第四章酶蛋白的化學修飾

第四章酶蛋白的化學修飾第一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第三章酶蛋白的化學修飾第一節(jié)化學修飾的原理第二節(jié)化學修飾的方法學第三節(jié)酶蛋白側(cè)鏈基團的修飾第四節(jié)酶的親和修飾第五節(jié)酶的化學交聯(lián)第六節(jié)酶化學修飾的應(yīng)用第二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)化學修飾的原理

一、酶的化學修飾原因1．穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2．作用的最適條件不符。3．酶的主要動力學性質(zhì)的不適應(yīng)。4．臨床應(yīng)用的特殊要求。二、定義

酶分子的化學修飾就是在分子水平上對酶進行改造，以達到改構(gòu)和改性的目的。即在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學基團(物質(zhì))，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進行共價連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這種物質(zhì)被稱為修飾試劑。化學修飾酶主要用于基礎(chǔ)酶學的研究和疾病治療。第三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一三、酶化學修飾的基本原理1．如何增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2．如何保護酶活性部位與抗抑制劑3．如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境影響酶化學修飾反應(yīng)進程的因素主要有兩個：酶蛋白功能基的反應(yīng)性修飾劑的反應(yīng)性第四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一影響酶化學修飾反應(yīng)進程的因素：酶蛋白功能基的反應(yīng)性微區(qū)的極性：是決定基團解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。氫鍵效應(yīng)：蛋白質(zhì)或其離子通過氫鍵來維持穩(wěn)定性。靜電效應(yīng)：帶電基團之間的相互影響造成的。位阻效應(yīng)：當烷基在空間上緊靠著蛋白的功能基，會使修飾劑不能與功能基接觸，這時會出現(xiàn)位阻效應(yīng)。酶蛋白功能基的超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基團與個別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)。但不一定是酶的活性部位基團。第五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一影響酶化學修飾反應(yīng)進程的因素：修飾劑的反應(yīng)性選擇吸附：修飾劑根據(jù)各自特點，選擇性地吸附在低極性區(qū)域或高極性區(qū)，形成蛋白質(zhì)－修飾劑復合物。靜電相互作用：帶電修飾劑可以選擇性地吸引在蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位。(碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度)位阻因素：位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)。(α－溴代酸的大小影響修飾）催化因素：不同的修飾劑，其反應(yīng)速度和反應(yīng)部位有明顯差異，較大程度上與酶的酸堿催化有關(guān)。局部環(huán)境的極性：大多反應(yīng)會與溶劑的極性有關(guān)，且溶劑效應(yīng)相當復雜。第六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)化學修飾的方法學

一、修飾劑的要求二、反應(yīng)條件的選擇三、酶性質(zhì)的了解四、酶修飾方法第七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一一、修飾劑的要求1．修飾劑的分子大小、修飾劑鏈的長度對蛋白質(zhì)的吸附性。2．修飾劑上反應(yīng)基團的數(shù)目及位置。3．修飾劑上反應(yīng)基團的活化方法與條件。在酶蛋白不變性的條件下有選擇性地與氨基酸殘基反應(yīng)，易分離修飾后的衍生物以便進行測定。——根據(jù)修飾目的、專一性而定第八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一二、反應(yīng)條件的選擇

反應(yīng)條件應(yīng)盡可能保證蛋白質(zhì)特定空間構(gòu)象不變或少變的情況下進行。

——避免不可逆變性、有利于專一性修飾蛋白

1．反應(yīng)體系中酶與修飾劑的分子比例。酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度。2．反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)，鹽濃度和pH條件。

pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。3．反應(yīng)溫度及時間。嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。第九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一三、酶性質(zhì)的了解1．酶活性部位情況?；钚灾行幕鶊F、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。2．酶的穩(wěn)定條件、酶反應(yīng)最適條件。熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。3．酶分子側(cè)鏈基團的化學性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等。第十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一

修飾酶的性質(zhì)及特點熱穩(wěn)定性抗原性體內(nèi)半衰期酶學性質(zhì)的改變最適pH對組織的分布能力變化第十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性增加修飾劑與酶多點交聯(lián)，固定了酶的分子構(gòu)象，增強了酶的熱穩(wěn)定性。增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性減少了酶熱失活?？乖?/p>

部分可消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原性上效果明顯。

修飾酶的性質(zhì)及特點第十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一體內(nèi)半衰期體內(nèi)半衰期延長

修飾酶的性質(zhì)及特點第十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一酶學性質(zhì)的改變絕大多數(shù)酶經(jīng)過修飾后，最大反應(yīng)速度沒有改變，但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)會增大。修飾酶的性質(zhì)及特點第十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一

對組織的分布能力變化對組織的分布能力有所改變，能在血液中被靶器官選擇性地吸收。最適pH

有些酶經(jīng)過化學修飾后，最適pH發(fā)生變化。修飾酶的性質(zhì)及特點第十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一四、酶修飾方法

酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾有機大分子對酶的化學修飾蛋白質(zhì)類及其他對酶的化學修飾第十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第三節(jié)酶蛋白側(cè)鏈的修飾

一、幾種重要的修飾反應(yīng)

?；磻?yīng)烷基化反應(yīng)氧化和還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學修飾三、研究新熱點第二十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一一、幾種重要的修飾反應(yīng)1．酰化及其相關(guān)反應(yīng)第二十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一2．烷基化反應(yīng)

第二十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一3．氧化和還原反應(yīng)

第二十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一4．芳香環(huán)取代反應(yīng)

第二十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一二、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學修飾

1．巰基的化學修飾巰基具有很強的親核性，采用巰基化學修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構(gòu)象、特性和功能。常用修飾劑：烷基化劑、?；?、馬來酰亞胺第二十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第二十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一2．氨基的化學修飾氨基容易被選擇性修飾，氨基烷基化已成為重要的賴氨酸修飾方法，化學修飾也常用于蛋白質(zhì)序列分析（多肽鏈的N端分析）。常用修飾劑：鹵代乙酸、芳香鹵、磷酸吡哆醛、2，4－二硝基氟苯DNFB、丹磺酰氯DNS第二十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第二十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一3．羧基的化學修飾

第二十九頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一4．咪唑基的化學修飾組氨酸殘基位于許多酶的活性中心，修飾劑焦碳酸二乙酯DPC對其有較好的專一性，修飾產(chǎn)物在240nm處有最大吸收。常用修飾劑：碘代乙酸、焦碳酸二乙酯DPC（均能修飾咪唑環(huán)上的兩個氮原子）第三十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第三十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一5．胍基的化學修飾精氨酸殘基的胍基在中性或弱堿性條件下能與修飾劑發(fā)生反應(yīng)。常用修飾劑：具有兩個臨位羰基的化合物——丁二酮、苯乙二醛、1，2－環(huán)己二酮等。第三十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第三十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一6.酚羥基的化學修飾

酪氨酸殘基的酚羥基可被修飾。蘇氨酸和絲氨酸殘基的羥基也可被該類修飾劑修飾，且產(chǎn)物更為穩(wěn)定，但反應(yīng)條件嚴格。四硝基甲烷TNM在溫和條件下高度專一性地硝化，生成可電離的發(fā)色物質(zhì)，可用于氨基酸定量分析。常用修飾劑：四硝基甲烷TNM、碘、二異丙基氟磷酸酯DFP第三十四頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第三十五頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一7.色氨酸吲哚基的化學修飾色氨酸殘基的吲哚基比巰基、氨基反應(yīng)性差，HNBB和4－硝基苯硫氯對吲哚基修飾比較專一。Koshland試劑Ⅱ[二甲基－（2－羥基－5－硝基芐基）溴化锍],水溶性好，有利于修飾酶，修飾色氨酸時應(yīng)對巰基進行保護。常用修飾劑：N－溴代琥珀酰亞胺NBS、2－羥基－5－硝基芐溴HNBB、4－硝基苯硫氯、Koshland試劑Ⅱ第三十六頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第三十七頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一三、研究熱點-核酸類酶的修飾

RNA酶的側(cè)鏈基團：指組成RNA的核苷酸殘基上的功能團。主要是核糖2’-位置上的羥基和嘌呤、嘧啶堿基上的氨基和羥基。第三十八頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第四節(jié)酶的親和修飾

酶的位點專一性修飾是根據(jù)酶和底物的親和性，試劑作用于被作用部位的某一基團，而不與被作用部位以外的同類基團發(fā)生作用，這類修飾劑也稱為位點專一性抑制劑。具有與底物類似的結(jié)構(gòu)，對酶活性部位有高度的親和性，對活性部位的氨基酸殘基可進行共價標記。因此這類專一性化學修飾也稱為親和標記或?qū)Ｒ恍缘牟豢赡嬉种?。第三十九頁，共四十五頁，編輯?023年，星期一一、親和標記用于親和標記的親和試劑應(yīng)符合如下條件：在使酶不可逆失活之前，親和試劑要與酶形成可逆復合物；親和試劑的修飾程度是有限的；沒有反應(yīng)性的競爭性配體的存在應(yīng)減弱親和試劑的反應(yīng)速度；親和試劑體積不能太大，否則會產(chǎn)生空間障礙；修飾產(chǎn)物應(yīng)當穩(wěn)定，便于表征和定量。第四十頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一親和標記分類

Ks型不可逆抑制：底物、競爭性抑制劑對修飾有保護作用，反應(yīng)定量定點進行。

Kcat型不可逆抑制：專一性很高第四十一頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一二、外生親和試劑與光親和標記

內(nèi)生親和試劑：試劑本身的某部分通過化學方法轉(zhuǎn)化為所需要的反應(yīng)基團，而對試劑的結(jié)構(gòu)沒有大的擾動。親和試劑

外生親和試劑：把反應(yīng)性基團加入到試劑中去。光親和試劑是一類特殊的外生親和試劑，它在結(jié)構(gòu)上除了有一般親和試劑的特點外，還具有一個光反應(yīng)基團。這種試劑先與酶活性部位在暗反應(yīng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合，然后被光照激活，產(chǎn)生一個非?；顫姷墓δ芑鶊F能與它們附近幾乎所有基團反應(yīng)，形成一個共價的標記物。第四十二頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一第五節(jié)酶的化學交聯(lián)

定義：酶的化學交聯(lián)是一類重要的化學修飾。交聯(lián)劑有兩個反應(yīng)活性部位的雙功能基團可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。分類：交聯(lián)劑分為同型雙功能試劑、異型雙功能試劑和可被光活化試劑三種類型，每類又可分為可裂解型和不可裂解型。第四十三頁，共四十五頁，編輯于2023年，星期一同型雙功能交聯(lián)劑