色氨酸代謝產物對肝癌細胞

色氨酸代謝產物對肝癌細胞第一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一立論依據(jù)

一研究意義

（1）原發(fā)性肝細胞癌（HCC）是我國常見惡性腫瘤之一，在消化道腫瘤中，其發(fā)病率僅次于胃癌。目前肝癌的治療，除手術治療外，化療、放療、生物和免疫治療等多種治療措施的綜合運用，為提高患者生存率起到了積極的作用。但是至今，并沒有找到根治肝癌的有效方法。第二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一(2)自

Tayor等提出IFN-γ對腫瘤生長的抑制作用是其誘導色氨酸代謝所致的觀點后，與色氨酸分解代謝有關的酶——吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）和腫瘤的關系開始倍受關注。第三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一

近期的研究發(fā)現(xiàn)，在不同類型的腫瘤中，IDO可以扮演完全不同的角色。

第四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一

在急性髓細胞樣白血病、黑色素瘤等腫瘤中，IDO可以通過抑制T細胞，從而促進腫瘤的生長；而在肝癌等腫瘤中，IDO的存在可以提高機體的抗癌細胞作用,目前這一作用的具體機制尚不十分清楚。第五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一（3）IDO是色氨酸分解代謝的限速酶，對色氨酸沿犬尿酸途徑進行分解起到了重要作用。

IDO在多種組織中有表達，在感染、腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病以及妊娠期間，IDO的活性增強，加速色氨酸的分解。脂多糖（LPS）、IFN-γ等細胞因子能夠誘導巨噬細胞、樹突狀細胞等表達IDO。

第六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一IDO的分子式為：

NH2ONH2OHOIDO為偏脂溶性物質，可溶解于DMSO溶劑中。

第七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一IDO催化反應如下：

色氨酸

IDON-甲酰尿氨酸

甲酰胺酶

L-犬尿素犬尿素3-羥化酶犬尿素酶3-羥基犬尿酸

鄰氨基苯甲酸犬尿素酶

非特異性羥化

羥基氨基苯甲酸

氧化酶

喹啉酸第八頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一二國內外研究現(xiàn)狀：

IshioT等在體外培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，外周單核細胞加入肝癌細胞株HepG2或PLC/PRF/5共同培養(yǎng)后，可顯著誘導單核細胞中IDOmRNA的表達。外周單核細胞抗肝癌細胞的細胞毒性作用正好與IDOmRNA的表達水平成正比，加入IDO的抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）后可以降低細胞毒性作用。IDO陽性的肝細胞癌病人在肝切除術后，無復發(fā)生存率高于IDO陰性的患者。

第九頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一二國內外研究現(xiàn)狀：KaiS等證明IDO可以增強NK細胞殺傷K562細胞(慢性髓性白血病細胞系)和HepG2細胞的功能。給與1-MT可以降低老鼠NK細胞毒素的活性。

第十頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一二國內外研究現(xiàn)狀：

GuidoFrumento等證明L-犬尿素、鄰吡啶甲酸和喹啉酸等色氨酸代謝產物可以抑制某些淋巴細胞的增殖。此效應在色氨酸缺乏時更為明顯。

DariuszPawlak等發(fā)現(xiàn)喹啉酸在1000μM/L濃度水平上可以降低HepG2細胞的活性。第十一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一二國內外研究現(xiàn)狀：

總之，IDO抗肝癌細胞的作用機制尚處于摸索階段，還有許多值得研究的地方。本課題將主要研究色氨酸在IDO催化下分解生成的幾種代謝產物對肝癌細胞的生長和凋亡有何影響。

第十二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一研究方案

一研究目的

觀察色氨酸經IDO催化后分解生成的各種代謝產物的量及其代謝產物對肝癌細胞的生長及凋亡的影響，為臨床治療肝癌提供新思路。第十三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一二研究內容高效液相色譜法測定色氨酸代謝產物的量。肝癌細胞的培養(yǎng)。

MTT法測定代謝產物對HepG2細胞的增值的抑制作用及色氨酸缺乏對這一作用的影響。流式細胞術觀察代謝產物對肝癌細胞細胞周期的影響。

第十四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一三擬解決的關鍵問題

1

HepG2細胞的培養(yǎng)

2

從細胞水平來驗證色氨酸的代謝產物對肝癌細胞是否有抑制增殖、周期阻滯、誘導凋亡的作用。

3

各代謝產物濃度范圍及作用時間的選定均為本試驗的技術關鍵

4利用高效液相色譜法對色氨酸的代謝產物進行定量分析

第十五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一四技術路線(第一步）

。

HepG2細胞株

體外培養(yǎng)

細胞濃度達到104/ml

分0.1,1,10，100，1000μM/L濃度加入代謝產物

12h,24h,36h,48h后分別檢測

MTT法

HepG2細胞抑制率

統(tǒng)計學分析

第十六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一四技術路線（第二步）。

HepG2細胞株

體外培養(yǎng)

細胞濃度達到104/ml

分0.5,5,50，500，5000μM/L濃度加入IDO

12h,24h,36h,48h后分別檢測

MTT法

HPLC法

HepG2細胞抑制率各代謝產物的量

統(tǒng)計學分析.

第十七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一四技術路線（第三步）

HepG2細胞株

體外培養(yǎng)

細胞濃度達到104/ml

根據(jù)統(tǒng)計學分析結果加藥，作用一定時間離心沉淀后收集細胞調整細胞濃度為5*106/ml

流式細胞術細胞周期的變化分析結果第十八頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一六

實驗方案

1

細胞培養(yǎng)：HepG2細胞株在DMEM培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。

2

加藥：將培養(yǎng)好的HepG2細胞進行胰酶消化，制成104/ml單細胞懸液，置于反應板內，同時加藥

第十九頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一

(1)選定三種代謝產物（L-犬尿素、3-羥基犬尿酸、喹啉酸）進行試驗。

色氨酸充足的條件下（30μM/L）,將每種代謝產物分（0.1，1,10，100，1000μM/L）

5個濃度梯度，(12h,24h,36h,48h)4個反應時間，用MTT法測細胞抑制率。繪制時間關系曲線。

另設色氨酸空白組為對照組

第二十頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一

(2)色氨酸充足的條件下（30μM/L）加入IDO，分（0.5，5,50，500，5000μM/L）

5個濃度梯度(12h,24h,36h,48h)4個反應時間，測細胞抑制率。

并用高效液相色譜法（HPLC）測出三種代謝產物（L-犬尿素、3-羥基犬尿酸、喹啉酸）生成的量。

第二十一頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一

3流式細胞術測定細胞周期：選取某個代謝產物最佳反應濃度和反應時間離心收集細胞，然后調整細胞為5×106/ml，處理后24h內上機分析。

第二十二頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一

4統(tǒng)計學分析：統(tǒng)計描述：均數(shù)±標準差表示，析因設計的方差分析，樣本之間比較用SNK-Q檢驗和t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件。第二十三頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一本課題的創(chuàng)新之處

首次將色氨酸在IDO的催化下分解生成的代謝產物單獨作用于HepG2肝癌細胞株，探討IDO抗肝癌細胞的作用機理，進一步研究其對肝癌的潛在治療價值，并借此尋找肝癌治療的新途徑。第二十四頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一研究計劃及預測進展

2007年3月底之前：在導師的指導下，查閱國內外文獻資料，反復論證該課題的可行性、科學性、創(chuàng)新性；全面了解及掌握所需要的試劑等。

2007年4月開始進行預實驗，及時解決碰到的具體問題，并撰寫綜述。

2007年6月后開始正式實驗，做好實驗紀錄。

2007年10月爭取完成實驗。

2007年11月后整理實驗紀錄，做統(tǒng)計學處理，撰寫科研論文。

第二十五頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一預期研究成果

預計試驗結果為色氨酸代謝產物對HepG2細胞有抑制增殖,調節(jié)細胞周期的作用,該作用隨藥物濃度和時間的增加而增強。色氨酸代謝產物有誘導細胞凋亡的作用。色氨酸代謝產物在肝癌治療上有潛在價值。第二十六頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一

在充分的理論，成熟的實驗條件，認真仔細的工作之后，相信能得到滿意的結果。即使結果可能不盡人意，也會給以后的研究工作以寶貴的啟示。第二十七頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一研究基礎

一學術條件：

我院消化科有自己的實驗室及科研經驗豐富的博士生和碩士生導師進行指導。上幾屆研究生和導師王琦教授在肝癌有關方面作了大量的基礎性研究工作，積累了豐富的理論知識和實踐經驗。第二十八頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一二實驗條件

我院實驗室和山西醫(yī)科大學實驗室具備專業(yè)的技術人員和所需的各種儀器設備，具有多年的細胞培養(yǎng)經驗，色譜法、MTT法、流式細胞術均已成熟，可以確保實驗順利完成。

三所需經費已基本落實。第二十九頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一經費預算

支出科目

金額（萬元）

計算根據(jù)及理由

1．合計

0．752．科研業(yè)務費0．05文獻檢索打印論文裝訂3．實驗材料費0．40細胞培養(yǎng)試劑4．儀器設備費0．10實驗室耗材光鏡電鏡5．協(xié)作費0．10液相色譜分析流式細胞術檢測費用等6．研究組織實施費0．10論文交流第三十頁，共三十一頁，編輯于2023年，星期一主要參考文獻：

1.IshioT,GotoS,TaharaK,etal.Immunoactivativeroleofindoleamine2,3-dioxygenaseinhumanhepatocellularcarcinoma[J]JournalofGastroenterologyandHepatology2004Vol19,319-326

2.KaiS,GotoS,TaharaK,etal.Inhibitionofindoleamine2,3-dioxygenasesuppressesNKcellactivityandacce