2019神經生物學試驗講義

最新資料推薦 2019神經生物學實驗講義徐州醫(yī)科大學神經生物學實驗講義實驗一鼠腦灌注固定和取材一、原理固定是用人為的方法盡可能使組織細胞的形態(tài)結構和化學成分保持生活狀態(tài)，防止組織細胞的溶解和腐敗，并保持其原來的細微結構及原位保持生物活性物質的活性；能使細胞內蛋白質、脂肪、糖、等各種成分沉淀而凝固，盡量保持它原有的結構；使細胞內的成分產生不同的折射率，造成光學上的差異，使得原本在生活情況下看不清楚的結構，變得清晰可見；使得組織細胞各部經媒染作用容易染色；經過固定，使組織硬化，以利于以后切片時切薄片。體循環(huán)：左心室升主動脈主動脈的各級分支毛細血管各級靜脈上下腔靜脈右心房，完成體循環(huán)的整個循環(huán)。二、實驗步驟1、正常Sprague-Dawley大鼠，150?250g,或昆明小鼠，20g左右，雌雄不拘；2、動物麻醉后，用左手持鑷子夾起腹部皮膚，右手持剪刀自胸骨劍突下腹部剪一小口，由此沿腹中線和胸骨劍突中線向上將皮膚剪至下頜，分離皮下組織，將皮膚翻向兩側，再沿腹中線和胸骨中線向上剪開胸骨，沿膈肌向兩側剪開，并用止血鉗將胸骨和胸部的皮膚鉗緊，將止血鉗翻向外側以充分暴露心臟，小心用鑷子將心包膜打開；3、將灌注針（大鼠12#,小鼠7#）插入左心室并送至升主動脈內，用止血鉗把灌注針固定在心臟上，打開灌注泵開關，同時剪開右心耳，使血液排出。1/10先快速灌注0.9%NaCl(大鼠80-120ml,小鼠30ml),至肝臟逐漸變白色或右心耳流出清亮液體為止，再灌注4℃預冷的固定液(大鼠200ml，小鼠50ml，根據(jù)動物體重定量)，其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30分鐘內灌注完；4、固定液進入血管后，大鼠四肢和尾巴開始抽動，表明灌注液進入大鼠大腦，待抽動完全停止，全身組織器官變硬后即可停止灌注；5、斷頭后，剝離顱骨、剪斷腦神經、離斷腦于脊髓，取出整腦。6、后固定(post-fixed)：剝出鼠腦后，切取含目的區(qū)域的腦段，放入相同固定液4?12h,4℃。附附4%多聚甲醛的配制：40g多聚甲醛用0.1mol/LPB(pH7.4)溶解后定容至1L,過濾后置于4℃保存。實驗二大鼠腦立體定位一、目的和應用腦立體定位儀是利用顱骨外面的標志或其它參考點所規(guī)定的三維坐標系統(tǒng)，來確定皮層下某些神經結構的位置。它是神經解剖、神經生理、神經藥理和神經外科等領域內的重要研究設備，以便在非直視暴露下對其進行定向的刺激、破壞、注射藥物、引導電位等研究?？捎糜谂两鹕喜　d癇、腦內腫瘤動物模型建立，還可用于學習記憶，腦內神經干細胞移植，腦缺血等研究。二、步驟1、實驗動物的選擇:最新資料推薦正常Sprague-Dawley大鼠，150?250g，雌雄不拘；2、麻醉（anesthetized）：10%水合氯醛0.35ml/100g,i.p.；3、定位:用耳棒和上頜固定器將大鼠頭部固定在動物腦立體定位儀上（固定好的標準：鼻對正中，頭部不動，提尾不掉），調門齒桿的高度為-3.3mm,固定好門齒，使前囟點（Bregma）和人字縫尖點（lambda）在同一水平面上；4、碘伏消毒顱頂皮膚，根據(jù)所選區(qū)域切開皮膚，3%雙氧水擦拭骨膜，清晰暴露出前囟點；5、將微量注射器夾持在固定器上，調節(jié)三維旋鈕使其針頭剛好接觸Bregma點，此時讀出三維坐標數(shù)值并記下，此為原點數(shù)值；4、參照PaxinosandWatson（1986）的大鼠腦圖譜，讀出注射部位的三維坐標數(shù)值，在原點坐標三維值基礎上加或減相應的數(shù)值（Bregma值為正就加，為負減；右側加，左側減；深度減），即得到一個最終定位的三維坐標值；5、微量注射器吸入藥液，調節(jié)前后和左右的旋鈕使其針頭剛好接觸到顱骨，并在此點做一標記，在此鉆孔后，將注射器針頭緩慢插入相應的深度；6、緩慢注射液體，注射速度2l/5min,注射后留針10?15min；7、緩慢退針后，縫合皮膚，待其蘇醒后放入籠中飼養(yǎng)；8、根據(jù)實驗需要，決定動物存活時間。9、本實驗中，若需要查驗注射部位是否正確，可以在退針后取下動物，將其斷頭后，小心地剝離出鼠腦，順著注射點將大腦切開，3/10

觀察注射部位是否正確。實驗三冰凍切片及貼片一、組織塊浸糖目的：冰凍時，組織中水分易形成冰晶，對組織結構有影響，故將組織浸入20%-30%的糖液中是為了置換出組織中大部分水分，使其在切片時盡量少出現(xiàn)冰晶。方法：將鼠腦從后固定液移入15%蔗糖0.1mol/LPB，4℃，過夜；再移入30%蔗糖0.1mol/LPB，4℃，至組織塊沉底。二、冰凍切片將組織塊從蔗糖中取出，用濾紙吸干表面液體。在樣品臺上滴上適量的包埋劑，將組織粘于其上，然后再滴適量包埋劑于組織塊上，直至將整個組織塊完全包裹住。放在切片機速凍臺處，按下PE速凍鍵。調節(jié)好凍臺及箱體溫度；將速凍完成的樣品頭夾在凍臺上，進行鼠腦冰凍連續(xù)冠狀切片，片厚20m。按順序收集切片于盛有0.01mol/LPBS的培養(yǎng)皿內。三、貼片用毛筆將腦片平整貼片于粘附載玻片上，每張載玻片貼三張腦片，自然涼干后，置于切片盒中放20℃保存。一張優(yōu)質的切片要求組織完整，厚薄均勻，無刀痕、皺褶、氣泡，染色時不脫片。附：0.01mol/LPBS（pH7.4）：Na2HPO43.75gNaH2Na2HPO43.75gNaH2最新資料推薦PO40.43gNaClPO40.43gNaCl7.2g 加水定容至 1000ml0.1mol/LPB（pH7.4）：Na2HPO4 28.7g NaH2PO4 2.96g 加水定容至1000ml 15%蔗糖：蔗糖15g加0.1mol/LPB溶解定容至100ml30%蔗糖：蔗糖30g加0.1mol/LPB溶解定容至100ml實驗四尼氏（Nissl）染色一、原理尼氏體（一、原理尼氏體（Nisslbody）：是神經細胞的一種特殊結構，具有嗜堿性的特點，易被堿性染料，如焦油紫、亞甲藍、甲苯胺藍及硫堇等將其染為藍色，呈塊狀（形如虎斑）或粒狀，又稱虎斑。尼氏體分布在神經細胞除軸突之外的細胞質中，核周圍顆粒較大，近邊緣處較小而細長。尼氏體可因生理狀態(tài)的改變而變化，在生理情況下尼氏體大而數(shù)量多，反映出神經細胞旺盛的功能狀態(tài)；在神經元受損傷時，神經元的胞體腫脹，細胞核從中央移到胞體邊緣，胞質內尼氏體明顯減少甚至消失，故胞質著色淺淡。電鏡下可見尼氏體由發(fā)達的粗面內質網和游離的核糖核蛋白體構5/10成。二、冰凍切片尼氏染色實驗步驟1、浸片：切片在PBS液中浸泡2min；2、染色：切片入0.1%焦油紫水溶液，37℃,30?60分鐘；3、漂洗：蒸餾水10sec，洗去浮色，4、分色、脫水、透明：依次移入70%、80%、95%（兩次），每道10$?3移入100%乙醇兩次，每次1min；移入二甲苯兩次，每次5-10min；5、封片：中性樹膠封片。結果：胞漿著色，高倍鏡下可見尼氏小體紫紅色，核仁呈深藍色，背景無色。三、注意事項1、在70%、80%乙醇內分色作用明顯，所需時間應根據(jù)切片性質（冰凍切片或石蠟切片等）、切片厚度、染色深淺等靈活變動，必要時隨時在顯微鏡下檢測分色程度。如分色不夠，可退回70%、80%乙醇；分色過度，可退回水中再移入染液重染。2、應用酒精分色，要迅速，防止過度分色，將組織切片上的顏色全部脫掉。3、透明劑能使材料清凈透明，增加組織折光系數(shù)，使細胞的色度與細胞的重疊不致影響鏡下檢查。常用的透明劑為二甲苯，它折射率是1.494,與載玻片的折射率1.515較為匹配。最新資料推薦止匕外，它能與乙醇、石蠟以及封片用的中性樹膠互溶。但切片浸入前必須脫干凈水分，否則會發(fā)生乳狀混濁。如果二甲苯溶液變得渾濁，一定要更換新液。實驗五、神經髓鞘染色一、原理髓鞘是包裹在神經軸突外面的管狀鞘，由髓磷脂所構成，其主要成分是類脂質和蛋白質，類脂質含有脂肪、卵磷脂、腦苷酯及膽固醇。在正常髓鞘中，由于磷脂極性基團和親水基團的存在，對水具有親和力，因此水溶性氧化劑可滲入髓鞘，有利于磷脂對染料的攝入。髓鞘染色方法有多種，基于不同的原理，可利用媒染劑、油溶性染料或鉞酸等與類脂質的特殊反應而進行。LuxolFastBlue(LFB，羅克沙爾堅牢藍)屬于銅-酞箸染料(copper-phthalocyaninedye)，具有在乙醇溶液內能與髓鞘磷脂結合的染色特性。LFB染色后髓鞘著色鮮明，是鑒定神經髓鞘比較好的特異性標記物。根據(jù)正常和不同病變時期髓鞘的組織結構特點，通過髓鞘染色來觀察正常和病理情況下髓鞘是否完整，有無變性、壞死及修復情況，對神經組織的病理診斷和研究有實用意義。二、冰凍切片髓鞘染色實驗步驟1、提前1h把LFB染液放在60度烘箱里預熱；2、切片在PBS液中浸泡2min；3、洗好的切片依次浸入70%、80%、90%、95%乙醇，每個濃度2min；4、將切片7/10放入預熱好的LFB染液，60度烘箱中孵育1.5?2h；5、將染色缸取出冷卻到室溫后，切片依次浸入95%乙醇也皿、雙蒸水10sec,飽和Li2CO3、70%乙醇、雙蒸水10sec。（飽和Li2CO3和70%乙醇起分色作用，時間根據(jù)分化的程度而定，這兩步之間可以反復，同時用顯微鏡觀察分色情況）；6、待切片自然晾干后入100%乙醇5min,二甲苯兩道，每道10min，中性樹膠封片，晾干后在顯微鏡下觀察拍照。參考結果：（2019級神經生物郭瑞供圖）實驗六七免疫熒光（雙標）染色技術一、原理免疫熒光技術一、原理免疫熒光技術是最早建立的一種免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用比較廣，但是標本不易保存，因為熒光素易降解?？贵w與抗原結合方式主要有兩種：①直接法：用帶有標記物的抗體與標本中的相應抗原直接結合，操作方法簡最新資料推薦便，特異性高，但敏感性較差，此法可用于檢定未知抗原；②間接法：先用未標記的具有特異性的第一抗體與樣品中的相應抗原結合，然后再以標記的第二抗體（第二抗體是用第一抗體作為抗原注入另一動物體內誘導產生的抗體，然后再結合以標記物）與特異性的第一抗體結合，通過這樣的放大作用，使抗原分子上的標記物大大增多，故間接法較直接法的敏感性大為增高，約高5?10倍，故應用更為廣泛。二、冰凍切片免疫熒光雙標步驟1、切片入0.01mol/LPBS（pH7.4）5min,室溫；2、封閉：滴加10%正常山羊血清（0.01mol/LPBS配），室溫，30min；3、滴加混合一抗（兔抗GFAP,1：500,Sigma,小鼠源MCT1,1：200,abcam,用含0.3%TritonX-100的0.01mol/LPBS稀釋），4℃,過夜或37℃,2h；4、0.01mol/LPBS洗切片，5min/次3次，室溫；5、滴加混合的熒光素標記的二抗（Cy-2標記的山羊抗小鼠1：200,Sigma,Cy-3標記的山羊抗兔1：200,Sigma,