第七章工業(yè)微生物原生質(zhì)體育種和原生質(zhì)體融合

第一節(jié)原生質(zhì)體育種一、原生質(zhì)體再生育種出發(fā)菌株的選擇→菌種活化和與培養(yǎng)→原生質(zhì)體制備→原生質(zhì)體再生→高產(chǎn)菌株分離→復(fù)篩→遺傳性狀鑒定→菌種特性和發(fā)酵特性研究當(dāng)前第1頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)二、原生質(zhì)體誘變育種菌種活化和與培養(yǎng)→原生質(zhì)體制備→原生質(zhì)體懸浮液稀釋至一定濃度，取一定放入無菌平皿中→紫外燈下誘變處理→置暗處后處理→再生培養(yǎng)→高產(chǎn)菌株分離→復(fù)篩→遺傳性狀鑒定→菌種特性和發(fā)酵特性研究當(dāng)前第2頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)三、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種菌種活化和與培養(yǎng)→原生質(zhì)體制備→離心洗滌，取原生質(zhì)體懸浮液1ml，2倍SMM濃縮液和質(zhì)粒DNA各0.1ml，然后加入40%聚乙二醇4000ml，混勻后靜置2min,離心，懸浮于1mlHCP培養(yǎng)幾種，適當(dāng)稀釋后分離在選擇培養(yǎng)基上，雙層平板培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化子。當(dāng)前第3頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)第二節(jié)微生物原生質(zhì)體融合育種一、定義與意義

細(xì)胞融合（Cellfusion）也叫細(xì)胞雜交是指使用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。由于它不僅能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細(xì)胞、培育新品種方面意義重大，也被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的相關(guān)領(lǐng)域。當(dāng)前第4頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)基因型相同的細(xì)胞融合成的融合細(xì)胞稱為同核體，來自不同基因型的融合細(xì)胞則稱為異核體。從融合效果上，細(xì)胞融合包括：對(duì)稱融合：即兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合。不對(duì)稱融合：利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再與另外一個(gè)完整的細(xì)胞進(jìn)行融合。當(dāng)前第5頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)二、發(fā)展歷史細(xì)胞融合現(xiàn)象最初是在動(dòng)物細(xì)胞中表現(xiàn)的。1858年發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞情況。1875年觀察到脊椎動(dòng)物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生的合并現(xiàn)象。當(dāng)前第6頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。20世紀(jì)七十年代初，華裔加籍科學(xué)家高國楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物細(xì)胞融合的研究。細(xì)胞融合技術(shù)逐步擴(kuò)展到植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞伴隨者細(xì)胞融合技術(shù)的成熟。20世紀(jì)80年代，真正意義上的細(xì)胞工程誕生了，細(xì)胞融合現(xiàn)已成為細(xì)胞工程的核心技術(shù)之一。

當(dāng)前第7頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)三、原生質(zhì)體融合育種的特點(diǎn)1)雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。2)受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。3)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程。當(dāng)前第8頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)4)存在著兩株以上親株同時(shí)參與融合形成融合子的可能性。5)有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。6)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。7)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。當(dāng)前第9頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)四、細(xì)胞融合過程顯微鏡下的原生質(zhì)體融合當(dāng)前第10頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)融合過程中細(xì)胞膜變化類脂質(zhì)分子發(fā)生擾動(dòng)和重排導(dǎo)致細(xì)胞橋的形成細(xì)胞質(zhì)、核相互融合當(dāng)前第11頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)五、原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體制備原生質(zhì)體純化原生質(zhì)體融合融合子檢出融合子鑒定當(dāng)前第12頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)（一）微生物原生質(zhì)體制備1、定義及特點(diǎn)定義：去除細(xì)胞壁后裸露的細(xì)胞稱之為原生質(zhì)體。特點(diǎn)：無細(xì)胞壁，可以方便地進(jìn)行遺傳操作、人工誘變、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、細(xì)胞融合等操作。具有全能性，能再生細(xì)胞壁。當(dāng)前第13頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)2、微生物細(xì)胞壁組成微生物種類不同其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成不同，酶解處理的有效酶也不一樣，因此要求根據(jù)微生物種類特性選擇合適的酶。G+:糖肽、低聚糖、多糖、蛋白質(zhì)、磷壁酸、糖醛酸磷壁酸G-：糖肽、磷壁酸、蛋白質(zhì)、類脂、脂多糖、脂蛋白、二氨基庚二酸、甘氨酸、阿拉伯糖、半乳糖當(dāng)前第14頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)真核細(xì)胞壁組成種類纖維素幾丁質(zhì)其他多糖疫霉屬25065毛霉屬0944酵母屬0160鐮刀霉屬03929裂褶菌數(shù)0581鬼傘屬03350當(dāng)前第15頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)3、制備原生質(zhì)體的酶類自然界中多種生物都能合成破壞降解菌體細(xì)胞壁的酶，如蛋清中的溶菌酶，蝸牛消化酶，寄生性微生物合成酶。包括：纖維素酶酵母裂解酶幾丁質(zhì)酶商品酶：Novozyme234來自TrichodermaharzianumLywallzyme廣東微生物研究所溶壁酶Gglucuronidase葡聚糖甘酸酶當(dāng)前第16頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)

4、影響原生質(zhì)體制備的因素1)菌體的前處理為了將菌作一些前處理使酶作用的效果好一些，如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素。2)菌體的培養(yǎng)時(shí)間選擇增殖期的菌體，使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化。當(dāng)前第17頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)3)酶濃度對(duì)于不同種屬的微生物，不僅對(duì)酶的種類要求不同，對(duì)酶的濃度也有差異。最佳酶濃度還隨不同的生長期的菌體而變化。酶濃度合適，濃度太高對(duì)原生質(zhì)體有破壞作用，影響原生質(zhì)體的再生4)酶處理溫度:根據(jù)具體情況,細(xì)菌高,酵母及霉菌稍低。過高的溫度使酶失活，原生質(zhì)體失活；過低的溫度酶活性不高，影響原生質(zhì)體細(xì)胞膜穩(wěn)定性當(dāng)前第18頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)5)破壁時(shí)的pH值:對(duì)離子強(qiáng)度影響較大6)滲透壓穩(wěn)定劑等滲透壓在原生質(zhì)體制備中起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨裂，有助于酶和底物的結(jié)合，滲透壓穩(wěn)定劑多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有機(jī)物和KCl和NaCl等無機(jī)物。當(dāng)前第19頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)5、原生質(zhì)體制備程序菌體培養(yǎng)：液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)收集菌體：過濾收集、離心收集無菌水沖洗洗滌菌體：等滲液沖洗等滲液與酶液相同酶解處理：保溫酶解稀釋終止酶解，離心去酶過濾分離：過濾去掉為分界菌絲體查速離心：收集大小密度均一的原生質(zhì)體，低速離心其沉淀物，高速離心棄上清液，的純化原生質(zhì)體。當(dāng)前第20頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)原生質(zhì)體的保存較低的溫度可以有效保持原生質(zhì)體的活性；細(xì)菌：48小時(shí)放線菌：24小時(shí)真菌0-4℃保存2天當(dāng)前第21頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)影響原生質(zhì)體存活的遺傳因素細(xì)菌易再生可達(dá)90%以上，有些種類也很低；小單孢菌只有10%；放線菌可達(dá)50%；絲狀真菌“產(chǎn)黃青霉”40-60%。當(dāng)前第22頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)（二）原生質(zhì)體融合1、融合親本選育選擇遺傳性狀穩(wěn)定且具有優(yōu)勢互補(bǔ)的兩個(gè)親株原生質(zhì)體融合是一隨機(jī)過程，原生質(zhì)體間無親和選擇性，當(dāng)兩種原生質(zhì)體A和B混合到一起時(shí)，發(fā)生融合的可能性有A-A/A-B/BB其中只有A-B的融合是有效的融合，概率為33.33%，當(dāng)然還有多個(gè)原生質(zhì)體融合到一起的可能。為了能明確檢測到融合子，參與融合的親株一般都需要帶有可以識(shí)別的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型或抗藥性等當(dāng)前第23頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)2、原生質(zhì)體融合的方法物理法、化學(xué)法及生物法。原理增加細(xì)胞間的粘附、改變膜的通透性——隨機(jī)結(jié)合、融合當(dāng)前第24頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)(1)物理法——電融合誘導(dǎo)法在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，極化產(chǎn)生偶極子，彼此靠近，定向排列成串球狀。在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，原生質(zhì)體膜兩側(cè)產(chǎn)生電勢，正負(fù)電荷相吸，細(xì)胞膜變薄，觸發(fā)膜的穿孔（質(zhì)膜瞬間破裂）。膜之間形成通道，細(xì)胞質(zhì)等得以交換、融合。當(dāng)前第25頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)具體步驟當(dāng)前第26頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第27頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)DAPI：4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚是一種常用的熒光染料，它們與DNA雙螺旋的凹槽部分發(fā)生相互作用，從而與DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激發(fā)波長正好是356nm，使得DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號(hào)。染色標(biāo)記細(xì)胞核的位置。當(dāng)前第28頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第29頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第30頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第31頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第32頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)特點(diǎn)融合率高、重復(fù)性與可控制性強(qiáng)。裝置精巧、方便簡單?？稍陲@微鏡下觀察或錄像融合過程?？赡軙?huì)造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。當(dāng)前第33頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)(2)生物法各種病毒都具有凝集細(xì)胞的能力，它一邊粘接在一個(gè)細(xì)胞表面，另外一邊粘接在另一個(gè)細(xì)胞表面，從而使兩個(gè)細(xì)胞在病毒的作用下靠近發(fā)生凝結(jié)。仙臺(tái)病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。仙臺(tái)病毒有若干附著點(diǎn)，可以同時(shí)吸附在兩個(gè)細(xì)胞表面。由于病毒體積很小，由一個(gè)病毒吸附的兩個(gè)細(xì)胞靠得極近，使細(xì)胞膜融合在一起，成為一個(gè)雜種細(xì)胞。當(dāng)前第34頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)

原理與過程滅活后的病毒顆粒結(jié)合到原生質(zhì)體表面。兩受體細(xì)胞開始凝聚。兩細(xì)胞的膜緊密結(jié)合。病毒被膜與受體細(xì)胞的漿膜融合。病毒顆粒周圍的膜脫離整個(gè)膜，產(chǎn)生破口，在兩細(xì)胞間形成細(xì)胞質(zhì)通道（37℃下1-2min），通道繼續(xù)擴(kuò)大，病毒顆粒流入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)互相融合。融合細(xì)胞變圓，融合結(jié)束。當(dāng)前第35頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)特點(diǎn)研究最早的促融劑。毒性大而使應(yīng)用受到限制。當(dāng)前第36頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)(3)化學(xué)法包括PEG誘導(dǎo)、高Ca2+和pH誘導(dǎo)PEG結(jié)合誘導(dǎo)等。聚乙二醇(PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。PEG誘導(dǎo)：PEG與溶液中自由水結(jié)合，高度脫水后引起原生質(zhì)體凝聚、扭曲變形、細(xì)胞膜連接處發(fā)生融合，形成很小的細(xì)胞橋，之后擴(kuò)大，最終徹底融合。當(dāng)前第37頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)高Ca2+和pH誘導(dǎo)PEG結(jié)合誘導(dǎo)高Ca2+機(jī)制：帶負(fù)電荷間的原生質(zhì)體在鈣離子的連接下形成靜電鍵——鈣橋，促使異源的原生質(zhì)體間粘著和結(jié)合。高pH：增加Ca2+在細(xì)胞表面的黏附，從而促進(jìn)兩原生質(zhì)體的接觸。進(jìn)一步提高了PEG法的效率。當(dāng)前第38頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)當(dāng)前第39頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)(4)方法選擇具體應(yīng)用時(shí)要根據(jù)不同對(duì)象選擇不同的細(xì)胞融合方法和條件。誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合，仙臺(tái)病毒HVJ誘導(dǎo)、PEG法、電融合法都適用；植物細(xì)胞融合常用PEG法和電融合法；微生物細(xì)胞融合多采用PEG法。當(dāng)前第40頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)（三）融合體的再生1、再生培養(yǎng)基：應(yīng)具備維系、保護(hù)、支持和營養(yǎng)的功能1）用硫酸鎂、甘露醇、山梨糖、蔗糖為滲透劑，不同的微生物種類應(yīng)選擇不同的再生培養(yǎng)基；2）營養(yǎng)因子：酵母膏、酪蛋白、氨基酸、糖類；3）原生質(zhì)體保護(hù)劑擴(kuò)張劑的作用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、明膠等對(duì)原生質(zhì)體具有保護(hù)作用，同時(shí)起到原生質(zhì)體擴(kuò)張劑作用，次級(jí)原生質(zhì)體再生作用；當(dāng)前第41頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)4）加入再生細(xì)胞壁誘導(dǎo)物及前體物質(zhì)在培養(yǎng)基中加入明膠、細(xì)胞壁殘片甚至席位蘇濾膜都有刺激原生質(zhì)體再生的功能。2、再生培養(yǎng)溫度過高溫度對(duì)原生質(zhì)體再生有一只作用，當(dāng)再生溫度略低于菌株培養(yǎng)溫度時(shí)，有利于原生質(zhì)體的再生3、操作方式涂布培養(yǎng)法對(duì)原生質(zhì)體有損壞當(dāng)前第42頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)4、固體培養(yǎng)一般認(rèn)為固體培養(yǎng)優(yōu)于液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞壁可溶性物質(zhì)很容易擴(kuò)散（如酵母在液體再生液中很難再生）；固體培養(yǎng)基限制有效分子的擴(kuò)散，但先在液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2-3小時(shí)有利于提高再生率。當(dāng)前第43頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)（四）融合細(xì)胞篩選當(dāng)前第44頁\共有51頁\編于星期五\21點(diǎn)1、篩選的原因與必要性細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。問題：A與B融合過程中，你能預(yù)見有哪些形式的