Ｏ2參與細胞的能量代謝過程。ＣＯ2用于維持培養(yǎng)液的酸堿度。

一般多為開放式培養(yǎng)當前第32頁\共有62頁\編于星期五\21點3）滲透壓正常滲透壓維持細胞張力并調(diào)節(jié)細胞代謝，一般細胞滲透壓為260～320mmol/L。4）培養(yǎng)液的酸堿度對細胞生長的影響大多數(shù)的有機體細胞能在pH6.0～8.0的環(huán)境中生存。最適宜的pH值范圍是7.2～7.4。體外培養(yǎng)的正常細胞耐酸能力要強于耐堿能力5）無污染、無毒（前提條件?。?/p>

當前第33頁\共有62頁\編于星期五\21點3．細胞常用的培養(yǎng)液和試劑

培養(yǎng)用液是維護組織細胞生存、生長及進行細胞培養(yǎng)各項操作過程中所需的基本溶液。

平衡鹽溶液主要包括培養(yǎng)基

其他培養(yǎng)用液

天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基當前第34頁\共有62頁\編于星期五\21點1）平衡鹽溶液(BalancedSaltSo1ution：BSS)BSS又稱生理鹽水或鹽溶液，主要由無機鹽和葡萄糖組成。本身具有維持滲透壓，調(diào)控酸、堿度平衡的作用，同時能供給細胞生存所需的能量和無機離子成分；用作洗滌組織、細胞以及配制各種培養(yǎng)用液的基礎溶液。BSS內(nèi)含少量的酚紅，作為溶液酸堿度變化的指示劑；溶液變酸時呈黃色，變堿時呈紫紅色，中性時呈桃紅色，借此易于觀察到培養(yǎng)液pH的變化。當前第35頁\共有62頁\編于星期五\21點幾種常用的平衡鹽溶液：Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hank’s、D-Hank’s、Dulbecco（都有相應配方）最簡單的BSS是Ringer。D-Hank’s與Hank’s的一個主要區(qū)別在于前者不含有Ca2+、Mg2+

，因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。配制平衡鹽溶液也應當用新鮮的三蒸水。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫高壓滅菌。有渾濁或沉淀時，應重新配制當前第36頁\共有62頁\編于星期五\21點PBS（Phosphate-BufferedSallines）KCl0.20gKH2PO40.20gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16gDPBS（Dulbecco’sPhosphate-BufferedSallines）標準型CaCl2(anhyd.)(無水氯化鈣)0.10gKCl0.20gKH2PO40.20gMgCl2·6H2O0.10gNaCl8.00gNa2HPO4·7H2O2.16g當前第37頁\共有62頁\編于星期五\21點D-Hanks’

平衡鹽溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

當前第38頁\共有62頁\編于星期五\21點2）培養(yǎng)基培養(yǎng)基就是人工模擬細胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，維持細胞生長的營養(yǎng)物質(zhì),它是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質(zhì)基礎。細胞培養(yǎng)基的基本要求:體外培養(yǎng)的細胞直接生活在培養(yǎng)基中，因此培養(yǎng)基應能滿足細胞對營養(yǎng)成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基。當前第39頁\共有62頁\編于星期五\21點合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養(yǎng)基，如MEM、RPMI-1640、DMEM等。主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。目前常用的MEMEagle培養(yǎng)液，僅含有12種必需氨基酸、谷氨酰胺和八種維生素，成分簡單，可廣泛適應各種已建成細胞系的培養(yǎng)。在它們的基礎上，后又改良成BME(BasalMediumEagle：BME)和DMEM(DulbeccoMEM)二種培養(yǎng)液，應用也十分廣泛。

當前第40頁\共有62頁\編于星期五\21點

人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。合成培養(yǎng)基優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定，成本低。

缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。當前第41頁\共有62頁\編于星期五\21點市場上可提供干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基需使用者自己配制并滅菌，其優(yōu)點是價格便宜。缺點是配制過程比較繁瑣，質(zhì)量不易控制液體培養(yǎng)基是由專業(yè)廠家按標準規(guī)?；a(chǎn)，不僅質(zhì)量得到保證，而且使用十分方便，但比較昂貴。當前第42頁\共有62頁\編于星期五\21點如何選擇培養(yǎng)基？(1)建立某種細胞株所用的培養(yǎng)基應該是培養(yǎng)這種細胞首選的培養(yǎng)基。(2)本實驗室慣用的培養(yǎng)基(3)根據(jù)細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養(yǎng)基(4)用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細胞，觀察其生長狀態(tài)，可用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據(jù)試驗結果選擇最佳培養(yǎng)基當前第43頁\共有62頁\編于星期五\21點當前第44頁\共有62頁\編于星期五\21點培養(yǎng)基的配制（針對干粉培養(yǎng)基）1.認真閱讀說明書。2.配制時要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要在培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。3.配制所用的水應為三蒸水，離子濃度很低，水電阻達30萬Ω以上。4.所用器皿應十分潔凈。5.配制好的培養(yǎng)基應馬上過濾，無菌保存于4℃。當前第45頁\共有62頁\編于星期五\21點

DMEM培養(yǎng)液的配制（舉例）：(溶解)900mLddH2O于1000mL燒杯中，將DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50mLddH2O分次沖洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）攪拌溶解。（調(diào)PH）用5％－10％的NaHCO3調(diào)pH至7.2（加抗生素）加青、鏈霉素至終濃度100u/mL和100ug/mL（過濾除菌）用0.22um的濾膜過濾除菌。（分裝保存）分裝（200mL左右）后4℃冰箱保存。當前第46頁\共有62頁\編于星期五\21點天然培養(yǎng)基有血清（牛、馬血清）、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）、鼠尾膠原。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：來源受限。成分復雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結果的分析。易發(fā)生支原體污染細胞在單純的基礎培養(yǎng)基中不能長期存活,基礎培養(yǎng)基中常常要添加血清，添加血清后的培養(yǎng)基被稱為“完全培養(yǎng)基”。當前第47頁\共有62頁\編于星期五\21點

血清的優(yōu)點與缺點血清中含有多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）；多種金屬離子、激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等；各種生長因子；轉移蛋白；不明成分的物質(zhì)，促進細胞貼壁生長。血清中含有一些有毒性的物質(zhì)，例如：多胺氧化酶，補體，抗體，細菌毒素等都會影響細胞的生長，甚至造成細胞死亡；每批血清之間成分不能保持一致；取材過程可能帶入支原體、病毒，導致實驗失敗或結果的不可靠。當前第48頁\共有62頁\編于星期五\21點血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關鍵。常用牛血清胎牛血清（fetalbovineserum,FBS或fetalcalfserum,FCS）

新生牛血清（newborncalfserum,NBCF）：小于24h小牛血清（calfserum,CS）:10～30D其中以胎牛血清質(zhì)量最好優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。當前第49頁\共有62頁\編于星期五\21點血清的使用與儲存

使用前的處理：血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。

熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。對于一些品質(zhì)高的胎牛血清和新生牛血清可以考慮不經(jīng)滅活直接用于細胞培養(yǎng)。當前第50頁\共有62頁\編于星期五\21點血清的儲存條件：血清一般儲存于－20℃,同時應避免反復凍融。大包裝的血清，首先將血清滅活處理，然后分裝為小包裝，如10ml、20ml、50ml，儲存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜長時間存放，應盡快使用。當前第51頁\共有62頁\編于星期五\21點血清中的沉淀物絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清當前第52頁\共有62頁\編于星期五\21點一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死，但支持細胞生長一般需加10％血清。對于血清支持細胞生長的生物學效應已得到證明，但對血清中的復雜成分至今尚未完全清楚。完全培養(yǎng)基成分基礎培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉3.7g/L青、鏈霉素各100單位／毫升當前第53頁\共有62頁\編于星期五\21點其他培養(yǎng)用液

3）、消化液

（1）胰酶(trypsin)溶液：濃度一般為0.1％～0.25％配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液

當前第54頁\共有62頁\編于星期五\21點（2）EDTA溶液：一種化學螯合劑，對細胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便，使用濃度為0.02%；可與胰酶的混合使用。EDTA溶液配制：用D-Hanks’平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存注意：使用EDTA處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細胞生長當前第55頁\共有62頁\編于星期五\21點（3）膠原酶(collagenase)溶液：使用濃度為0.1～