高效液相色譜的基礎(chǔ)知識(shí)

高效液相色譜的基礎(chǔ)知識(shí)第一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二1高效液相色譜法的特點(diǎn)2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護(hù)4高效液相色譜法儀的注意事項(xiàng)5高效液相色譜的分析應(yīng)用第二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法的特點(diǎn)

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較：第三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法的特點(diǎn)

1．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)103cm·min-1.例如對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。第四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法的特點(diǎn)2．高效液相色譜法與氣相色譜法（l）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。

(2)氣相色譜采用流動(dòng)相是惰性氣體，它對(duì)組分沒有親和力，即不產(chǎn)生相互作用力，僅起運(yùn)載作用。而高效液相色譜法中流動(dòng)相可選用不同極性的液體，選擇余地大，它對(duì)組分可產(chǎn)生一定親和力，并參與固定相對(duì)組分作用的劇烈競爭。因此，流動(dòng)相對(duì)分離起很大作用，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)，這為選擇最佳分離條件提供了極大方便。

(3)氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的，而高效液相色譜法則經(jīng)?？稍谑覝貤l件下工作。第五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法的特點(diǎn)分析速度快——通常分析一個(gè)樣品在15~30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。選擇性高——可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，可分析同類型的有機(jī)化合物及其同分異構(gòu)體，還可以分析在性質(zhì)上極為相似的旋光異構(gòu)體。靈敏度高——紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1pg。柱子可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。第六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜法的特點(diǎn)

超高效液相色譜(UPLC)—是區(qū)別于HPLC的液相色譜新領(lǐng)域—基于小顆粒填料和LC原理的一種創(chuàng)新技術(shù)—實(shí)現(xiàn)超高分離度、靈敏度、分析速度第七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二1高效液相色譜法的特點(diǎn)2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護(hù)4高效液相色譜法儀的注意事項(xiàng)5高效液相色譜的分析應(yīng)用第八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理

?

高壓輸液系統(tǒng)?

進(jìn)樣系統(tǒng)?

分離系統(tǒng)?

檢測(cè)系統(tǒng)第九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理

其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來，由此得到液相色譜圖。第十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理1．高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對(duì)于一個(gè)好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關(guān)；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。第十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理2．進(jìn)樣裝置

第十二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理3分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。第十三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理4．檢測(cè)系統(tǒng)目前有兩種基本類型的檢測(cè)器:

一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，蒸發(fā)光散射，電導(dǎo)檢測(cè)器等。第十四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器

工作原理：基于Lambert-Beer定律，即被測(cè)組分對(duì)紫外光或可見光具有吸收，且吸收強(qiáng)度與組分濃度成正比。通用型檢測(cè)器約有80％的分析樣品具有紫外吸收,可以使用這種檢測(cè)器檢測(cè)。第十五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器

優(yōu)點(diǎn):a:靈敏度高b:線性范圍廣C:對(duì)溫度和流速不敏感，適于進(jìn)行梯度洗脫限制:a:沒有紫外吸收的物質(zhì)不能檢測(cè)b:應(yīng)盡可能選擇在檢測(cè)波長下沒有背景吸收的流動(dòng)相(限制了一些截止波長在200~300nm之間的良好溶劑的使用)

第十六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器（2）熒光檢測(cè)器

原理:

物質(zhì)的分子或原子經(jīng)光照射后，有些電子被激發(fā)至較高的能級(jí)，這些電子從高能級(jí)躍至低能級(jí)時(shí)，物質(zhì)會(huì)發(fā)出比入射光波長較長的光，這種光稱為熒光。熒光檢測(cè)器就是在樣品的激發(fā)波長處檢測(cè)發(fā)射光的強(qiáng)弱.熒光檢測(cè)器是一種選擇性檢測(cè)器不到20%的物質(zhì)使用這種檢測(cè)手段,許多藥物采用這種檢測(cè)方法.

第十七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器（2）熒光檢測(cè)器優(yōu)點(diǎn):a:靈敏度非常高(靈敏度在目前常用的HPLC檢測(cè)器中最高)，比紫外檢測(cè)器高2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，適合于痕量分析

b:可以用于梯度洗脫

c:對(duì)儀器的穩(wěn)定性（如溫度和壓力的穩(wěn)定性）依賴較小

d:選擇性好，優(yōu)于紫外缺點(diǎn):a:適用范圍有一定的局限性–只適用于有熒光基團(tuán)＆衍生化之后有熒光基團(tuán)的化合物

b:定量分析時(shí)線性范圍較窄它適合于稠環(huán)芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋白質(zhì)等熒光物質(zhì)的測(cè)定第十八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器（2）熒光檢測(cè)器（3）二極管陣列檢測(cè)器原理:

光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測(cè)元件的UV-VIS檢測(cè)器。它可構(gòu)成多通道并行工作，同時(shí)檢測(cè)由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的全部波長的信號(hào)，然后，對(duì)二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長的三維譜圖。

第十九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器（2）熒光檢測(cè)器（3）二極管陣列檢測(cè)器

第二十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器（2）熒光檢測(cè)器（3）二極管陣列檢測(cè)器與普通UV-VIS檢測(cè)器不同之處:a:普通UV-VIS檢測(cè)器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列UV-VIS檢測(cè)器是先讓所有波長的光都通過流動(dòng)池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢測(cè).b:普通UV-VIS檢測(cè)器只能得到二維的譜圖,而DAD可以得到三維圖譜.

第二十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器（2）熒光檢測(cè)器（3）二極管陣列檢測(cè)器應(yīng)用a:色譜峰純度檢查b:色譜峰鑒定三維色譜能提供更多全面的信息。

第二十二頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器（2）熒光檢測(cè)器（3）二極管陣列檢測(cè)器（4）示差折光率檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器，只要被測(cè)組分與洗脫液的折光指數(shù)有差別就可使用。生命科學(xué)中常遇到各類糖類化合物，沒有紫外吸收，一般常用示差折光檢測(cè)器。它的通用性比UVD廣，但靈敏度要低，對(duì)溫度變化敏感，并與梯度洗脫不相容，因而限制了它的使用。

第二十三頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀工作原理（1）紫外檢測(cè)器（2）熒光檢測(cè)器（3）二極管陣列檢測(cè)器（4）示差折光率檢測(cè)器（5）電導(dǎo)檢測(cè)器

電化學(xué)檢測(cè)器（ECD）ECD是根據(jù)物質(zhì)的電還原性和電氧化性來進(jìn)行檢測(cè)的，應(yīng)用于對(duì)紫外光沒有吸收或不能發(fā)出熒光，但具有電活性的物質(zhì)測(cè)定。若結(jié)合衍生技術(shù)，也可應(yīng)用于非電活性物質(zhì)的檢測(cè)。安培檢測(cè)器和電導(dǎo)檢測(cè)器在生化、醫(yī)學(xué)、食品和環(huán)境分析中獲得廣泛的應(yīng)用。

第二十四頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二1高效液相色譜法的特點(diǎn)2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護(hù)4高效液相色譜法儀的注意事項(xiàng)5高效液相色譜的分析應(yīng)用第二十五頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀的維護(hù)

泵的使用和維護(hù)防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒。流動(dòng)相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時(shí)間的情況下。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對(duì)于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會(huì)使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作第二十六頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀的注意事項(xiàng)柱的使用和維護(hù)1、使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。2、使用符合要求的流動(dòng)相；3、使用保護(hù)柱；4、如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。5、長時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L霉。6、不要高壓沖洗柱子；7、不要在高溫下長時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱；使用過程中注意輕拿輕放。第二十七頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀的維護(hù)

流動(dòng)相的脫氣

HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測(cè)器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測(cè)。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶來誤差。第二十八頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀的維護(hù)

紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開檢測(cè)器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測(cè)器。第二十九頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二1高效液相色譜法的特點(diǎn)2高效液相色譜法儀器工作原理3高效液相色譜儀的維護(hù)4高效液相色譜法儀的注意事項(xiàng)5高效液相色譜的分析應(yīng)用第三十頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀的注意事項(xiàng)一、流動(dòng)相1、流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純?cè)噭?、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用，過濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；2、水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過2天），防止長菌變質(zhì).第三十一頁，共三十六頁，編輯于2023年，星期二高效液相色譜儀的注意事