生物制品分析概論醫(yī)學(xué)課件

《藥物分析》課件第十三章

生物制品分析概論1醫(yī)學(xué)ppt基本要求掌握：常用的定量分析方法中的色譜分析法。熟悉:該類藥物的質(zhì)量檢驗(yàn)的基本程序與方法。了解：生化藥物和基因工程藥物定義、種類和特點(diǎn)。2醫(yī)學(xué)ppt基本內(nèi)容一、概述二、鑒別試驗(yàn)三、雜質(zhì)檢查四、含量（效價(jià)）測(cè)定練習(xí)與思考3醫(yī)學(xué)ppt

1、生物制品藥物分析有那些特點(diǎn)？2、為什么必須對(duì)生物制品進(jìn)行全程質(zhì)量控制？問(wèn)題4醫(yī)學(xué)ppt生物藥物（來(lái)源和生產(chǎn)方法）生化藥物生物合成藥物生物制品第一節(jié)概述2005年版藥典分為幾部？每部的收載內(nèi)容？5醫(yī)學(xué)ppt生物藥物利用生物體、生物組織或組成生物體的各種成分，綜合運(yùn)用生物學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、物理化學(xué)和藥學(xué)的原理與方法制得的一大類藥物。6醫(yī)學(xué)ppt生物藥物發(fā)展過(guò)程：第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物質(zhì)與混合成分的粗提取物制劑：魚肝油、胰酶及其腸溶、甲狀腺粉及其制劑等。第二代：根據(jù)生物化學(xué)和免疫學(xué)原理，應(yīng)用近代生化分離純化技術(shù)從生物體制取的具有針對(duì)性治療作用的特異生化成分。如：尿激酶、胰島素、人血白蛋白等。第三代：應(yīng)用生物工程技術(shù)生產(chǎn)的天然生理活性物質(zhì)，以及通過(guò)蛋白質(zhì)工程原理設(shè)計(jì)制造的具有比天然物質(zhì)更高活性的類似物，或與天然物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同的全新的藥理活性成分。如：重組人生長(zhǎng)激素、重組人胰島素等。7醫(yī)學(xué)ppt生化藥物定義：指從動(dòng)物、植物及微生物提取的，也可用生物-化學(xué)半合成或用現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶、多糖、脂質(zhì)、核甘酸類。8醫(yī)學(xué)ppt生物合成藥物定義:由微生物代謝所產(chǎn)生的藥物和必須利用微生物及其酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)共同完成的半合成藥物,如:山梨醇、木糖醇、甘露醇、維生素、甾體激素、酶與輔酶類藥物等。9醫(yī)學(xué)ppt生物制品定義用普通的或以基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù)獲得的微生物、細(xì)胞及各種動(dòng)物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷的藥品。包括：細(xì)菌類疫苗、病毒類疫苗、抗毒素及免疫血清、血液制品、細(xì)胞因子、體內(nèi)及體外診斷制品以及其他活性制劑微生態(tài)制劑:雙歧桿菌10醫(yī)學(xué)ppt生物制品的種類和特點(diǎn)根據(jù)所采用的材料、制法或用途不同，可分為六類:疫苗類藥物:人用狂犬病疫苗抗毒素及抗血清類藥物:流感全病毒滅活疫苗;抗蝮蛇毒血清血液制品:人血白蛋白重組DNA制品診斷制品其他制品11醫(yī)學(xué)ppt由于有效結(jié)構(gòu)或分子量不確定，其結(jié)構(gòu)的確證很難沿用化學(xué)藥物或結(jié)構(gòu)已知的生化藥物所常用的方法，還需要生物化學(xué)分析如：氨基酸組成、N末端氨基酸序列、肽圖等。大部分生物制品的活性組分均為大分子的生命物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、多糖類等）。組分相同，但相對(duì)分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性，因此常需進(jìn)行相對(duì)分子量的測(cè)定。（二）生物制品的特點(diǎn)分子量不是定值。生化法結(jié)構(gòu)確證。需檢查生物活性。生物制品對(duì)熱、酸、堿、重金屬及pH等變化敏感，各種理化因素的變化易對(duì)生物活性產(chǎn)生影響。特別是多肽和蛋白質(zhì)。除理化分析，還需生物檢定，防止蛋白質(zhì)失活。要求安全性檢查。生物制品組分復(fù)雜，有效成分濃度很低，生物大分子雜質(zhì)含量比較高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易引入特殊雜質(zhì)和污染物。如重組乙型肝炎疫苗涉及的安全性檢查包括：細(xì)胞外源因子檢查、原液、半成品、成品中有關(guān)血清白蛋白殘留量、CHO細(xì)胞DNA殘留量檢查、熱原檢查、過(guò)敏試驗(yàn)、異常毒性檢查等。需做效價(jià)測(cè)定。對(duì)于生物制品有效成分的檢測(cè)，除應(yīng)有一般化學(xué)方法或理化分析進(jìn)行有效成分含量測(cè)定外，更應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的特異生理效應(yīng)或?qū)Ｒ换磻?yīng)擬定其專屬性的生物效價(jià)測(cè)定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。例：人凝血酶原復(fù)合物的效價(jià)測(cè)定。12醫(yī)學(xué)ppt三、生物制品的全程質(zhì)量控制生物制品化學(xué)性質(zhì)與生物學(xué)性質(zhì)都很不穩(wěn)定，又易受微生物污染，故對(duì)生物制品的均一性、有效性、安全性和穩(wěn)定性等應(yīng)有嚴(yán)格要求，以生產(chǎn)出具有藥理活性高、針對(duì)性強(qiáng)、毒性低、副作用小，療效可靠及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)的安全、高效的生物制品。為此，必須進(jìn)行原材料、生產(chǎn)過(guò)程和最終產(chǎn)品的全程質(zhì)量控制，以確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。13醫(yī)學(xué)ppt生物制品及檢定規(guī)程草案（1952年）生物制品制造檢定規(guī)程（1959年）中國(guó)生物制品規(guī)程（2000年）中華人民共和國(guó)藥典三部（2005年）收載生物制品101種14醫(yī)學(xué)ppt

生物制品品名定義、組成及用途基本要求制造檢定（原液、半成品、成品）保存運(yùn)輸及有效期使用說(shuō)明（僅預(yù)防類含此項(xiàng)）化學(xué)藥品品名化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子式性狀鑒別檢查含量測(cè)定藥典三部各論內(nèi)容藥典二部各論內(nèi)容15醫(yī)學(xué)ppt生物制品質(zhì)量控制重點(diǎn)有效成分的同一性、結(jié)構(gòu)確證有效成分的均一性、純度檢查有害物質(zhì)及殘余雜質(zhì)等的控制高效、靈敏的生物活性及比活性等實(shí)驗(yàn)方法生物制品質(zhì)量控制基本方法：鑒別試驗(yàn)雜質(zhì)檢查安全性檢查含量測(cè)定（生物活性或效價(jià)）16醫(yī)學(xué)ppt第二節(jié)鑒別試驗(yàn)依據(jù)生物制品的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)特點(diǎn)，利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法進(jìn)行某些特殊反應(yīng)，或測(cè)定某些專屬的理化常數(shù)如紫外吸收系數(shù)、等電點(diǎn)、電泳遷移率、色譜保留時(shí)間和肽圖等，判斷與確證產(chǎn)品的真?zhèn)?。（一組實(shí)驗(yàn)）17醫(yī)學(xué)ppt一、理化鑒別法1、化學(xué)鑒別法

利用藥物與某試劑在一定條件下反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。如胰島素的沉淀反應(yīng)。2、紫外分光光度法

蛋白質(zhì)生物制品主要由芳香族氨基酸側(cè)鏈如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸產(chǎn)生紫外吸收。如重組人促紅素最大吸收279nm。3、高效液相色譜法

（主峰保留時(shí)間和肽圖的一致性）

例如重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的肽圖分析18醫(yī)學(xué)ppt19醫(yī)學(xué)ppt二、生化鑒別法1、酶法利用酶對(duì)底物特異性的催化活力，做為酶類生物制品簡(jiǎn)便、快速鑒別方法。如尿激酶的鑒別

20醫(yī)學(xué)ppt2、電泳法

等電點(diǎn)聚焦電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等?？捎糜诘鞍踪|(zhì)類生物制品的鑒別。21醫(yī)學(xué)ppt三、生物鑒別法（一）血清學(xué)法-體外抗原抗體試驗(yàn)抗原抗體類生物制品的鑒別抗原抗體在體外結(jié)合時(shí)，可因抗原物理性狀不同或參與反應(yīng)的成分不同而出現(xiàn)各種類型的反應(yīng)，如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、中和反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)，即經(jīng)典血清學(xué)反應(yīng)，在此基礎(chǔ)上，又衍生出免疫擴(kuò)散、免疫電泳、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記等高度敏感的檢測(cè)技術(shù)。22醫(yī)學(xué)ppt（二）生物學(xué)法利用生物體對(duì)生物制品特定的生物活性的反應(yīng)為基礎(chǔ)進(jìn)行供試品的鑒別。例如:小鼠驚厥試驗(yàn)鑒別胰島素肝素延長(zhǎng)血凝鑒別肝素23醫(yī)學(xué)ppt第三節(jié)雜質(zhì)檢查可用來(lái)判斷藥品的優(yōu)劣。由于生物制品來(lái)自生物體，生物活性特異性強(qiáng)，制造與純化工藝復(fù)雜，分子結(jié)構(gòu)常常不確定，有時(shí)產(chǎn)品并非單一，極微量雜質(zhì)可能產(chǎn)生顯著的效應(yīng)，因此，其雜質(zhì)檢查顯得尤為重要。主要包括：一般雜質(zhì)檢查特殊雜質(zhì)檢查安全性檢查24醫(yī)學(xué)ppt

一般雜質(zhì)檢查氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度、溶液的顏色、水份及干燥失重、熾燒殘?jiān)取?5醫(yī)學(xué)ppt一、特殊雜質(zhì)檢查從原料中帶入或生產(chǎn)工藝中或貯藏過(guò)程中引入的雜質(zhì)根據(jù)生物制品的生產(chǎn)工藝特點(diǎn)與產(chǎn)品的穩(wěn)定性，其特殊雜質(zhì)分為：生物污染物：微生物污染、宿主細(xì)胞蛋白、外源性DNA、培養(yǎng)基成分等產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：二聚體和多聚體、脫氨或氧化產(chǎn)物、突變物、裂解產(chǎn)物等工藝添加劑：殘余抗生素、蛋白分離劑聚乙二醇、乙醇、佐劑氫氧化鋁，產(chǎn)品穩(wěn)定劑如辛酸鈉、肝素，防腐劑苯酚、硫柳汞，細(xì)菌與病毒滅活劑甲醛、戊二醛等。26醫(yī)學(xué)ppt（一）宿主細(xì)胞蛋白殘留量測(cè)定生物制品生產(chǎn)用細(xì)胞、工程菌相關(guān)的特殊雜質(zhì)。目的：控制異源蛋白含量以防超量后引起機(jī)體免疫反應(yīng)測(cè)定法：酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法－ELISA27醫(yī)學(xué)ppt（二）外源性DNA殘留量的檢查測(cè)定方法：分子雜交技術(shù)基于DNA結(jié)合蛋白分析系統(tǒng)實(shí)時(shí)定量PCR方法28醫(yī)學(xué)ppt29醫(yī)學(xué)ppt（三）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)檢查生物制品在生產(chǎn)制造、分離純化和貯藏保存過(guò)程中產(chǎn)生的與產(chǎn)品結(jié)構(gòu)類似的同系物、異構(gòu)體、突變物、氧化物、聚合體或降解物。常用HPLC法和電泳法。如重組人生長(zhǎng)激素中相關(guān)蛋白質(zhì)的測(cè)定總相關(guān)蛋白質(zhì)含量不超過(guò)10%。30醫(yī)學(xué)ppt（四）殘余抗生素的檢查如果生物制品在生產(chǎn)過(guò)程中使用了抗生素，則不僅要在純化工藝中除去，而且要在原液檢定中增加殘余抗生素活性的檢測(cè)方法。常用方法：抑菌圈測(cè)量。結(jié)果判定：對(duì)照溶液有抑菌圈，陰性對(duì)照無(wú)抑菌圈，供試品溶液抑菌圈的直徑小于對(duì)照溶液抑菌圈的直徑時(shí)判斷為陰性；否則為陽(yáng)性。31醫(yī)學(xué)ppt二、安全性檢查（一）熱原檢查法和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（二）異常毒性檢查（三）過(guò)敏試驗(yàn)

檢查異性蛋白（四）降壓試驗(yàn)

檢查組胺、類組胺或其他導(dǎo)致血壓下降的物質(zhì)（五）無(wú)菌試驗(yàn)檢查藥品及敷料是否有活菌的一種方法32醫(yī)學(xué)ppt含量測(cè)定HPLCSDS效價(jià)測(cè)定第四節(jié)：含量（效價(jià)）測(cè)定33醫(yī)學(xué)ppt常用的定量分析方法及應(yīng)用理化分析法生化分析法生物檢定法34醫(yī)學(xué)ppt理化分析法化學(xué)分析方法電化學(xué)分析法光譜分析法色譜分析法重量法容量分析法35醫(yī)學(xué)ppt比色法

利用樣品與顯色劑發(fā)生現(xiàn)色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色強(qiáng)度來(lái)測(cè)定含量。Elson-Morgan

硫酸軟骨素的比色法測(cè)定：在酸性條件下使樣品水解成氨基己糖，再在堿性條件下與乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的產(chǎn)物，該產(chǎn)物在525nm處有最大吸收。光譜分析方法36醫(yī)學(xué)ppt具體試驗(yàn)操作：1、制備對(duì)照品溶液－鹽酸氨基葡萄糖2、制備供試品溶液－硫酸軟骨素3、反應(yīng)和測(cè)定－縮合反應(yīng)和比色測(cè)定A平為供試品溶液的吸收度As平為對(duì)照品溶液的吸收度Ws為對(duì)照品溶液的濃度（mg/ml）W為稱樣量（mg）0.8309為校正因子500為稀釋倍數(shù)以氨基葡萄糖計(jì)≥24.0％37醫(yī)學(xué)ppt高效液相色譜法反相高效液相色譜法RP-HPLCReversed-phasehigh-performanceliquidchromatography高效離子交換色譜法HPIECHigh-performanceIon-exchangechromatography高效凝膠過(guò)濾色譜法HPGFCHigh-performanceGel-filterchromatography38醫(yī)學(xué)ppt反相高效液相色譜法

基本原理：利用ODS或C18等極性較小的鍵合硅膠為填料，以極性較大的methanol-water、CH3CN-H2O為流動(dòng)相，根據(jù)樣品在固定相和流動(dòng)相中的不同保留行為而實(shí)現(xiàn)高效分離的一種方法。可以應(yīng)用UV、DAD、FD、ELSD、ECD、MS等作為檢測(cè)器，分離化合物范圍廣泛。39醫(yī)學(xué)ppt生白能（重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子）的RP-HPLC測(cè)定色譜條件色譜柱：TSKODS-120T(150×4.6mm,I.D.,5μm)流動(dòng)相:（A）0.1％的三氟乙酸,（B）乙腈－1％三氟乙酸（90：10），梯度洗脫檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm柱溫：室溫流速：1.0ml/min40醫(yī)學(xué)ppt重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（GM-CSF)添加劑(人血白蛋白）生白能的HPLC圖41醫(yī)學(xué)ppt高效凝膠過(guò)濾色譜法

根據(jù)生物藥物的分子量及其極性來(lái)對(duì)成分進(jìn)行分離測(cè)定，主要用于生化藥物的分離和分子量的測(cè)定研究。分離產(chǎn)物可以回收、可以用少量表面活性劑來(lái)改善分離效果、可根據(jù)化合物的形狀和分子量大小來(lái)預(yù)測(cè)出峰順序。具有簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。42醫(yī)學(xué)pptHPGFC法測(cè)定重組人腫瘤壞死因子（rh-TNF）衍生物的分子量色譜條件色譜柱：BeckmanSEC3000(300×7.5mm)流動(dòng)相:0.1mmol/lKH2PO4:0.1mmol/lNa2SO4(1:1)檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm柱溫：室溫流速：1.0ml/min43醫(yī)學(xué)pptStandards:醛縮酶-2、血清白蛋白-3、碳酸肝酶-4、抑蛋白酶肽-5Interstandard（IS）:右旋糖酐藍(lán)-1、酪氨酸-644醫(yī)學(xué)ppt二、生化分析法

45醫(yī)學(xué)ppt（一）酶法酶法

酶活力測(cè)定法—以酶為分析對(duì)象

酶分析法—以酶為分析工具或分析試劑酶活力測(cè)定法酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。測(cè)定一個(gè)被酶所催化的化學(xué)反應(yīng)速度。酶反應(yīng)速度以單位時(shí)間底物的減少或產(chǎn)物的增加來(lái)表示。酶活力46醫(yī)學(xué)ppt酶促反應(yīng)的影響因素（1）底物濃度的影響：選擇Km小的作底物

（2）pH的影響（3）溫度的影響：溫度控制在±0.1度（4）輔助因子的影響（5）空白和對(duì)照試驗(yàn)

空白：雜質(zhì)反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)引起的變化量

對(duì)照實(shí)驗(yàn)：用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測(cè)定。用于比較或測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)。

47醫(yī)學(xué)ppt酶法測(cè)定方法（1）取樣測(cè)定法停止酶反應(yīng)的方法：添加變性劑加熱使酶失效（2）連續(xù)測(cè)定法48醫(yī)學(xué)ppt檢測(cè)方法1、UV-VIS—根據(jù)產(chǎn)物和底物特征吸收差別2、熒光3、旋光法4、酶偶聯(lián)測(cè)定法例如：ELASA5、其他：電化學(xué)法、離子選擇電極測(cè)定等49醫(yī)學(xué)ppt酶分析法以酶為分析工具的方法。分析的對(duì)象可以是酶的底物、輔酶活化劑或酶抑制劑。影響因素：酶和作用物的濃度、反應(yīng)時(shí)間、溫度和pH50醫(yī)學(xué)ppt（二）電泳法生物制品藥物分析的重要手段。在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子或離子在電場(chǎng)作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移。1、自由界面