熒光PCR原理及應用

熒光PCR原理及應用第一頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一

公司在首家通過國際ISO14001環(huán)境論證的深圳高新技術園區(qū)內擁有近2000m2的GMP標準生產廠房，其中包括嚴格按GMP要求建立的450m2的潔凈車間及其他輔助車間，是目前國內第一家通過體外診斷試劑GMP認證的廠家。GMP標準廠房（GMP---藥品生產質量管理規(guī)范）第二頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一產品概述第三頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一乙肝病毒(HBV)核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒人類免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒丙肝病毒(HCV)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒結核桿菌(TB)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒沙眼衣原體和淋球菌(CT&NG)核酸擴增(PCR)熒光雙檢試劑盒已獲得新藥證書的產品第四頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一TORCH計劃中的產品人巨細胞病毒(HCMV)核酸擴增(PCR)熒光定量檢測試劑盒人乳頭瘤病毒(HPV6/11;16/18)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒人單純皰疹病毒(HSV)核酸擴增(PCR)熒光檢試劑盒弓形蟲(TOX.)核酸擴增(PCR)熒光檢試劑盒風疹(RUB.)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒其他產品解脲支原體(UU)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒乙肝病毒(HBV)YMDD突變核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒待申報產品第五頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一幽門螺旋桿菌(HP)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒肺炎支原體(MP)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒EB病毒(EBV)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒梅毒(TP)核酸擴增(PCR)熒光檢試劑盒-地中海貧血(MA)核酸擴增(PCR)熒光檢測試劑盒苯丙酮尿癥(PKU)核酸擴增(PCR)熒光檢試劑盒開發(fā)研制中的新產品第六頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一新藥試生產轉

正式生產

批件

乙型肝炎病毒（HBV）核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒

國藥準字S20020033第七頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一PCR基礎第八頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一PCR---DNA體外復制第九頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一PCR——信號放大第十頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一PCR的特點高靈敏度高特異性簡便快捷第十一頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光PCR檢測原理第十二頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光PCR？

熒光標記引物、探針或PCR擴增產物動態(tài)監(jiān)測熒光信號變化第十三頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光染料光能熱能轉移給臨近的分子第十四頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光信號熒光染料直接結合擴增產物SYBRgreenI——特異性結合雙鏈，釋放熒光信號熒光標記引物特異性熒光探針Taqman雙熒光標記探針molecularBeacon熒光標記探針熒光標記雜交雙探針第十五頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一FRET？

當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一熒光基團的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為熒光共振能量轉移(FRET),實際相當于將短波長熒光基團釋放的熒光屏蔽。第十六頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一Taqman？特異性熒光雙標記探針Taq酶5’→3’外切酶活性第十七頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一Molecularbeacon？第十八頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光標記雜交雙探針變性退火延伸第十九頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一CT值—樣本擴增曲線與閾值線交叉點的循環(huán)數第二十頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一PCR熒光試劑標準品擴增曲線（儀器：Bio-radiCycler）1x108拷貝/ml1x107拷貝/ml1x106拷貝/ml1x105拷貝/ml1x104拷貝/ml第二十一頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一定量原理和方法原理：每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。外標法：將幾個已知拷貝數的純化的目的基因標準品進行FQ-PCR擴增，繪制熒光定量標準曲線。內標法：將已知濃度的內標基因加到各標本中，與標本一起經歷核酸提取、加樣、逆轉錄、PCR擴增及信號檢測的全過程，比較內標最后的實測值與已知值，以檢驗標本中是否存在抑制PCR的因素，也可對樣品的拷貝數加以校正。

第二十二頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光PCR定量的原理-外標法第二十三頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一標準曲線→定量第二十四頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一對數期分析與終點分析的比較第二十五頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光PCR重現性第二十六頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光PCR特點靈敏度高特異性強全封閉PCR過程，無需后處理采用dUTP—UNG酶的防污染系統(tǒng)，有效降低污染機會即時反映擴增過程，摒棄終點數據，更適用于定量定量范圍寬，可達到10個數量級，無須稀釋樣品可實現一管多檢儀器自動分析，更快獲得結果第二十七頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一競爭性熒光內標(IC)定量PCR技術第二十八頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一競爭性熒光內標(IC)什么是IC?

Internalcontrol簡稱IC，通常是指與靶序列十分相似的一段DNA序列，兩者在相同的條件下可被同一對引物擴增，具有相同的擴增效率；區(qū)別在于兩者的探針結合區(qū)，可分別被不同序列的探針識別，通過探針的不同熒光標記實現區(qū)分。IC的作用

監(jiān)控PCR反應，避免樣本抑制物、DNA（RNA）提取過程的丟失、誤操作等造成的假陰性結果；并對以上原因造成的定量誤差進行修正。第二十九頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一內標工作原理圖第三十頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光PCR

在臨床診斷上的應用第三十一頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一熒光定量PCR的臨床應用早期診斷病情評估和預后判斷抗病毒藥物療效的觀察、指導新藥驗證輸血源的篩選母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷第三十二頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一疾病的早期診斷免疫學診斷主要是抗原抗體反應，應用于臨床通常在體內產生抗體以后，而許多病原體的免疫學檢測存在較長的“窗口期”，比如HCV的“窗口期”平均長達70天，不利于對疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。第三十三頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一HBVDNA與血清免疫學的關系HBVDNA與HBsAg/HBsAb的關系

HBsAg（+）HBVDNA（-）：病毒基因的整合，此時只能表達HBsAg，而沒有DNA的復制；操作失誤；PCR試劑的靈敏度不夠。

HBsAg（-）HBVDNA（+）：“窗口期”；HBsAg的水平過低無法檢出，或者HBsAg確已消失但病毒仍處于低水平復制狀態(tài)；暴發(fā)性乙肝以合成HBcAg為主，很少或不合成HBsAg；S區(qū)基因發(fā)生逃避免疫變異造成HBsAg陰性而HBVDNA陽性；血清亞型的漏檢；老年人HBsAg檢出率低于5%，

HBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有報道HBsAb出現后血清內仍有DNA復制，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb與HBVDNA同時陽性，但通常HBVDNA檢出率逐步下降HBVDNA與HBeAg/HBeAb的關系

HBeAg陽性與HBVDNA有顯著相關。HBeAg陰轉往往是HBV病毒血癥的消失或炎癥的靜息。通常認為HBeAg轉陰繼而出現HBe抗體的轉化為乙型慢性肝炎好轉穩(wěn)定的標志。事實上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg陰轉并不意味著炎癥活動的停止。HBeAg陰性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表達為主，感染起始即為HBeAg陰性。第三十四頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一病毒感染窗口期的NAT檢測第三十五頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一Lametal-Hepatol26:226,1997對病毒感染的藥物治療中，免疫學指標的變化通常比較滯后出現，且受個體差異影響較大，從而對臨床判斷難以及時提供直接證據；而熒光定量PCR檢測可直接反映病原體滴度是否受藥物治療發(fā)生變化，從而為藥物療效觀察提供直接依據，以供治療方案參考。同時對不同治療時間的用藥劑量和用藥時間提供依據?？共《舅幬锆熜У挠^察、指導第三十六頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一如HBV：根據《2000年拉米夫定臨床應用指導意見》，中國慢性乙肝病人治療的主要目的就是降低血清HBVDNA，誘導HBeAg血清轉換等。HIV:

目前用于治療艾滋病的藥物中主要就是抗病毒類藥物，因此，HIVRNA滴度的定量測定與抗HIV藥物治療及療效有著直接的關系。第三十七頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一乙型肝炎患者抗病毒藥物治療前后的HBV滴度比較第三十八頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一新藥驗證

任何一種抗病毒藥物，以免疫標志物來評價其療效均不夠敏感和及時，若以病毒復制的被抑制程度，即病毒基因水平的高低和動態(tài)變化來評價療效，則較為直接和理想。第三十九頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一拉米夫定抑制血清HBVDNA0-20-40-60-80-100治療周數拉米夫定安慰劑血清HBVDNA;中位%變化0481216202428323640444852n=192n=404n=171n=359III期臨床研究的綜合數據第四十頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一病情評估和預后判斷

通過定量檢測病毒滴度可以間接評估受侵器官或組織的炎癥發(fā)生程度以及是否發(fā)生病變；長時間機體病毒高水平的患者尤其是慢性病患者往往預后不好。因此對病原體的定量PCR檢測對病情和預后評估均有參考意義。第四十一頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一遺傳疾病的早期診斷熒光PCR可實現對點突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測。對產前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，有利于優(yōu)生優(yōu)育，提高人口素質。第四十二頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一母嬰傳播的監(jiān)控

熒光PCR可對病原體的母嬰傳播進行有效的監(jiān)控，為確定宮內感染、圍產期感染或哺乳期感染等提供依據，為母嬰傳播的阻斷等提供參考。第四十三頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一腫瘤的診斷熒光PCR的作用：可對原癌基因的突變和易位等作出檢測?？蓪υ┗虻膍RNA進行定量分析。有利于腫瘤的早期診斷，甚至癌前診斷。探索癌變發(fā)生機理的研究提供參考。區(qū)別腫瘤的良性和惡性以及炎癥反應。第四十四頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一結核病及性病等核酸檢測意義病原體的檢測在臨床上通常采用鏡檢、培養(yǎng)等方法。鏡檢法操作簡便，易造成假陽性結果，同時靈敏度較低。培養(yǎng)方法要求高，耗時，不利于臨床上的及時診斷和用藥。熒光PCR方法具高靈敏度，速度快。不能培養(yǎng)PCR是唯一確診手段（例如HPV）第四十五頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一PCR污染及預防對策

第四十六頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一污染原因

標本間交叉污染PCR試劑的污染PCR擴增產物污染氣溶膠污染實驗室中克隆質粒的污染第四十七頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一污染的監(jiān)測

對照試驗

試劑空白對照

陽性對照

陰性對照

重復性試驗

第四十八頁，共五十五頁，編輯于2023年，星期一PCR防污染措施實驗環(huán)境的控制

PCR應實行嚴格的分區(qū)操作：前準備區(qū)；樣本處理區(qū)，其中DNA和RNA的處理也應該分開；擴增區(qū)。各區(qū)專區(qū)使用，并盡量使用一次性消耗品，高壓消毒，實驗器械和臺面均應進行定期消毒等。2．避免PCR后處理

熒光PCR不同于其他的PCR方法，無須對PCR擴增產物進行任何的檢測，實際就是對PCR污染的有力預防。3．dUTP防污染系統(tǒng)

反應體系中常規(guī)的dNTPS中的dTTP替換為dUTP，在擴增過程中dU取代dT的位置摻入到PCR產物中，在尿嘧啶糖基酶（UNG）的作用下，發(fā)生U的糖苷鍵的水解，經高溫處理后DNA鏈斷裂成碎片，從而無法成為下一輪的PCR的模板