第二講植物組培的培養(yǎng)基詳解演示文稿

第二講植物組培的培養(yǎng)基詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有55頁\編于星期五\22點優(yōu)選第二講植物組培的培養(yǎng)基當(dāng)前第2頁\共有55頁\編于星期五\22點

第一節(jié)培養(yǎng)基的種類和成分

一、培養(yǎng)基種類▼二、培養(yǎng)基成分▼

第二節(jié)培養(yǎng)基制備

▼一、母液配制和保存二、培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌▼第三節(jié)培養(yǎng)基的選擇▼一、單因子試驗二、多因子試驗三、逐步增減法四、廣譜實驗法當(dāng)前第3頁\共有55頁\編于星期五\22點一、培養(yǎng)基的種類

1、根據(jù)其態(tài)相不同分為固體培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)基是指加凝固劑的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，加熱溶解后，分別裝入常用的培養(yǎng)容器中冷卻后即得到固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基是指不加凝固劑的培養(yǎng)基。

當(dāng)前第4頁\共有55頁\編于星期五\22點

培養(yǎng)基種類

固體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基▲營養(yǎng)分布均勻，生長整齊一致，但通氣性差。通氣性較好，便于操作，但營養(yǎng)分布不均，生長發(fā)育不整齊。二者比較當(dāng)前第5頁\共有55頁\編于星期五\22點2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程培養(yǎng)基分為：

初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基

外植體：從植物體上取出的用于無菌培養(yǎng)的植物材料。

植物材料：莖尖、莖段、花瓣、葉子、花藥等

當(dāng)前第6頁\共有55頁\編于星期五\22點初代培養(yǎng)：指用來第一次接種從植物體上分離下來的外植體過程。繼代培養(yǎng)：對培養(yǎng)物(包括細(xì)胞、組織或其切段)通過更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進(jìn)行連續(xù)多代的培養(yǎng)，就稱為繼代培養(yǎng)。當(dāng)前第7頁\共有55頁\編于星期五\22點

3、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為：

誘導(dǎo)培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基

生根培養(yǎng)基

4、根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。

基本培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。

完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機物質(zhì)等。當(dāng)前第8頁\共有55頁\編于星期五\22點

常用培養(yǎng)基種類

MS培養(yǎng)基

B5培養(yǎng)基White培養(yǎng)基

N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基當(dāng)前第9頁\共有55頁\編于星期五\22點

★有機成分復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素

用于原生質(zhì)體培養(yǎng)(包括原生質(zhì)融合的培養(yǎng))KM-8P培養(yǎng)基特點：當(dāng)前第10頁\共有55頁\編于星期五\22點N6培養(yǎng)基特點：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計成分簡單KNO3

和(NH4)2SO4含量高廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其它植物的花藥培養(yǎng)等

當(dāng)前第11頁\共有55頁\編于星期五\22點White培養(yǎng)基特點：1943年由Ｗhite為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。1963年又作了改良，稱作Ｗhite改良培養(yǎng)基。特點：無機鹽含量較低適用：生根培養(yǎng)。當(dāng)前第12頁\共有55頁\編于星期五\22點B5培養(yǎng)基特點：含較低的銨雙子葉植物尤其木本植物組培可選擇

當(dāng)前第13頁\共有55頁\編于星期五\22點MS培養(yǎng)基特點：無機鹽、離子濃度高，硝酸鹽含量較高。

▲MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無機鹽的濃度較高，能保證組織培生長所需的礦物質(zhì)營養(yǎng)。并且因為離子濃度高，在配制、貯存、消毒過程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡

當(dāng)前第14頁\共有55頁\編于星期五\22點

二、

培養(yǎng)基成分

水

植物激素

無機鹽

有機物培養(yǎng)體支持材料

輔助性物質(zhì)▲當(dāng)前第15頁\共有55頁\編于星期五\22點

一、無機鹽

▲

氮枝葉生長需要氮素，缺氮老葉先發(fā)黃；氮過量，枝葉過度茂盛。磷

缺磷，植株生長緩慢，老葉暗紫色。鉀

促進(jìn)花卉生長健壯，增強抗性，莖稈挺拔。缺鉀，葉尖、葉緣枯焦，葉片呈皺曲狀，老葉發(fā)黃或火燒狀。鈷

缺鈷，葉片失綠而卷曲，整個葉片向上彎曲凋枯。當(dāng)前第16頁\共有55頁\編于星期五\22點二、有機物維生素肌醇氨基酸天然復(fù)合物椰子汁（CM）酵母浸出液（YE)水解酪蛋白（CH)碳水化合物馬鈴薯汁液其它▲當(dāng)前第17頁\共有55頁\編于星期五\22點碳水化合物選用種類：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等蔗糖濃度：2%～3%，胚培養(yǎng)為4%～15%大生產(chǎn)時可用白糖▲當(dāng)前第18頁\共有55頁\編于星期五\22點

糖在培養(yǎng)基的作用：1）為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架2）為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量3）維持滲透壓當(dāng)前第19頁\共有55頁\編于星期五\22點種類：

VB1（鹽酸硫胺素）、VB6（鹽酸吡哆醇）、VB3（煙酸）、Vc（抗壞血酸濃度：0.1－1.0mg/L作用：VB1

促愈傷組織產(chǎn)生，提高活力

VB6促根生長

Vc防組織褐變

VB3

與植物代謝和胚的發(fā)育有關(guān)系

維生素▲當(dāng)前第20頁\共有55頁\編于星期五\22點

氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。因培養(yǎng)基的種類不同，其種類和濃度不同。肌醇：又稱環(huán)己六醇，在糖類的轉(zhuǎn)化中起作用

當(dāng)前第21頁\共有55頁\編于星期五\22點名稱分子量溶解性質(zhì)性質(zhì)蔗糖342.30溶于水、乙醇無變旋現(xiàn)象山梨糖180.16溶于水甜味與蔗糖相似葡萄糖180.16溶于水有變旋現(xiàn)象，以游離態(tài)或磷酯形式存在果糖180.16溶于水、乙醇有變旋現(xiàn)象，甜度高于蔗糖鹽酸硫胺素（VB1）337.28溶于水、乙醇、甘油受高溫影響小，可高溫消毒核黃素（VB2）376.37溶于無水乙醇、微溶于水等電點PH=6.0，堿性溶液中易變質(zhì)，光能加速變質(zhì)鹽酸吡哆素（VB6）205.64溶于水、乙醇對光、空氣、熱穩(wěn)定是轉(zhuǎn)氨酶的輔酶鈷胺素（VB12）1355.42溶于水、乙醇受高溫影響小，可高溫消毒，參與絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼徇^程煙酸（VPP）123.11極易溶于水、乙醇對空氣、光、熱、PH值穩(wěn)定生物素（VH）244.31溶于水、乙醇對空氣溫度穩(wěn)定葉酸（VM）441.40易溶于乙酸、NaOH、微溶于水參與生物甲基化作用抗壞血酸（VC）176.12極易溶于水有較強的還原能力，可做抗氧化劑用，參與酪氨酸代謝及色氨酸的羥基化作用肌醇180.16易溶于水植物中廣泛存在，可能與IAA的代謝有關(guān)常見糖和維生素及其主要性質(zhì)當(dāng)前第22頁\共有55頁\編于星期五\22點椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量10－20%，使用注意莖尖大小香蕉泥：用量150－200ml/L，應(yīng)用在蘭花組培馬鈴薯汁液：用量150－200g/L，使苗壯水解酪蛋白：濃度100－200mg/L，應(yīng)用在微莖尖培養(yǎng)天然復(fù)合物▲當(dāng)前第23頁\共有55頁\編于星期五\22點

自然界中，植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、生長、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實、成熟、脫落、衰老和休眠、萌發(fā)等許多生理生化活動。

在培養(yǎng)基中，其各種成分對培養(yǎng)物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類、濃度、以及配比都會顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的分化，胚狀體的形成等。通常，不同植物，或不同品種，甚至同一植物的不同位置對激素的要求有很大的變化，這主要取決于植物的內(nèi)源激素水平。組織培養(yǎng)中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）三、激素當(dāng)前第24頁\共有55頁\編于星期五\22點（一）、激素的種類：1、生長素類：在自然界中，生長素影響莖和節(jié)間的伸長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落和生根等現(xiàn)象

在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，誘導(dǎo)愈傷組織）

當(dāng)前第25頁\共有55頁\編于星期五\22點

組織培養(yǎng)中常用的生長素：

1二氯苯氧乙酸（2，4－D）

2萘乙酸（NAA）3吲哚乙酸（IAA）

4吲哚－－3－丁酸（IBA）NAA、IAA、IBA被廣泛用于生根，2，4－D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長。

IAA容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保存時間不要太久。

溶解方法：1MNaOH或95％酒精，以前者為好保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存當(dāng)前第26頁\共有55頁\編于星期五\22點2、細(xì)胞分裂素自然界中，細(xì)胞分裂素影響細(xì)胞分裂，頂端優(yōu)勢的變化和莖的分化等

組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分類素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。細(xì)胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長，細(xì)胞分化和器官形成。常用的細(xì)胞分裂素有：6－芐氨基嘌呤（6－BA）

激動素（6-糠氨基嘌呤、KT）

玉米素（ZT）

噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）

溶解方法：1MHCL

保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存當(dāng)前第27頁\共有55頁\編于星期五\22點3、赤霉素由日本人黑澤1926年發(fā)現(xiàn)。自然界中，赤霉素能夠打破休眠、促進(jìn)果實成長等效果。雖然已經(jīng)用于頂端分生組織的培養(yǎng)和維管分化的研究，但在培養(yǎng)基中很少添加，因為它的作用往往是負(fù)面的。雖然也有赤霉素能刺激不定胚發(fā)育成正常小植株的報道，但在使用中仍需慎重，不可輕易添加。赤霉素有20多種，其中在組織培養(yǎng)中最常用的是GA3。在組織培養(yǎng)中與生長素和細(xì)胞分裂素相比，赤霉素不太常用，據(jù)報道赤霉素能刺激不定胚正常發(fā)育成小植株溶解方法：95％酒精保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解

滅菌：高溫易分解，要過濾滅菌當(dāng)前第28頁\共有55頁\編于星期五\22點4、脫落酸在自然界中，脫落酸能阻礙發(fā)育、促進(jìn)老化、形成休眠芽等作用。

經(jīng)試驗表明，脫落酸有利于胚性愈傷組織形成正常不定芽。

材料的試管保存，加上脫落酸能抑制生長，使繼代培養(yǎng)時間延長。溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。配成一定濃度后，冰箱冷藏保存當(dāng)前第29頁\共有55頁\編于星期五\22點（二）、常見培養(yǎng)基中植物激素配方類型激素配方再生方式及用途1.無植物激素誘導(dǎo)生根、無性胚、愈傷組織形成2.單加生長素誘導(dǎo)生根、愈傷組織、無性胚、不定芽3.單加細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖、愈傷組織形成4.高生長素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)芽、原球莖增殖、愈傷組織形成5.低生長素高細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)叢芽、愈傷組織形成6.低生長素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖7.等量生長素與細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)側(cè)芽增殖8.加生長抑制劑（多效唑、矮壯素等）壯苗、延緩生長、利于試管苗保存9.加GA3打破種子、芽休眠，促進(jìn)伸長生長當(dāng)前第30頁\共有55頁\編于星期五\22點名稱分子量溶解性質(zhì)主要作用吲哚乙酸（IAA）175.19易溶于熱水、乙醇、乙醚、丙酮促進(jìn)細(xì)胞的延伸生長和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松馳，也可用于誘導(dǎo)生根吲哚丁酸(IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚稀堿、稀酸液為生根刺激劑

a-萘乙酸(NAA)186.20易溶于熱水、丙酮、醚、乙酸、稀堿液促進(jìn)細(xì)胞生長，刺激生根2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)221.04易溶于醇、丙酮、乙醇、稀堿液促進(jìn)愈傷組織形成赤霉酸(GA3)346.38易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氫鈉和醋酸鈉的水溶液，其鈉促進(jìn)莖、葉伸長生長，打破休眠（三）、常見生長調(diào)節(jié)劑及主要性能一覽表當(dāng)前第31頁\共有55頁\編于星期五\22點（四）、常見生長調(diào)節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升的換微摩爾/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.20320.18620.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.40640.37240.44210.43040.45050.40540.43800.44040.692730.52550.60940.55860.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.70070.81280.74480.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.01600.93101.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.21921.11721.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.42241.30341.54731.50651.57681.41891.53301.54142.424681.40141.62561.48961.76831.72171.80211.62161.75201.76162.771091.57661.82881.67581.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173當(dāng)前第32頁\共有55頁\編于星期五\22點四、培養(yǎng)體支持材料1.瓊脂用量7－10g/L（0.7%-1%）注意：1若濃度過高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)就難于擴散到培養(yǎng)的組織中。

2當(dāng)進(jìn)行營養(yǎng)需要研究時，應(yīng)注意不要使用瓊脂，因為市場供應(yīng)所有瓊脂含有雜質(zhì)，特別是含有Ca,Mg和微量元素。2.其它

卡拉膠、玻璃纖維、濾紙橋、海綿等▲當(dāng)前第33頁\共有55頁\編于星期五\22點五、輔助性物質(zhì)1.抗生素2.抗氧化物3.活性炭▲當(dāng)前第34頁\共有55頁\編于星期五\22點

抗生素1.常用種類：青霉素鏈霉素慶大霉素等2.用量：5%－20%3.作用：防止由外植體內(nèi)生菌造成的污染。4過濾滅菌

▲當(dāng)前第35頁\共有55頁\編于星期五\22點

抗氧化物

常用抗氧化劑及使用：

半胱氨酸VC（50－200mg/L液洗滌外植體傷口表面）?；钚蕴?/p>

1.作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進(jìn)新梢增殖（濃度0.1－0.2%）；促進(jìn)生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。2.常用濃度：0.5－10g/L3.活性炭的作用

①對生長的抑制：其吸附了植物激素②對生長的刺激：其吸附了有抑制作用的物質(zhì)▲當(dāng)前第36頁\共有55頁\編于星期五\22點

第二節(jié)培養(yǎng)基配制一、母液配制與保存二、培養(yǎng)基配制當(dāng)前第37頁\共有55頁\編于星期五\22點(一)母液配制流程圖

稱量

母液分裝確定培養(yǎng)基

溶解

定容

貼標(biāo)簽保存于冰箱一、母液配制(以MS為例)當(dāng)前第38頁\共有55頁\編于星期五\22點

稱量藥品

天平預(yù)置全顯示清零稱藥當(dāng)前第39頁\共有55頁\編于星期五\22點(二)母液配制要求：1.母液濃縮倍數(shù)：10-100，大量元素10；微量元素、鐵鹽100；有機物50；2.選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化學(xué)純試劑3.防止沉淀4.激素母液濃度：1mg/ml,1次配成50或100ml5.激素溶解：IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容；

NAA先溶于熱水或95%酒精再加水；2，4-D先溶于1MNaOH再加水；

KT、BA先溶于1MHCl再加水。

當(dāng)前第40頁\共有55頁\編于星期五\22點為什么要配制母液？1）方便2）準(zhǔn)確（有些成分量太?。?）母液要分類配，否則有些成分混合一起會產(chǎn)生沉淀以MS培養(yǎng)基為例：當(dāng)前第41頁\共有55頁\編于星期五\22點MS培養(yǎng)基母液的配制當(dāng)前第42頁\共有55頁\編于星期五\22點母液保存：在冰箱內(nèi)

低溫保存當(dāng)前第43頁\共有55頁\編于星期五\22點二、培養(yǎng)基配制移母液調(diào)PH值培養(yǎng)基熬制滅菌稱取蔗糖、瓊脂扎口定容分裝二次定容接種確定配方當(dāng)前第44頁\共有55頁\編于星期五\22點

大量元素母液

微量元素母液

鐵鹽母液

有機物母液

取100ml取10ml取10ml取10ml注：MS培養(yǎng)基配制容量瓶要求：一次性移取，不能吸進(jìn)吸氣球里，數(shù)量看準(zhǔn)，不滴不漏，吹凈為度。移母液當(dāng)前第45頁\共有55頁\編于星期五\22點用自來水定容至1升定容：當(dāng)前第46頁\共有55頁\編于星期五\22點稱取蔗糖、瓊脂用自來水定容到1升取蔗糖25－30g，瓊脂7－8g。當(dāng)前第47頁\共有55頁\編于星期五\22點培養(yǎng)基熬制：3.將容量瓶中剩余的液體一并倒入鋁鍋中，搖晃使均勻。1.將定容好的培養(yǎng)液取1/3倒入鋁鍋中，同時加入稱好的蔗糖和瓊脂，邊煮邊攪拌，防止糊底。2.用旺火煮開，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。當(dāng)前第48頁\共有55頁\編于星期五\22點用0.1MNaOH或HCl調(diào)PH值為6.0。調(diào)PH