第十一章DNA文庫的構(gòu)建和目的基因的篩選

本章提要基因組文庫的構(gòu)建cDNA文庫的構(gòu)建DNA文庫篩選重組DNA導(dǎo)入宿主細胞的方式當(dāng)前第1頁\共有108頁\編于星期五\23點本章要求掌握基因組文庫、cDNA文庫的概念及構(gòu)建方法；DNA文庫的篩選方法（包括表型篩選法、PCR篩選法、酵母雙雜交系統(tǒng)）及原理；熟悉基因組文庫質(zhì)量檢測方法；DNA文庫的分類；DNA文庫的保存方法；了解各種類型cDNA文庫（全長cDNA文庫、差減cDNA文庫等）的構(gòu)建原理；外源DNA轉(zhuǎn)移進宿主細胞的主要方法。當(dāng)前第2頁\共有108頁\編于星期五\23點基因庫(genepool)：特定生物體全基因組的集合(天然存在)

?；蛭膸?genelibrary)：指某一生物體全部或部分基因的集合

。某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。根據(jù)外源DNA片段來源的不同，基因文庫分為：基因組文庫：材料來自染色體DNA，含有全部基因組序列。任何器官、組織、細胞、任何發(fā)育時期以及在任何環(huán)境下，基因組DNA是衡定的，所以用該生物的任何材料均可構(gòu)建基因組DNA文庫且具有一致性。定義和分類當(dāng)前第3頁\共有108頁\編于星期五\23點基因組文庫：分離特定的基因、分析特定基因的結(jié)構(gòu)、研究基因的起源與進化、基因的表達調(diào)控cDNA文庫：大規(guī)?；驕y序、發(fā)現(xiàn)和尋找新基因、基因注釋、基因表達譜分析、基因功能研究cDNA文庫：材料來自mRNA，含有全部蛋白編碼基因的cDNA，無啟動子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等，序列信息量遠小于基因組文庫。在高度分化的生物體中，不同器官、組織、細胞、不同發(fā)育時期以及對不同環(huán)境的應(yīng)答中，mRNA種類和豐度不同，即表達譜不同，因此同種生物體的cDNA文庫隨表達譜變化而變化，用什么材料構(gòu)建什么樣的cDNA文庫依研究目標而定。當(dāng)前第4頁\共有108頁\編于星期五\23點DNA文庫構(gòu)建的基本程序1、提取研究對象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；2、DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA；3、重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞或體外包裝后侵染受體菌；4、陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。當(dāng)前第5頁\共有108頁\編于星期五\23點第一節(jié)

基因組DNA文庫的構(gòu)建定義：指將某生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，與合適的載體體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細胞獲得的所有陽性菌落。當(dāng)前第6頁\共有108頁\編于星期五\23點根據(jù)構(gòu)建文庫載體的不同，分為：1、質(zhì)粒文庫：容納片段小于10kb，以菌落的形式保存和篩選，一般用于對大片段文庫的亞克隆，用于鳥槍法測序等。2、噬菌體文庫：一般用λ載體，插入型容納片段小于7kb，適合于構(gòu)建cDNA文庫，置換型容納9-25kb，適合于構(gòu)建亞克隆文庫或直接構(gòu)建基因組文庫。3、粘粒文庫：一般用于直接構(gòu)建基因組文庫，最長插入片段比λ文庫略長，達45kb左右。4、人工染色體文庫：有細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)、P1人工染色體(PAC)等文庫，最大插入片段分別為300kb、1000kb和300kb，是大片段文庫，主要用于基因組測序和物理圖譜構(gòu)建。5、亞基因組文庫：相對于基因組文庫提出的，文庫的對象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段。亞基因組文庫主要應(yīng)用在基因組較小的物種基因克隆或大基因組物種的后期研究。當(dāng)前第7頁\共有108頁\編于星期五\23點文庫的代表性和隨機性代表性是指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。采用兩個策略提高代表性：一是采用部分酶切或隨機切割的方法來消化染色體DNA，以保證克隆的隨機性，保證每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等；二是提高文庫所含基因組DNA的總?cè)萘?，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來衡量。文庫的總?cè)萘坑赏庠雌蔚钠骄L度和重組克隆的數(shù)量共同決定。當(dāng)前第8頁\共有108頁\編于星期五\23點為預(yù)測一個完整基因組文庫應(yīng)包含克隆的數(shù)目，Clark和Carbon于1975年提出如下的計算公式：N=ln（1-p）/ln（1-f）N：代表一個完全基因組文庫所應(yīng)該包含的重組克隆個數(shù)

p：表示所期望的目的基因在文庫中出現(xiàn)的幾率

f：表示重組克隆平均插入片段的大小和基因組DNA大小的比值當(dāng)前第9頁\共有108頁\編于星期五\23點哺乳動物：3*109bp若p=99%，平均克隆片段長度20kbf=20kb/3*107kbN=690773.2E.Coli：4639221bpp=99%，f=20kb/4600kbN=1056.9p=99%，f=10kb/4600kbN=2116當(dāng)前第10頁\共有108頁\編于星期五\23點隨機性既表示構(gòu)建文庫時要從基因組DNA獲得隨機斷裂的片段，也表示構(gòu)建好的文庫中所有基因要有相等的篩選概率。除了代表性和隨機性外，一個理想的基因文庫還應(yīng)具備下列條件：

1、重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；

2、載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆

3、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序和染色體步查；

4、克隆片段易于從載體分子上完整卸下進行亞克隆；

5、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增和篩選，文庫繁殖后失真度小。當(dāng)前第11頁\共有108頁\編于星期五\23點載體的選擇構(gòu)建大片段基因組DNA文庫使用的載體主要有λ噬菌體（λphage）、粘粒載體（cosmid）、細菌人工染色體（BacterialArtificialChromosomes,BAC）、酵母人工染色體YAC（YeastArtificialChromosomes,YACs）、P1（BacteriophageP1）和PAC。根據(jù)特征，這些載體可以分為兩類:一類是基于噬菌體改建的，利用了噬菌體的包裝效率高和雜交篩選背景低的優(yōu)點；

另一類經(jīng)改造的質(zhì)粒載體或人工染色體，其主要優(yōu)點在于可容納超過100kb以上的外源片段。當(dāng)前第12頁\共有108頁\編于星期五\23點基因組DNA文庫的構(gòu)建流程

基因組DNA文庫的構(gòu)建程序包含5個部分：①載體的制備；②高純度大分子量基因組DNA（HighMolecularWeightDNA,HMWDNA）的提?。虎跦MWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離（PFGEsizeselection）；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細胞；⑤重組克隆的挑取和保存。當(dāng)前第13頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第14頁\共有108頁\編于星期五\23點1、基因組DNA文庫的載體制備載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備要求兩點，一是純度高；二是去磷酸化好。

2、高質(zhì)量大分子量基因組DNA的提取和部分酶切

構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對DNA質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的3～5倍。實踐表明，提取的基因組DNA分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。當(dāng)前第15頁\共有108頁\編于星期五\23點培養(yǎng)的單細胞

組織

血液 收集單細胞

破碎

濃縮白細胞

清洗懸浮細胞⑴ 調(diào)整細胞濃度至確定值⑵低熔點瓊脂糖凝膠固定成塊狀或粒狀⑷蛋白酶K或脂酶在EDTA環(huán)境下消化蛋白質(zhì)和脂質(zhì)⑸清洗樣品，保存在EDTA溶液 存在細胞壁時需降解處理⑶ 當(dāng)前第16頁\共有108頁\編于星期五\23點3、文庫的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染

一般在構(gòu)建大片段基因組DNA文庫時，大量連接前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例。在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的進口感受態(tài)細胞或效價高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白，同時，研究表明對連接產(chǎn)物進行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。4、文庫的質(zhì)量檢測

文庫的質(zhì)量是由文庫所含克隆的數(shù)目、平均插入片段的長度、插入效率、基因組覆蓋度和覆蓋倍數(shù)等因素所決定的。在文庫的質(zhì)量檢測中，除了克隆子數(shù)目是可以確定的，其它值都是估算的。當(dāng)前第17頁\共有108頁\編于星期五\23點基因組覆蓋倍數(shù)的計算方法一般包括兩種：一是公式計算法，基因組覆蓋倍數(shù)＝平均插入片段長度×克隆數(shù)/基因組DNA的長度（一般是約數(shù)）；另一種算法是結(jié)合基因組覆蓋度的檢測來進行的?；蚪M覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測時是通過選擇一定數(shù)目的已知的單拷貝的基因作探針來篩選文庫。由于所使用的每個探針篩選的克隆數(shù)目即表明文庫中對該基因位點的覆蓋倍數(shù)，因此，基因組覆蓋倍數(shù)又等于所有探針篩選到的陽性克隆的總個數(shù)/使用的總探針數(shù)的比值。當(dāng)前第18頁\共有108頁\編于星期五\23點基因組DNA文庫克隆子的保存1、影印濾膜保存法當(dāng)前第19頁\共有108頁\編于星期五\23點2、文庫在液體培養(yǎng)基中擴增保存方法：從瓊脂平板上挑取已長出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70oC儲存（加終濃度為25%的甘油）。缺點：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致文庫中某些特定的序列過多或過少。3、保存單個克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-70oC或-25oC下保存。缺點：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大當(dāng)前第20頁\共有108頁\編于星期五\23點現(xiàn)在一般用文庫陣列法（libraryarraying）保存大片段DNA文庫，即利用聚乙烯材料制作的384孔（16×24）或96孔（8×12）無菌培養(yǎng)板來保存文庫克隆。用手工或機器人將重組克隆挑至含抗凍液和抗生素的液體培養(yǎng)基的384孔或96孔板過夜培養(yǎng)。待培養(yǎng)液渾濁后，用384針或96針復(fù)制器制備多個拷貝，按編號保存于-80℃超低溫冰箱。由于文庫反復(fù)凍融會影響細菌的活性，一般文庫的原始拷貝留在超低溫冰箱內(nèi)不讓其發(fā)生凍融，只取一個拷貝用于后續(xù)的操作，該拷貝使用一段時間以后淘汰，重新以上一拷貝為模板制作新的拷貝使用，這樣可將文庫保存很長時間，可供長期反復(fù)使用。對大腸桿菌而言，使用添加抗凍液的培養(yǎng)基可延長文庫使用時間。當(dāng)前第21頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第22頁\共有108頁\編于星期五\23點第二節(jié)

cDNA文庫的構(gòu)建cDNA(complementaryDNA，互補DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補DNA。定義：是指將某種生物體基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNA文庫。當(dāng)前第23頁\共有108頁\編于星期五\23點特征和應(yīng)用：從cDNA文庫分離基因比從基因組文庫中分離基因更具優(yōu)勢。cDNA文庫具有時空特異性，cDNA文庫反映了特定組織（或器官）在某種特定環(huán)境條件下基因的表達譜。cDNA文庫可用于大規(guī)?；驕y序、發(fā)現(xiàn)和尋找新基因、基因注釋、基因表達譜分析和基因功能研究等方面。當(dāng)前第24頁\共有108頁\編于星期五\23點cDNA文庫的構(gòu)建共分四步：①細胞總RNA的提取和mRNA分離；②第一鏈cDNA合成；③第二鏈cDNA合成；④雙鏈cDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖。當(dāng)前第25頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第26頁\共有108頁\編于星期五\23點RNA的分離cDNA文庫構(gòu)建是以mRNA為起始材料的，mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構(gòu)建cDNA文庫和其它應(yīng)用所必需進行的步驟。通過降低rRNA和tRNA含量，可大大提高篩選到目標基因的可能性。目前純化mRNA的方法都是在固體支持物表面共價結(jié)合固定一段由脫氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]鏈，由它與mRNA的Poly（A）尾巴雜交，從而吸附固定住mRNA，進而將mRNA從其它組分中分離出來的。當(dāng)前第27頁\共有108頁\編于星期五\23點1、mRNA的來源:選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。2、mRNA完整性的檢測1)mRNA分子的大?。翰溉閯游飉RNA長度為500-8000bp，大部分mRNAkb之間.2)總mRNA指導(dǎo)合成cDNA第一鏈長分子的能力。3)指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力，指導(dǎo)合成目的多肽的能力。當(dāng)前第28頁\共有108頁\編于星期五\23點3、mRNA在細胞中的豐度1)高豐度mRNA目的mRNA在細胞中的含量占細胞質(zhì)總mRNA量的50-90%,如珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，每個細胞大約5000拷貝，該類mRNA在合成和克隆cDNA之前不需進一步純化特定mRNA；2)中等豐度mRNA目的mRNA在細胞中的含量占細胞質(zhì)總mRNA量的10%左右，每個細胞大約200-300拷貝；2)低豐度mRNA目的mRNA在細胞中的含量占細胞質(zhì)總mRNA量的0.5%以下，每個細胞大約1-15拷貝。當(dāng)前第29頁\共有108頁\編于星期五\23點4、mRNA的富集方法典型的哺乳動物細胞含有10,000-30,000種不同的mRNA分子,某些mRNA分子在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)很低甚至只有一個拷貝。當(dāng)前第30頁\共有108頁\編于星期五\23點1)按大小對mRNA進行分級分離通過瓊脂糖凝膠電泳分離大小不同的mRNA分子，該方法的分離效果最好，但從凝膠中回收的得率較低.蔗糖梯度離心：加入破壞RNA二級結(jié)構(gòu)的變性劑如氫氧化甲基汞等，再進行蔗糖梯度離心以分離不同分子量的mRNA.2)cDNA的分級分離mRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開來。優(yōu)點：a）避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解b）增加了獲得全長cDNA克隆的概率c）獲得更準確的分級分離效果（分子量）當(dāng)前第31頁\共有108頁\編于星期五\23點3）多聚核糖體免疫學(xué)純化法使用抗體來純化合成目的多肽的多聚核糖體。將正在合成的新生多肽鏈的多聚核糖體結(jié)合到免疫親和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，隨后用EDTA將多聚核糖體解離下來，并通過Oligo(dT)層析分離mRNA,利用該方法可將目的mRNA純化數(shù)千倍。目的mRNA在細胞中的含量可為數(shù)十拷貝。當(dāng)前第32頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第33頁\共有108頁\編于星期五\23點第一鏈cDNA的合成oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈。缺陷：cDNA末端存在較長的poly（A）而影響cDNA測序；因為逆轉(zhuǎn)錄酶無法到達mRNA分子的5’－末端。對于大分子量的較長的mRNA分子而言，特別麻煩。當(dāng)前第34頁\共有108頁\編于星期五\23點mRNA當(dāng)前第35頁\共有108頁\編于星期五\23點隨機引物引導(dǎo)的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis)：

根據(jù)許多可能的序列，合成出6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，而不僅僅從3’-末端的oligo(dT)引物一處開始。

隨機引物cDNA合成的方法不適合構(gòu)建cDNA文庫，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。當(dāng)前第36頁\共有108頁\編于星期五\23點第二鏈cDNA的合成cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補雙鏈cDNA的過程。cDNA第二鏈的合成的方法主要4種：自身引導(dǎo)合成法、置換合成法、引導(dǎo)合成法、引物－銜接頭合成法。當(dāng)前第37頁\共有108頁\編于星期五\23點1）自身引導(dǎo)合成法：獲得的單鏈cDNA3’端具有形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能力，以此作為第二鏈合成的引物，在大腸桿菌聚合酶IKlenow或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。再利用S1核酸酶將連接處（僅該位點處為單鏈結(jié)構(gòu)）切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進行連接。缺點：在以S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時，會導(dǎo)致對應(yīng)于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。S1核酸酶的純度不夠時，會偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。當(dāng)前第38頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第39頁\共有108頁\編于星期五\23點2）置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失原理：以第一鏈合成產(chǎn)物cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板，RNA酶H在雜交體的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二鏈。當(dāng)前第40頁\共有108頁\編于星期五\23點優(yōu)點：a）合成cDNA的效率高

b）直接利用第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物，不需純化

c）避免使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA當(dāng)前第41頁\共有108頁\編于星期五\23點3）引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列首先是制備帶有Poly（dT）的載體片段Ⅰ和一端帶有Poly（dG）的片段Ⅱ，并用片段Ⅰ來代替Oligo（dT）進行cDNA第一鏈的合成，在第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同時進行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段Ⅱ一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNA酶H、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA。主要特點：合成全長cDNA的比例較高，但操作比較復(fù)雜，形成的cDNA克隆中都帶有一段Poly（dC）/（dA），對重組子的復(fù)制和測序都不利。當(dāng)前第42頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第43頁\共有108頁\編于星期五\23點4）引物-銜接頭法：引導(dǎo)合成法改進而來第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補的cDNA鏈，接頭序列可以是適用于PCR擴增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成PCR法構(gòu)建cDNA文庫的常用方法。

當(dāng)前第44頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第45頁\共有108頁\編于星期五\23點雙鏈cDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對雙鏈cDNA的末端進行加工是十分必要的方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端末端轉(zhuǎn)移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補的尾部當(dāng)前第46頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第47頁\共有108頁\編于星期五\23點雙鏈cDNA的克隆：

雙鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：1>平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收2>平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段3>加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收當(dāng)前第48頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第49頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第50頁\共有108頁\編于星期五\23點cDNA文庫構(gòu)建的其它類型1、均一化cDNA文庫它是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中，且在cDNA文庫中表達基因?qū)?yīng)的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。均一化cDNA文庫是克服基因轉(zhuǎn)錄水平上巨大差異給文庫篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達和序列分析。當(dāng)前第51頁\共有108頁\編于星期五\23點現(xiàn)在，在構(gòu)建均一化的cDNA文庫中至少有2種主要的觀點：一種是基于基因組DNA在拷貝數(shù)上具有相對均一化的性質(zhì)，通過cDNA與基因組DNA飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的cDNA的豐度；（基因組DNA飽和雜交法

）另一種是基于復(fù)性動力學(xué)的原理，高豐度的cDNA在退火條件下復(fù)性的速度快，而低豐度的cDNA復(fù)性要很長時間，從而可以通過控制復(fù)性時間來降低豐度。（基于復(fù)性動力學(xué)原理的均一化方法）當(dāng)前第52頁\共有108頁\編于星期五\23點基因組DNA飽和雜交法

優(yōu)點：簡單，沒有儀器上的限制。缺點：1、很難獲得覆蓋基因組的單鏈DNA片段，導(dǎo)致文庫內(nèi)基因的丟失，構(gòu)建兩個獨立、互補的均一化文庫可以一定程度地彌補這一不足；2、文庫自身雜交的速度很快，導(dǎo)致基因丟失，但可將cDNA文庫制備成單鏈后再與固定的基因組DNA雜交來克服。當(dāng)前第53頁\共有108頁\編于星期五\23點基于復(fù)性動力學(xué)原理的均一化方法優(yōu)點：1、幾乎不會導(dǎo)致起始文庫中cDNA的丟失；2、均一化效果更為明顯。缺點：控制參數(shù)較多，難以把握，需要多次嘗試與摸索。當(dāng)前第54頁\共有108頁\編于星期五\23點均一化cDNA文庫具有以下4方面的優(yōu)點：第一，在經(jīng)濟上具有廣泛的應(yīng)用空間，可以節(jié)約大量試驗成本。第二，增加克隆低豐度mRNA的機會，適用于分析各種發(fā)育階段或各種組織的基因表達及突變檢測。第三，與原始豐度的mRNA拷貝數(shù)相對應(yīng)的cDNA探針與均一化的cDNA文庫作雜交，可以估計出大多數(shù)基因的表達水平及發(fā)現(xiàn)一些組織特異的基因。而以往的文庫構(gòu)建，忽略了mRNA豐度的影響。第四，可以用于遺傳圖譜的制作和進行大規(guī)模的原位雜交，作為優(yōu)化的文庫系統(tǒng)還可以用于大規(guī)模的測序或芯片制作等研究。當(dāng)前第55頁\共有108頁\編于星期五\23點2、差減cDNA文庫(SubtractivecDNAlibrary)差減文庫也稱扣除文庫，扣除雜交法的本質(zhì)是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。扣除雜交技術(shù)（subtractivehybridization）是將含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為待測樣本（tester），將基因表達譜相似或相近但不含目的基因的組織或器官的mRNA群體作為對照樣本（driver），將tester和driver的cDNA進行多次雜交，去掉在二者之間都表達的基因，而保留兩者之間差異表達的基因，使低豐度基因在文庫中的比例大大提高，篩選到差異表達的基因的可能性也大大提高。方法：抑制性扣除雜交、mRNA-cDNA雜交當(dāng)前第56頁\共有108頁\編于星期五\23點抑制性扣除雜交基本原理：SSH技術(shù)利用抑制性PCR能選擇性擴增不同豐度差異基因和cDNA消減雜交特點,運用雜交二級動力學(xué)原理（即高豐度序列退火時產(chǎn)生同源雜交的速度大于低豐度序列）,使原本不同豐度的DNA序列相對含量趨于一致。然后利用抑制性PCR特點,兩端接上同一接頭的非目的基因片段由于具有反向重復(fù)序列,在退火時容易形成發(fā)夾互補結(jié)構(gòu),在PCR中不能作為模板與引物配對擴增,從而選擇性擴增目的基因而抑制非目的基因片段擴增。消減雜交扣除了實驗組和對照組之間同源序列,再結(jié)合抑制性PCR的動力學(xué)富集,實現(xiàn)高效分離低豐度特異性非同源片段。當(dāng)前第57頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第58頁\共有108頁\編于星期五\23點mRNA-cDNA雜交方法原理：用過量的驅(qū)動mRNA與供體的cDNA文庫質(zhì)粒反復(fù)多輪雜交，去除驅(qū)動和供體共同表達的基因，構(gòu)建均一化的、扣除雜交cDNA文庫。當(dāng)前第59頁\共有108頁\編于星期五\23點3、全長cDNA文庫構(gòu)建全長cDNA文庫，不僅要考慮如何確保第二鏈的完整合成，還要考慮如何避開反轉(zhuǎn)錄酶或mRNA本身的影響。理論上講，如果有一種方法能夠在合成cDNA之后，對全長cDNA進行選擇，就可大幅度提高全長cDNA克隆的比例。3個代表性的例子：SMART全長cDNA文庫、Cap-Trapper法、煙草酸焦磷酸酶法當(dāng)前第60頁\共有108頁\編于星期五\23點SMART全長cDNA文庫的構(gòu)建方法：在第一鏈cDNA合成時，由于反轉(zhuǎn)錄酶帶有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，當(dāng)其到達mRNA5′端時會自動在第一鏈cDNA的3′末端加上幾個d（C）。加入帶有3個d（G）的特異性引物，該引物會與全長cDNA第一鏈互補結(jié)合，，然后繼續(xù)以該引物為模板合成互補鏈。當(dāng)前第61頁\共有108頁\編于星期五\23點Cap-Trapper法構(gòu)建全長cDNA文庫：首先利用3′帶錨定堿基的oligo（dT）12引物引導(dǎo)合成第一鏈cDNA。合成第一鏈cDNA時用dm5CTP代替dCTP，使所有的胞嘧啶都被5-甲基-dCTP取代，以保護cDNA不被隨后的限制性內(nèi)切酶消化。其次在mRNA的5′和3′末端標記上生物素，并用RNaseⅠ消化單鏈RNA。然后利用偶聯(lián)了生物素抗體的磁珠分離出生長的cDNA-mRNA雜合雙鏈，水解mRNA鏈后再利用加尾法在第一鏈cDNA末端加上oligo（dG），并合成第二鏈cDNA。最后用合適的限制性內(nèi)切酶消化雙鏈cDNA，與載體連接，包裝后感染大腸桿菌即可獲得全長的cDNA文庫當(dāng)前第62頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第63頁\共有108頁\編于星期五\23點煙草酸焦磷酸酶法構(gòu)建全長cDNA文庫:煙草酸焦磷酸酶（tobaccoacidpyrophosphatase,TAP）法能特異地識別真核生物mRNA的5′端帽子結(jié)構(gòu)并將其去除，暴露出切口5′端的磷酸基團，可以在該切口處連接一段特異的接頭來引導(dǎo)cDNA第二鏈的合成。當(dāng)前第64頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第65頁\共有108頁\編于星期五\23點基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較當(dāng)前第66頁\共有108頁\編于星期五\23點第三節(jié)基因克隆的篩選策略表型篩選法雜交篩選和PCR篩選免疫篩選酵母雙雜交系統(tǒng)篩選當(dāng)前第67頁\共有108頁\編于星期五\23點表型篩選法表型篩選法是根據(jù)目的基因編碼比較特殊的功能，并且其與載體作用可以在宿主菌（如大腸桿菌）中表達該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表型性狀來，這樣就很容易通過導(dǎo)入的基因帶來新的功能或恢復(fù)其缺失的功能來確定目的基因。表型特征一般要求是直接的形態(tài)學(xué)特征或比較容易檢測的生化酶學(xué)的特征，比如營養(yǎng)缺陷型相關(guān)的基因和抗性基因（類似抗逆性基因）等。對于表型篩選法來說，其對所使用的宿主有相應(yīng)的要求，宿主為不攜帶該種基因或是該基因的缺失突變體。當(dāng)前第68頁\共有108頁\編于星期五\23點(1)抗藥性篩選:這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標記進行的篩選方法。當(dāng)前第69頁\共有108頁\編于星期五\23點(2)插入失活篩選法經(jīng)過上述抗藥性篩選獲得的大量轉(zhuǎn)化子中既包括需要的重組子，也含有不需要的非重組子。為了進一步篩選出重組子，可利用質(zhì)粒載體的雙抗藥性進行再次篩選。當(dāng)前第70頁\共有108頁\編于星期五\23點(3)顯色反應(yīng)選擇法(α-互補法)將含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和氨基端（N端）146個氨基酸編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至可編碼β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主細胞中，可使各自無活性的片段實現(xiàn)互補，融為一體，產(chǎn)生具有酶學(xué)活性的蛋白，從而使轉(zhuǎn)化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍色菌落，這種現(xiàn)象就稱為α-互補。當(dāng)前第71頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第72頁\共有108頁\編于星期五\23點雜交篩選和PCR篩選當(dāng)目標基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表達的真核生物的基因，可以利用的可能只是該基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，此時就必須考慮其它的方法來篩選。雜交篩選法是應(yīng)用最為廣泛的篩選目標基因克隆的一種方法。用已知序列的基因的篩選保存于384孔培養(yǎng)板的大片段DNA文庫時，還可以采用更加簡單快捷的方法——混合池PCR篩選法。當(dāng)前第73頁\共有108頁\編于星期五\23點列混合池行混合池123456789101112131415161718192021222324ABCDEFGHIJKLMNOP當(dāng)前第74頁\共有108頁\編于星期五\23點免疫篩選免疫篩選法和核酸雜交的方法類似，只是其使用的探針不是核酸，而是特異性的抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細胞中存在抗原蛋白的表達，用于篩選的DNA文庫必須是表達文庫，通常是原核生物的基因組DNA文庫和真核生物的cDNA表達文庫。而且，所檢測的對象為宿主中不編碼的基因或宿主中缺失表達的基因。根據(jù)檢測方法的不同，可以分為原位檢測和免疫沉淀檢測當(dāng)前第75頁\共有108頁\編于星期五\23點濾膜（固定抗原）+當(dāng)前第76頁\共有108頁\編于星期五\23點免疫沉淀檢測法菌落沉淀素當(dāng)前第77頁\共有108頁\編于星期五\23點酵母雙雜交系統(tǒng)篩選酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。用來篩選與已知基因的產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白的編碼基因。典型的真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子，如GAL4、GCN4等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-bindingdomain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activatingdomain)。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第78頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第79頁\共有108頁\編于星期五\23點這兩個結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_時仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。單獨的DB能和啟動子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。如酵母細胞的Gal4蛋白的DB與大腸桿菌的一個酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點并激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)前第80頁\共有108頁\編于星期五\23點雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株。報道株指經(jīng)改造的、含報道基因(reportergene)的重組質(zhì)粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞。酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點:〈1〉易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒。〈2〉具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因?！?〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合。當(dāng)前第81頁\共有108頁\編于星期五\23點原理：在以上研究的基礎(chǔ)上，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Baitprotein的基因構(gòu)建在同一個表達載體上，在酵母中表達兩者的融合蛋白BD-Baitprotein。將編碼AD的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達載體上。同時將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營養(yǎng)的培養(yǎng)基上無法正常生長。當(dāng)上述兩種載體所表達的融合蛋白能夠相互作用時，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報告基因HIS、ADE、LACZ等，從而通過功能互補和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。當(dāng)前第82頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第83頁\共有108頁\編于星期五\23點酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點⑴作用信號是在融合基因表達后，在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。⑵檢測在活細胞內(nèi)進行，可以在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。⑶檢測的結(jié)果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用。⑷酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析細胞質(zhì)、細胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。當(dāng)前第84頁\共有108頁\編于星期五\23點酵母雙雜交系統(tǒng)局限性和存在的問題⑴雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無法進行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細胞外蛋白和細胞膜受體蛋白等的研究；⑵酵母雙雜交系統(tǒng)的一個重要的問題是"假陽性"。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達時發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而引起報告基因的表達，產(chǎn)生"假陽性"結(jié)果。當(dāng)前第85頁\共有108頁\編于星期五\23點克隆基因的驗證和分析

酶切指紋圖譜主要用于鑒定一些已知酶切位點基因的目的克隆，由于酶切的指紋圖譜已知，當(dāng)采用某種酶來消化待鑒定的克隆時，真陽性克隆會在電泳之后出現(xiàn)預(yù)期的指紋圖譜。Southern雜交可真實的判斷重組子中含有與探針DNA雜交的片段。二次雜交法主要用于核酸雜交法或PCR方法篩選的陽性克隆的重新鑒定，一般是提取待鑒定克隆的重組質(zhì)?；蚴删wDNA，用一種或兩種酶消化后電泳并轉(zhuǎn)膜，然后用起始探針重新雜交，結(jié)合陽性片段的大小來進一步確定陽性克隆。DNA序列分析法是根據(jù)陽性克隆的序列與已有信息進行比較，判斷篩選到的克隆真假，是一種最準確可靠的鑒定方法。當(dāng)前第86頁\共有108頁\編于星期五\23點重組DNA導(dǎo)入宿主的方式轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)染感染當(dāng)前第87頁\共有108頁\編于星期五\23點轉(zhuǎn)化1928，Grffith在觀察肺炎鏈球菌（Diplococcuspneumoniae）有毒株和無毒株在活體內(nèi)的相互作用時發(fā)現(xiàn)：把加熱殺死的S型菌株和活的R型菌株混合培養(yǎng)時，能從中分離出活的S型菌，并能繼續(xù)傳代。定義：來自一個細菌細胞（供體）的DNA（片段）被另一個細胞（受體）所吸收（隨后同受體染色體一起進行重組）的過程。

當(dāng)前第88頁\共有108頁\編于星期五\23點對DNA的吸收，僅在受體生長周期中的一個短暫階段。能夠吸收DNA的細胞，稱作感受態(tài)細胞（competentcell）。在轉(zhuǎn)化中有功能的DNA是ds或ssDNA，線狀或環(huán)狀。當(dāng)前第89頁\共有108頁\編于星期五\23點（一）CaCl2

轉(zhuǎn)化法

核心：目標細胞在CaCl2·H2O溶液中浸泡一段時間，轉(zhuǎn)化效率107-109

cell/μgDNA。

E.coli:DH5α,TG1,XL-1Blue,JM105

（1）冰上30min

（2）熱激42℃90"

（3）恢復(fù)1～2min

（4）復(fù)蘇37℃45-60min

當(dāng)前第90頁\共有108頁\編于星期五\23點（二）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法protoplast

適用于G+

細菌，特別是芽孢桿菌、酵母。

過程：

（1）等滲環(huán)境下，脫細胞壁（溶菌酶、溶壁酶、蝸牛酶、纖維素酶、果膠酶）

（2）細胞壁再生（三）電轉(zhuǎn)化法（electroporation）

緩沖液：10%甘油或蔗糖，含（或不含）Mg2+離子。

轉(zhuǎn)化條件：2.5KV/0.2cm當(dāng)前第91頁\共有108頁\編于星期五\23點當(dāng)前第92頁\共有108頁\編于星期五\23點轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）定義：由噬菌體將外源基因由一個細菌（供體）轉(zhuǎn)移到另一個細菌（受體）的過程。1、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）：供體的單個或緊密連鎖的少數(shù)幾個基因被噬菌體因錯誤裝配