胚胎干細(xì)胞課件

一、概述

基本概念干細(xì)胞分化發(fā)育干細(xì)胞分類干細(xì)胞的特點(diǎn)胚胎性干細(xì)胞類型1干細(xì)胞干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。干細(xì)胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。（一）基本概念2干細(xì)胞功能組織發(fā)生全能干細(xì)胞多能干細(xì)胞專能干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞組織干細(xì)胞（二）干細(xì)胞分類

3全能干細(xì)胞Totipotentstemcells

具有無限分化潛能的細(xì)胞?？梢苑只扇梭w的各種細(xì)胞，這些細(xì)胞構(gòu)成人體的各種組織器官。八細(xì)胞階段4多能干細(xì)胞Multipotentstemcells

具有可分化出一種器官的多種組織潛能的干細(xì)胞，即能夠形成兩種或兩種以上類型細(xì)胞的干細(xì)胞。具有自我增殖和分化兩種功能。

骨髓造血干細(xì)胞就是典型的多能干細(xì)胞，移植造血干細(xì)胞治療白血病、再生障礙性貧血等血液疾病。5專能干細(xì)胞

多能干細(xì)胞進(jìn)一步分化成專能干細(xì)胞，只能分化成某一類型的細(xì)胞。又稱單能干細(xì)胞。如表皮干細(xì)胞只能分化產(chǎn)生角化表皮細(xì)胞。6胚胎干細(xì)胞Embryonicstem(ES)Cells

來自早期胚胎、原始生殖細(xì)胞或畸胎瘤組織等源于胚胎的干細(xì)胞，其基本特性是具有穩(wěn)定地在體外自我更新、并穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育全能或多能性、能分化為屬于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層范疇的各種類型分化細(xì)胞，甚至參與個(gè)體發(fā)育，又稱為萬能細(xì)胞(Multipotentstemcells)。7組織干細(xì)胞Tissue-specificstemcell

指分布在成年生物體組織中負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織細(xì)胞功能的干細(xì)胞。又稱為成體干細(xì)胞(Adultstemcells)。8（三）干細(xì)胞分化發(fā)育干細(xì)胞的增殖速度一般比較慢。一旦機(jī)體需要時(shí)，干細(xì)胞就可以進(jìn)入分化過程，以適應(yīng)組織器官生長、發(fā)育和修復(fù)的需要，當(dāng)干細(xì)胞進(jìn)入分化期時(shí)，其增殖速度開始逐漸加快。干細(xì)胞增殖具有自穩(wěn)性，指干細(xì)胞會自我更新維持自身數(shù)目的恒定，這是干細(xì)胞區(qū)別于腫瘤細(xì)胞的本質(zhì)特征。9發(fā)育早期―囊胚（受精后5－7天）中未分化的細(xì)胞。囊胚含有約140個(gè)細(xì)胞，中心囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)為內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成各種組織器官，具有全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時(shí)，稱之為胚胎干細(xì)胞。10胚胎干細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行分化，形成專能干細(xì)胞在胎兒、兒童和成人組織中的專能干細(xì)胞統(tǒng)稱為成體干細(xì)胞在特定的外加條件下，一種組織的的成體干細(xì)胞可以“橫向分化”成其它組織的功能細(xì)胞。1112干細(xì)胞分化為不同血細(xì)胞13（四）干細(xì)胞的特點(diǎn)干細(xì)胞具有自我更新和分化潛能。干細(xì)胞體積小，核質(zhì)比例大，端粒酶活性高，能無限增殖。干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時(shí)間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)。干細(xì)胞通過兩種方式生長。14對稱分裂非對稱分裂兩種方式生長形成兩個(gè)相同的干細(xì)胞。調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分配，一個(gè)子細(xì)胞不可逆的走向分化終端成為功能專一的分化細(xì)胞；另一個(gè)保持親代的特征，仍作為干細(xì)胞保留下來。15（五）胚胎干細(xì)胞類型胚胎干細(xì)胞全能性胚胎性干細(xì)胞多能性胚胎性干細(xì)胞在胚胎發(fā)育最早階段，各個(gè)卵裂球發(fā)育潛能幾乎是等同的，每個(gè)細(xì)胞可獨(dú)立地產(chǎn)生完整的機(jī)體；能誘導(dǎo)分化為幾乎所有類型的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的生物學(xué)可塑性，已屬于多能性，略強(qiáng)于組織干細(xì)胞。16組織來源胚胎性癌細(xì)胞，ECembryonalcarcinomacell全能性胚胎干細(xì)胞，ESembryonicstemcell多能性胚胎干細(xì)胞，EGembryonicgermcell17二、ES細(xì)胞和EG細(xì)胞培養(yǎng)建系技術(shù)

飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法胚胎細(xì)胞來源ES細(xì)胞和EG細(xì)胞的培養(yǎng)過程ES細(xì)胞和EG細(xì)胞系的特性和鑒定18體外培養(yǎng)建系ES細(xì)胞和EG細(xì)胞的技術(shù)以小鼠最為成熟，成功率最高。培養(yǎng)原則是有賴于獲得全能性胚胎細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，并建立體外適合其增殖和抑制分化的培養(yǎng)系統(tǒng)。早期胚胎細(xì)胞離體后極易發(fā)生分化，解決阻止其分化、確保維持其全能性或多能性是關(guān)鍵。19分化抑制物飼養(yǎng)層細(xì)胞（feederlayer）特殊細(xì)胞的條件培養(yǎng)液（conditionedmedium）分化抑制因子（differentiationinhibitoryfactor，DIF）20體外培養(yǎng)ES和EG細(xì)胞兩大方法飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法原代或初期培養(yǎng)階段一般都需要依賴于能分泌必需生長因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。以添加LIF生長因子或某些特定細(xì)胞的條件培養(yǎng)液至含F(xiàn)CS的正常培養(yǎng)液，來替代飼養(yǎng)細(xì)胞。21（一）飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法

常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF細(xì)胞STO細(xì)胞取自各種品系小鼠的12dpc的胚胎，經(jīng)剪碎和胰蛋白酶消化，常規(guī)分離細(xì)胞培養(yǎng)為單層散布的成纖維細(xì)胞。經(jīng)絲裂霉素C處理終止細(xì)胞分裂后，用作ES細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。來自SIM小鼠（S）胚胎的對硫代鳥嘌呤（tyioguanine,T）和烏本苷（ouabain,O）有抗性的成纖維細(xì)胞系，主要分泌干細(xì)胞生長因子（SCF）和白血病抑制因子（LIF）。

用作ES細(xì)胞或EG細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層的MEF或STO細(xì)胞均需用10mg/L絲裂霉素C在37℃處理4h，用前經(jīng)PBS徹底洗滌。22（二）無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)液直接在ES細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入重組LIF；Buffalo大鼠肝細(xì)胞條件培養(yǎng)液（BRL－CM）；2－3周幼年大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液（RH－CM）。23無飼養(yǎng)層的ES細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)2－3份細(xì)胞條件培養(yǎng)液1－2份新鮮的ES細(xì)胞培養(yǎng)液10%－20%胎牛血清24在胚胎干細(xì)胞原代和建系初期，培養(yǎng)ES/EG細(xì)胞的成功率不高，還需補(bǔ)充適當(dāng)?shù)纳L因子。建系成功后，可使用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。不同種屬的ES/EG細(xì)胞對生長因子的要求不同，如人ES細(xì)胞不能和LIF起反應(yīng)，難以抑制人ES細(xì)胞的分化。25（三）胚胎細(xì)胞來源

不同胚胎發(fā)育速度和方式存在較大差異。小鼠多用3－4天的胚泡或2－3天的桑椹胚，豬取8－10天的胚泡，綿羊取8－9天的胚泡，人和牛取7－8天的胚泡。體外授精胚胎或重構(gòu)胚胎在體外培養(yǎng)至所需發(fā)育階段時(shí)，也是ES細(xì)胞培養(yǎng)的有效材料來源。26小鼠采用超排卵途徑收集胚胎雌性成年小鼠注射5U孕馬血清促性腺激素（MPS），48h后再注射5U人絨毛膜促性腺激素（HCG）；與雄鼠合籠，自然交配，陽性者為0天（即0.5dpc）；第三天至第四天中午（即3.5dpc－4.5dpc）分別剖取孕鼠子宮，沖出早期胚泡，進(jìn)一步分離培養(yǎng)建立ES細(xì)胞系；剖取發(fā)育至8.5dpc－10.5dpc時(shí)的胚胎，可建立小鼠EG細(xì)胞系。27人早期胚胎和生殖腺采集新鮮或冷凍保存的受精卵或卵裂期人胚培養(yǎng)至胚泡期，進(jìn)一步分離ICM細(xì)胞，可建立人ES細(xì)胞系；經(jīng)人流途徑獲取7－8天胚泡或5－9周胚胎的生殖腺，從中分別分離和培養(yǎng)人ES和EG細(xì)胞系。28（四）ES細(xì)胞和EG細(xì)胞的培養(yǎng)過程

ES細(xì)胞的培養(yǎng)過程基本培養(yǎng)液DMEM液

15%－20%FCS0.1mmol/L

β－巰基乙醇50U/ml青霉素、50ug/ml鏈霉素29將胚泡接種于預(yù)先鋪有作為滋養(yǎng)層而無有絲分裂活性的單層MEF細(xì)胞的培養(yǎng)皿中用免疫手術(shù)法分離胚泡的ICM細(xì)胞，或用常規(guī)培養(yǎng)法分離出ICM細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)。培養(yǎng)2－3天30免疫手術(shù)法4－4.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋養(yǎng)外層胚層和未分化的ICM細(xì)胞組成，前者細(xì)胞表面一般已表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（MHC），能識別其相應(yīng)抗體和形成免疫復(fù)合物，在補(bǔ)體存在時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生免疫溶解。具體操作如下：31體外培養(yǎng)的胚泡，用酸性Tyrode`s液（pH2.5）處理，去除透明帶；Hank`s洗滌，加入兔抗JCR小鼠脾臟細(xì)胞抗血清（抗H－2b）；移至含新鮮豚鼠血清的培養(yǎng)液，Hank`s液洗滌后，移至96孔鋪有MEF或STO飼養(yǎng)層細(xì)胞和DMEM基本培養(yǎng)液的板內(nèi)進(jìn)一步培養(yǎng)。30min胚泡的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞呈泡狀，發(fā)生免疫溶解；而ICM細(xì)胞不具H－2b抗原，細(xì)胞完整；30min32常規(guī)培養(yǎng)法未去透明帶的胚泡培養(yǎng)3－4天，ICM細(xì)胞團(tuán)從貼壁胚泡內(nèi)長出來；胰蛋白酶和EDTA混合消化液在37℃消化5min；解離的細(xì)胞團(tuán)移至滋養(yǎng)層的24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)4天，可在一些孔內(nèi)見到巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)；胰蛋白酶消化巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán)并繼續(xù)培養(yǎng)，克隆和純化ES細(xì)胞。視ES細(xì)胞巢密度轉(zhuǎn)移到較大容積的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。33EG細(xì)胞的培養(yǎng)過程

哺乳動物原始生殖細(xì)胞（PGC）最早發(fā)生于近尿囊基部的卵黃內(nèi)胚層內(nèi)，隨著胚胎發(fā)育和縱向轉(zhuǎn)折，卵黃囊的一部分成為胚胎的后腸，PGC取材主要根據(jù)其在不同物種的早期胚胎中所處遷移位置而定。341、原始生殖細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng)收集8.5－10.5dpc小鼠胚胎，用D－Hank`s液輕洗后，在解剖鏡下用鑷子剖取包含原始生殖細(xì)胞（PGC）的生殖嵴組織；以0.02%EDTA液孵育含PGC細(xì)胞的生殖嵴組織，37℃,15min；吸管輕吹打散，接種于鋪有滋養(yǎng)層的4孔培養(yǎng)板內(nèi)。35基本培養(yǎng)液DMEM液

15%－20%FCS0.1mmol/L

β－巰基乙醇50U/ml青霉素、50ug/ml鏈霉素2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉362、滋養(yǎng)層細(xì)胞

宜用8代以內(nèi)的小鼠MEF細(xì)胞或STO細(xì)胞系。用前經(jīng)10ug/ml絲裂霉素C在37℃處理2－3h；接種于包被0.1%明膠的培養(yǎng)板或細(xì)胞瓶內(nèi)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的DMEM。373、EG細(xì)胞純化和建系

培養(yǎng)物在滋養(yǎng)層細(xì)胞上分裂增殖，4－6天后在顯微鏡下將包含原始生殖細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)用胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移至新滋養(yǎng)層細(xì)胞上增殖；重復(fù)用胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移至新的滋養(yǎng)層細(xì)胞，經(jīng)過2－3次過程，一般可產(chǎn)生巢狀（nests）生長的干細(xì)胞集落；最后將它轉(zhuǎn)移到鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)增，此時(shí)培養(yǎng)液中可減少或省略LIF、SCF和bFGF等生長因子。38（五）ES細(xì)胞和EG細(xì)胞系的特性和鑒定1形態(tài)學(xué)特征

將克隆挑出，用胰蛋白酶消化并接種于新的滋養(yǎng)層或特定的條件培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3－4天后，分散的細(xì)胞又重新呈島狀或巢狀的細(xì)胞克隆。圓形或卵圓形，彼此均呈單層或多層緊密堆積而形成島狀或巢狀群體生長形態(tài)；呈現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)核仁、核質(zhì)比例高；39不同種的ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征有所不同。人體ES細(xì)胞呈扁平狀群落，而且細(xì)胞界限清楚；小鼠ES細(xì)胞或EG細(xì)胞雖然聚集成團(tuán)，但呈懸浮狀態(tài)，細(xì)胞界限也較清楚；豬ES細(xì)胞具有特征性細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的上皮細(xì)胞表型。402、發(fā)育全能性和分化潛能鑒定免疫組織化學(xué)①時(shí)期專一性胚胎抗原（SSEA）②堿性磷酸酶（AKP）③Oct－4基因表達(dá)④端粒酶（telomerase）⑤體外分化潛能⑥體內(nèi)分化41①時(shí)期專一性胚胎抗原（stage-specificembryonicantigen,SSEA）間接免疫熒光法檢測ES和EG細(xì)胞表面抗原。不同種屬具有亞型，小鼠SSEA－1型，人SSEA－3或SSEA－4亞型。42②堿性磷酸酶（AKP）小鼠胚胎干細(xì)胞中活性較高，已分化細(xì)胞中活性明顯降低。細(xì)胞經(jīng)1%多聚甲醛固定，直接用AKP底物NBT液染色，未分化細(xì)胞具有較高的AKP酶活性，顯示深藍(lán)紫色。43③Oct－4基因表達(dá)Oct－4是生殖系專一性轉(zhuǎn)錄因子，在小鼠胚胎發(fā)育早期、生殖細(xì)胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能干細(xì)胞是特異性表達(dá)的標(biāo)志基因；人類ES、EG細(xì)胞中Oct－4的表達(dá)情況尚不明確。44④端粒酶（telomerase）端粒酶是一類核糖核蛋白，與控制細(xì)胞壽命有關(guān)。人ES細(xì)胞的端粒酶活性特別高，分化細(xì)胞一般難以檢測到其活性。45⑤體外分化潛能將ES細(xì)胞和EG細(xì)胞接種于缺乏滋養(yǎng)層細(xì)胞和LIF生長因子培養(yǎng)液的瓊脂板上，或添加適當(dāng)?shù)姆只T導(dǎo)物質(zhì)（如維甲酸），或懸滴培養(yǎng)，細(xì)胞黏附成團(tuán)；培養(yǎng)3－4天后形成擬胚體，最外層分化為較大細(xì)胞組成的內(nèi)胚層樣結(jié)構(gòu)，中間為未分化的干細(xì)胞；培養(yǎng)8－10天，擬胚體增大，內(nèi)部出現(xiàn)囊腔，形成囊狀胚體，這樣的結(jié)構(gòu)可持續(xù)3周左右。46⑥體內(nèi)分化不同品系小鼠的ES細(xì)胞和EG細(xì)胞在體內(nèi)生長速度和分化能力會有所區(qū)別。接種于同一品系的小鼠或免疫缺損小鼠腹股溝、眼窩和腹腔，可形成由內(nèi)胚層、中胚層和外胚層構(gòu)成的畸胎瘤，通達(dá)組織學(xué)檢查，可以分析ES細(xì)胞或EG細(xì)胞的全能性或多能性或限能性的發(fā)育潛能。47三、ES細(xì)胞和EG細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化基本原理ES細(xì)胞和EG細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化

ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基本方法

ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的幾種細(xì)胞

48（一）基本原理

誘導(dǎo)分化是胚胎正常發(fā)育過程中最重要而基本的現(xiàn)象；在胚胎細(xì)胞被誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，所用誘導(dǎo)物質(zhì)種類繁多，誘導(dǎo)模式也不盡相同，按作用機(jī)理大致可分為兩類：誘導(dǎo)作用的結(jié)果不只是決定于各種誘導(dǎo)物質(zhì)的性質(zhì)和專一性，同時(shí)也決定于被誘導(dǎo)細(xì)胞的反應(yīng)能力；49誘導(dǎo)細(xì)胞可逆性地輕度損傷，導(dǎo)致細(xì)胞分化如無機(jī)物、有機(jī)酸、醇、亞甲基鹽、硫氫化物，使細(xì)胞滲透壓改變致成輕度損傷與誘導(dǎo)細(xì)胞表面各自受體結(jié)合而誘導(dǎo)分化如類固醇激素、維甲酸衍生物、多肽生長因子等。50（二）ES細(xì)胞和EG細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化體外誘導(dǎo)分化譜系分化（lineagedifferentiation）

定向分化（committeddifferentiation）包括譜系祖細(xì)胞、譜系定型細(xì)胞到終末分化細(xì)胞的整個(gè)細(xì)胞分化的全過程。設(shè)法控制導(dǎo)向產(chǎn)生單一類型的分化細(xì)胞，這是至今仍未解決的難題。51（三）ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的基本方法

1、單層ES細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化2、ES細(xì)胞擬胚體形成和誘導(dǎo)分化52每隔兩天1、單層ES細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化0.25%胰蛋白酶消化，吹打成單個(gè)細(xì)胞2－5×104個(gè)/ml密度接種于0.1%白明膠包被的培養(yǎng)皿更換含誘導(dǎo)劑的新鮮培養(yǎng)液添加適當(dāng)濃度的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑53常用分化誘導(dǎo)劑維甲酸二甲亞砜環(huán)六亞甲基雙乙酰胺等通常單層培養(yǎng)的ES細(xì)胞較難分化為單一類型的細(xì)胞，常出現(xiàn)以某種類型分化細(xì)胞為優(yōu)勢、雜有一些其他類型分化細(xì)胞。542、ES細(xì)胞擬胚體形成和誘導(dǎo)分化軟瓊脂培養(yǎng)彼此黏附聚集而形成擬胚體胰酶消化，吹打成單細(xì)胞104/ml接種于1%軟瓊脂的培養(yǎng)皿，呈懸浮生長55懸滴培養(yǎng)胰酶消化，制成2－5×104個(gè)/ml的懸浮液，搖勻以20ul/滴接種于培養(yǎng)皿蓋子上，制成懸浮培養(yǎng)皿內(nèi)加PBS，使蓋子上的小滴成懸滴，加封37℃,5%CO2,3d懸滴中的ES細(xì)胞聚集形成擬胚體56移至含細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)皿板進(jìn)一步培養(yǎng)移入鋪有0.1%白明膠的培養(yǎng)皿，分化誘導(dǎo)劑培養(yǎng)液中被誘導(dǎo)分化為不同類型的細(xì)胞57四、ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的幾種細(xì)胞

小鼠模型，且偏重混合型分化細(xì)胞。人類ES/EG細(xì)胞建系成功，致力于將人ES細(xì)胞改造成以臨床基因、細(xì)胞和組織治療為目的的各種定向誘導(dǎo)分化細(xì)胞研究。主要是將克隆技術(shù)和核移植技術(shù)融合于干細(xì)胞研究。58

軟骨細(xì)胞

脂肪細(xì)胞

心肌和其他肌肉細(xì)胞

神經(jīng)細(xì)胞

內(nèi)皮細(xì)胞與血管

造血細(xì)胞

胰島細(xì)胞59四、細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用前景①神經(jīng)系統(tǒng)疾?、诠呛蛙?/p>