金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)與計(jì)數(shù)

金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)與計(jì)數(shù)第一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二概況葡萄球菌屬微球菌科，本菌有19個菌種，從人體上可檢出12個種。葡萄球菌屬主要與皮膚腺體和溫血動物的粘膜相關(guān)系，有些種是人及動物的條件致病菌。金黃色葡萄球菌對人類有致病性，通常被稱為病原性球菌。金黃色葡萄球菌可引起化膿性炎癥，又稱為化膿性球菌。第二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性形態(tài)與染色：金黃色葡萄球菌的典型形態(tài)呈球形，直徑0.4～1.2μm，大小不一，平均直徑約為0.8μm。革蘭氏染色陽性，呈葡萄串狀排列。無鞭毛、無芽胞。在陳舊培養(yǎng)物中，衰老的菌體常轉(zhuǎn)為革蘭氏陰性。第三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二培養(yǎng)特性：易培養(yǎng)，對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基中生長良好。需氧或兼性厭氧。最適生長溫度37°C，最適生長pH7.4。耐鹽性強(qiáng)，在含10～15%的氯化鈉培養(yǎng)基中仍能生長，可用于篩選菌種。在普通營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)18～24ｈ，可形成圓形、表面光滑、不透明的菌落。可產(chǎn)生金黃色色素，色素為脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落內(nèi)，不滲至培養(yǎng)中。第四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二在血平板上可形成明顯透明的溶血環(huán)。為β型溶血?？僧a(chǎn)生卵磷脂，在卵黃高鹽培養(yǎng)基上形成周圍有白色沉淀環(huán)的菌落。大多數(shù)菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅試驗(yàn)、VP試驗(yàn)多為陽性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)。觸酶陽性。第五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二金黃色葡萄球菌的酶金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生血漿凝固酶和耐熱DNA酶。這兩種酶均與金黃色葡萄球菌的致病性有關(guān)。血漿凝固酶：與金黃色葡萄球菌的致病力密切相關(guān)。一般認(rèn)為，血漿凝固陽性的金黃色葡萄球菌菌株有致病力。否則為無致病力的菌株。血漿凝固酶對熱穩(wěn)定，能抵抗60℃30min甚至100℃30min后，仍能保存大部分活性。耐熱DNA酶作為除血漿凝固酶外鑒定金黃色葡萄球菌致病力的指標(biāo)之一。該酶的最適pH為9.0。第六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二金黃色葡萄球菌腸毒素：是金黃色葡萄球菌一種重要的致病物質(zhì)。本菌引起的食物中毒是因?yàn)槭称肺廴玖私瘘S葡萄球菌后，由細(xì)菌產(chǎn)生大量腸毒素而導(dǎo)致的。近年報(bào)導(dǎo)表明，50%以上的金黃色葡萄球菌菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下可產(chǎn)生腸毒素，并且1個菌株能產(chǎn)生兩種或兩種以上的腸毒素。腸毒素是一種可溶性蛋白質(zhì)，由單個無分枝的肽鏈組成。分子量約為3000左右。易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。金黃色葡萄球菌的腸毒素第七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二耐熱，經(jīng)100℃煮沸30min不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響。食物中的腸毒素耐熱性更強(qiáng)，一般烹調(diào)溫度不能將其破壞。218~248℃的油中需30min才能被破壞?？梢鸺毙晕改c炎。根據(jù)腸毒素的血清型，可分A、B、C（C1、C2）、D、E5個型。A型腸毒素引起的食物中毒較多，約占50%左右。其他依次為D、C、B和E型。也有A＋D、A＋B、A＋C、B＋C等。第八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二A型腸毒素毒力較強(qiáng)，攝入1μg即可引起中毒；B型毒力較弱攝入25μg，才引起中毒。一般認(rèn)為引起人中毒的最小劑量是1.0~7.2μg/kg。第九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)第十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二金黃色葡萄球菌的檢測程序檢樣25g(mL)＋225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯36±1℃Baird-Parker平板，血平板涂片染色觀察溶血血漿凝固酶試驗(yàn)報(bào)告血平板18~24h，Baird-Parker平板18~24h或45~48h。BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂小斜面36±1℃18~24h第十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二增菌培養(yǎng)基7.5%氯化鈉肉湯：為葡萄球菌選擇性增菌培養(yǎng)基，因金黃色葡萄球有耐受高鹽的特性，因而能在此增菌液中生長，除某些嗜高鹽的海洋菌外，大多數(shù)細(xì)菌都被增菌液中的高鹽所抑制。胰酪胨大豆肉湯：含氯化鈉達(dá)10%，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氫二鉀和葡萄糖促進(jìn)葡萄球菌的生長。第十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。第十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二增菌與分離培養(yǎng)增菌培養(yǎng)：吸取5mL上述樣品勻液，接種于50mL7.5%氯化鈉肉湯或10%胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴(yán)重時(shí)在10%胰酪胨大豆肉湯內(nèi)呈混濁生長。將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。第十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二分離培養(yǎng)基Baird-Parker瓊脂：培養(yǎng)基中含有卵黃亞碲酸鉀，能抑制大多數(shù)細(xì)菌的繁殖，并能促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長使其產(chǎn)生黑色和暈圈。培養(yǎng)基中的丙酮酸鈉和甘氨酸也能促進(jìn)金黃色葡萄球菌的生長。金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：圓形、光滑凸起、濕潤，直徑約2~3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶而可見無混濁帶和透明圈的非典型菌落。第十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。第十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二金黃色葡萄球菌空白培養(yǎng)基培養(yǎng)基

用途

測試菌株參考培養(yǎng)基控制方法判定標(biāo)準(zhǔn)特性反應(yīng)Baird-Parker生長率金黃色葡萄球菌ATCC6538；金黃色葡萄球菌ATCC25923TSA

定量PR≥0.5黑色/灰色菌落帶透明帶選擇性大腸埃希氏菌ATCC25922或8739-----

定性全部抑制特異性表皮葡萄球菌ATCC12228-----

定性-----黑色/灰色菌落無透明帶第十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二分離培養(yǎng)基血瓊脂：是一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有5%的脫纖維血(羊血或兔血)。用于觀察金黃色葡萄球菌的溶血現(xiàn)象。金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上呈β溶血。金黃色葡萄球菌的菌落形態(tài)：呈金黃色，有時(shí)也呈白色，大而突起，圓形、不透明、表面光滑，周圍有透明的β溶血環(huán)。第十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二金黃色葡萄球菌的重要鑒定-

血漿凝固酶試驗(yàn)

試驗(yàn)原理：致病性的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，附著于細(xì)菌表面，產(chǎn)生凝固。金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶：一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝固酶，為結(jié)合凝固酶；另一種是菌細(xì)胞釋放于培養(yǎng)基中，為游離凝固酶。二者的抗原性不同。第十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二血漿凝固酶試驗(yàn)挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入可疑菌落的BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽性結(jié)果。第二十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。第二十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二結(jié)果報(bào)告如血漿凝固酶試驗(yàn)陽性，可判定為金黃色葡萄球菌。報(bào)告在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。第二十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二影響血漿凝固酶試驗(yàn)的因素血漿：血漿凝固酶試驗(yàn)可選用人血漿或兔血漿。用人血漿出現(xiàn)凝固的時(shí)間短，約93.6%的陽性菌在1h內(nèi)出現(xiàn)凝固。用兔血漿1h內(nèi)出現(xiàn)凝固的陽性菌株僅達(dá)86%，大部分菌株可在6h內(nèi)出現(xiàn)凝固。若被檢菌為陳舊的培養(yǎng)物（超過18~24h），或生長不良，可能造成凝固酶活性低，出現(xiàn)假陰性。第二十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二不能使用甘露醇氯化鈉瓊脂上的菌落做血漿凝固酶的實(shí)驗(yàn)，因所有高鹽培養(yǎng)基都可以抑制A蛋白的產(chǎn)生，造成假陰性結(jié)果。不要用力振搖試管，以免凝塊振碎。實(shí)驗(yàn)必需設(shè)陽性(標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌)、陰性(白色葡萄球菌)、空白(肉湯)對照。玻片法只能檢測結(jié)合凝固酶，而試管法可檢測兩種凝固酶。因此，兩種試驗(yàn)所得結(jié)果可完全不同。玻片法只用于篩選。第二十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二

金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)

第二十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二第一法BairdParker平板法第二法MPN法第三法PetrifilmTM測試片法第二十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二第一法:平板計(jì)數(shù)法第二十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二檢驗(yàn)程序檢樣25g(mL)＋225mL生理鹽水或磷酸鹽緩沖液10倍稀釋選擇三個連續(xù)的適宜濃度的樣品勻液，接種Baird-Parker平板計(jì)數(shù)及血漿酶試驗(yàn)報(bào)告36±1℃45~48h第二十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二樣品的接種、培養(yǎng)與典型菌落的確認(rèn)根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2~3個適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個稀釋度分別吸取1ml，以0.3，0.3，0.4ml接種量，分別加入三塊Baird-Parker平板，用L棒涂布整個平板，(注意不要觸及平板的邊緣)。接種前應(yīng)注意保持平板的干燥(可在20~50℃的培養(yǎng)箱中干燥)，通常情況下涂布后，將平板靜置10min，如樣液不易吸收，可將平板置36±1℃培養(yǎng)1h后，再反轉(zhuǎn)平板，倒置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度與時(shí)間：36℃±1℃，45~48h。典型菌落確認(rèn)：從典型菌落中任選五個菌落（小于五個全選），分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h后進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。第二十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二典型菌落計(jì)數(shù)與計(jì)算公式的應(yīng)用計(jì)數(shù)范圍要求：選擇合計(jì)菌落數(shù)在20~200的平板，計(jì)數(shù)典型菌落。第三十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二公式一的使用范圍：---最低稀釋度平板的菌落小于20cfu，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；---某一稀釋度平板的菌落大于200cfu且有典型菌落，但上一稀釋度平板上沒有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；---某一稀釋度平板的菌落大于200cfu且有典型菌落，且上一稀釋度平板上有典型菌落，其平板上的菌落數(shù)不在20cfu～200cfu之間，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；第三十一頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二公式一T=AB/CdT:樣品中金黃色葡萄球菌落數(shù)；A:某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；B:某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數(shù)；C:某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；

d:某一稀釋度。第三十二頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二公式應(yīng)用例一

公式一：T=AB/CdT=65×4÷5÷0.1=520樣品稀釋度10－110－2典型菌落數(shù)66，646，6用于做血漿凝固酶菌落數(shù)55血漿凝固酶陽性菌落數(shù)44高、低稀釋度平板均有典型菌落，但其中高稀釋度二平板的菌落數(shù)均不在20~200之間，選擇低稀釋度的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。第三十三頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二N=∑T/1.1d∑T：兩個稀釋度平板上確認(rèn)的金黃色葡萄球菌菌落總數(shù)之和；

d：稀釋因子(第一稀釋度)。公式二的使用范圍：平板菌落數(shù)均在20cfu～200cfu之間。公式引用于ISO6888-1:1999(E)公式二第三十四頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二公式應(yīng)用例二

公式二：N=∑T/1.1d

T1=183×3÷5=110T2=21×4÷5=17∑T=T1+T2=110+17=127N=∑T/1.1d=127÷1.1÷0.1=1200樣品稀釋度10－110－2典型菌落數(shù)185，18020，22用于做血漿凝固酶菌落數(shù)55血漿凝固酶陽性菌落數(shù)34所有稀釋度平板合計(jì)菌落數(shù)均在20~200間：第三十五頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二結(jié)果報(bào)告單位：cfu/g或者cfu/mL；若T或者N為0，報(bào)告<1d-1

cfu/mL(g)。第三十六頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二第二法MPN法第三十七頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二MPN檢驗(yàn)程序25g(mL)檢樣+225mL稀釋液，勻質(zhì)10倍系列稀釋選擇3個適宜稀釋度的樣品勻液，吸1mL樣液，每稀釋度各接種3管胰酪胨大豆肉湯，樣品的最高稀釋度，能達(dá)到獲得陰性終點(diǎn)36±1℃45~48h接種Baird-Parker平板血漿凝固酶試驗(yàn)45~48h36±1℃查MPN表報(bào)告結(jié)果第三十八頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二接種和培養(yǎng)根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2~3個適宜稀釋度的的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，每個稀釋度分別吸取1ml接種到胰酪大豆肉湯管，每稀釋度接種3管。36℃±1℃培養(yǎng)45~48h。用接種環(huán)從有細(xì)菌生長的各管中，移取1環(huán)分別接種于Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)45~48h。確認(rèn)典型菌落，并從典型菌落中至少挑取1個菌落做血漿凝固酶試驗(yàn)。第三十九頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二結(jié)果報(bào)告計(jì)算血漿凝固酶試驗(yàn)陽性菌落對應(yīng)的管數(shù)，查MPN檢索表。結(jié)果報(bào)告：MPN/g或MPN/mL第四十頁，共四十六頁，編輯于2023年，星期二注意要點(diǎn)MPN法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品?！皹悠返淖罡呦♂尪?，能達(dá)到獲得陰性終點(diǎn)”的理解：--盡可能避免>