大黃瀉下作用機(jī)制的研究綜述

大黃瀉下作用機(jī)制的研究綜述[摘要]大黃有顯著瀉下作用,蒽醌甙是其產(chǎn)生瀉下作用的主要成分，雙蒽酮番瀉甙的作用最強(qiáng)，游離型蒽醌類只有微弱的瀉下作用。近年來實驗和研究總結(jié)出了大黃瀉下作用機(jī)制，而且得出大黃因劑型及煎煮的時間不同以及炮制品不同，瀉效也不同，將游離型蒽醌結(jié)腸定位給藥,可以發(fā)揮藥物中游離型蒽醌的瀉下作用。本文介紹了大黃成分及其主要瀉下成分，對大黃瀉下作用進(jìn)行了綜合論述，概括出大黃瀉下作用機(jī)理，瀉效的不同發(fā)揮效果以及大黃瀉下臨床應(yīng)用，為大黃瀉下作用相關(guān)技術(shù)推廣與應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)。[關(guān)鍵字]大黃；瀉下；蒽醌甙；作用機(jī)制第12頁目錄54251前言 1177321.1大黃介紹與功能主治 162461.2大黃瀉下成分 1164772大黃瀉下機(jī)理 3169162.1大黃瀉下傳統(tǒng)機(jī)制 3304732.2大黃瀉下新機(jī)制 5299673大黃瀉下藥效 67023.1大黃粗制劑及其不同制劑的瀉下作用 6263983.2炮制對大黃瀉下作用的影響 6255143.3游離型甙元對瀉效影響 7151504大黃瀉下臨床應(yīng)用 8119264.1大黃瀉下臨床應(yīng)用 85644.2中藥藥理研究思考 8273355結(jié)論 1032761參考文獻(xiàn) 1110259致謝 12第10頁1前言1.1大黃介紹與功能主治大黃為蓼科大黃屬植物，本屬植物約有60種，我國作為藥用有3種，為掌葉大黃、唐古特大黃和藥用大黃。我國應(yīng)用大黃已有悠久歷史，是常用中藥之一。近年來,在世界范圍內(nèi)。用大黃治療多種疾病并取得了良好的效果，對它的化學(xué)和藥理研究也取得了不少進(jìn)展。大黃性寒味苦,歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，功能為瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)，主治實熱便秘、積滯腹痛、瀉痢不爽、濕熱黃疸、血熱吐衄、目赤、咽腫、腸癰、癰腫疔瘡、瘀血經(jīng)閉、跌打損傷?，F(xiàn)代研究表明，大黃具有瀉下、利膽、保肝、抗胃和十二指腸潰瘍、止血、抗病原微生物、抗炎、解熱、利尿、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降脂、抗氧化等廣泛的藥理作用，涉及消化、血液、泌尿、免疫等多個系統(tǒng)。1.2大黃瀉下成分已知大黃瀉下成分約20種，包括蒽醌類和二蒽醌類以及它們的甙類。蒽醌甙類是大黃中最早被發(fā)現(xiàn)的瀉下成分。1965年[1]后，先后從掌葉大黃、雅黃、朝鮮和信州大黃中分離出番瀉甙A及其一系列結(jié)晶—番瀉甙B、C、D、E、F等，并證明具有很強(qiáng)的瀉下活性后，才認(rèn)識到大黃的主要瀉下成分為二蒽酮類化合物—番瀉甙。番瀉甙A、B、C、D、E、F的瀉下活性(小鼠ED50為13.3~16.1mg/kg)相似；8-葡萄糖-大黃酸蒽酮的作用也較強(qiáng)（ED50=20.0mg/kg)；8-葡萄糖-蘆薈大黃素(ED50=71.6mg/kg)，蘆薈-大黃素(ED50=59.6mg/kg)，大黃酸(ED50=97.5rng/kg)，8-葡萄搪-大黃酸(ED50=103.0mg/kg)等均較弱;而蒽醌類化合物大黃粉、大黃素、大黃素甲醚等幾乎沒有瀉下活性。綜合看,結(jié)合型的作用較強(qiáng),游離型則較弱。可見，大黃中的主要瀉下成分為番瀉甙，已知的幾個番瀉甙的瀉下效力相似，大黃酸的瀉下效力僅為番瀉甙的1/7~1/5。因此，現(xiàn)多以番瀉甙的含量來評定大黃質(zhì)量的優(yōu)劣。近年來日本學(xué)者又從大黃中分離到4個帶有碳式結(jié)構(gòu)的蒽酮甙類-大黃酸甙A、B、C、D。動物實驗表明，這類化合物具有很強(qiáng)的瀉下活性，可見大黃中還存在著一些未知的瀉下物質(zhì)。由上總結(jié)出，大黃中具有致瀉作用的主要成分是結(jié)合型蒽甙（有蒽醌甙，雙蒽酮甙，番瀉甙等），而游離型甙元（有大黃酸，大黃素等）只有微弱的致瀉作用。大黃又含有大黃鞣酸及其相關(guān)物質(zhì)（如沒食子酸、兒茶精等），此類物質(zhì)有止瀉作用。此外，大黃還含有脂肪酸、草酸鈣、葡萄糖、果糖和淀粉等。2大黃瀉下機(jī)理2.1大黃瀉下傳統(tǒng)機(jī)制1985年，山西省活血化淤研究所的高應(yīng)斗和李伯陽[2]實驗研究了大黃的致瀉作用及其作用機(jī)理，實驗研究證明，大黃本身對小腸無瀉下作用，而是因為口服大黃后由小腸吸收在體內(nèi)水解,釋放出蒽醌衍生物三羥甲基蒽醌(大黃素)和二羥甲基蒽醌等,其中以大黃素較為重要,大黃素再由大腸分泌進(jìn)入腸腔,大黃素刺激大腸,再加上未吸收的大黃到達(dá)結(jié)腸后也刺激大腸,使推進(jìn)性蠕動增加而引起排便,流程如圖1。 圖2-1大黃瀉下作用機(jī)制流程圖大黃的瀉下活性成分為蒽醌類衍生物，以酚或蒽醌的作用較強(qiáng)，其中以二蒽酮—番瀉貳的作用最強(qiáng)，游離型蕙醒只有微弱的瀉下作用。一部分研究者[1]發(fā)現(xiàn)，在口服大黃浸膏和番瀉甙后，出現(xiàn)明顯的瀉下作用，而直腸給予時，瀉下作用出現(xiàn)的時間比口服快得多，用氯霉素預(yù)先抑制消化道細(xì)菌后，口服番瀉甙的作用明顯減弱，靜脈注射番瀉甙元A的瀉下效力最強(qiáng)。由此推測，大黃的有效成分口服后，在消化道內(nèi)被細(xì)菌代謝為具有生物活性的代謝產(chǎn)物而發(fā)揮瀉下作用。進(jìn)一步研究證明，在哺乳動物消化道菌叢中，99%是厭氧菌，其中部分細(xì)菌如楔形梭狀芽孢桿菌具有β-葡萄糖甙酶活性，在與番瀉甙一起培養(yǎng)時，番瀉甙A量隨細(xì)菌生長不斷減少，同時8-葡萄糖大黃酸蒽酮則增加，12小時達(dá)高峰，此后迅速減少，而產(chǎn)生與之相當(dāng)?shù)目朔肿訑?shù)的番瀉甙元A。從而認(rèn)為蒽醌葡萄糖苷的二聚體一番瀉甙在還原酶作用下，裂解成單體8-葡萄糖大黃酸蒽酮，再經(jīng)β-葡萄糖甙酶水解成大黃酸蒽酮，并進(jìn)一步被氧化成番瀉甙元。可能大黃的瀉下作用是上述代謝物一方面直接刺激大腸局部或粘膜下神經(jīng)叢，使之蠕動加強(qiáng)，同時抑制Na+-K+ATP酶而抑制水分的吸收(可比正常時增加450%)，從而促進(jìn)排便。大黃發(fā)揮瀉下作用的另一途徑是番瀉甙由小腸吸收后，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化為甙元，再刺激骨盆神經(jīng)叢而引起大腸蠕動致瀉，同時一部分以原型或甙元隨血轉(zhuǎn)運(yùn)到大腸，刺激粘膜下神經(jīng)叢，隨后更深部肌肉的神經(jīng)叢，或奧厄巴赫氏神經(jīng)叢，而使腸運(yùn)動亢進(jìn)，引起瀉下。近代藥理研究[4]發(fā)現(xiàn)大黃素可促進(jìn)細(xì)胞膜去極化,縮短膜電位振蕩周期,增加峰電位發(fā)放頻率,從而顯著增加分節(jié)律收縮的幅值指數(shù)。在腸道平滑肌細(xì)胞膜有KV、KCa等多種鉀通道,大黃素的作用與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)能量代謝水平和降低膜對K+的通透性有關(guān)。朱金照等的大鼠研究結(jié)果表明大黃促進(jìn)腸道傳輸與血及空腸組織中MTL、SP的含量增加以及VIP的含量減少有著密切關(guān)系。MTL是從豬小腸私膜中提取分離出來的山個氨基酸組成的多膚,并證實MTL主要對胃腸道移行復(fù)合運(yùn)動起非常重要的調(diào)節(jié)作用。SP作為一種重要的胃腸膚,廣泛地分布于腸神經(jīng)系統(tǒng)和整個胃腸道,既可以激素的形式,亦可作為神經(jīng)遞質(zhì)參與胃腸運(yùn)動的調(diào)控。SP是胃腸運(yùn)動調(diào)節(jié)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),對胃腸道的興奮作用表現(xiàn)為對胃腸縱行肌和環(huán)行肌有雙重的收縮效應(yīng)。VIP是ENS中具代表性的神經(jīng)膚,也是重要的膚類神經(jīng)遞質(zhì)之一,研究已證明在胃腸運(yùn)動調(diào)節(jié)中主要起抑制效應(yīng)。大黃中鞣質(zhì)含量較高時具有收斂止瀉作用。當(dāng)服用小劑量大黃時,出現(xiàn)便秘而非瀉下,是由于所含鞣質(zhì)的收斂作用掩蓋了含量過少的瀉下成分對大腸刺激作用所致。同時鞣質(zhì)還能抑制大腸內(nèi)的胺生成酶,阻斷吲哚類的產(chǎn)生,引起便秘。由上述得出，大黃中具有致瀉作用的主要成分是結(jié)合型蒽甙，其中以番瀉甙作用最強(qiáng)，瀉下機(jī)制總結(jié)為：（1）刺激性瀉下作用：大黃口服后，結(jié)合型蒽甙大部分未經(jīng)小腸吸收而抵達(dá)大腸，在大腸被細(xì)菌酶（主要為β葡萄糖甙酶）水解生成甙元，甙元刺激腸黏膜及腸壁肌層內(nèi)的神經(jīng)叢，促進(jìn)腸蠕動而發(fā)揮致瀉作用。（2）膽堿樣作用：蒽酮具有膽堿樣作用，可興奮平滑肌上M膽堿受體，加快腸蠕動。（3）容積性瀉下作用：大黃抑制腸平滑肌上Na＋,K+-ATP酶，抑制Na＋從腸腔轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，使腸腔內(nèi)滲透壓升高，腸腔容積增大,機(jī)械性刺激腸壁，使腸蠕動加快。（4）部分原型蒽甙自小腸吸收后，經(jīng)過肝臟轉(zhuǎn)化，還原成甙元，由血液或膽汁運(yùn)至大腸而發(fā)揮瀉下作用。2.2大黃瀉下新機(jī)制隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，利用新理論和新技術(shù)可以從全新的視角去解釋大黃瀉下的藥理學(xué)機(jī)制。水通道(AQP)[12]是一組對水有高選擇性的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，結(jié)腸上皮細(xì)胞AQP表達(dá)豐富，AQPs表達(dá)異常可導(dǎo)致結(jié)腸對水的吸收減少和（或）腸液分泌增加，這可能是以結(jié)腸為主要藥理效應(yīng)部位的瀉下藥重要的效應(yīng)分子之一。通過對大黃功效與藥理和AQPs研究資料的分析，初步認(rèn)為大黃對結(jié)腸AQP的調(diào)節(jié)效應(yīng)可能是其“瀉下”功效的新機(jī)制，亦可能是大黃具有多重功效的原因所在。3大黃瀉下藥效3.1大黃粗制劑及其不同制劑的瀉下作用大黃因劑型及煎煮的時間不同，發(fā)揮的瀉效也不同，我國醫(yī)藥學(xué)指出,大黃生用瀉效強(qiáng),久煎則瀉效弱,主張煎藥時大黃應(yīng)后下。大黃煎劑有明顯瀉下效力，這種效力受加熱溫度和時間的影響，大黃加水回流1小時，其ED50由300增至520mg/kg?；亓?小時，作用幾乎消失。其熱水浸出液，在酸、堿條件下或50℃減壓濃縮，瀉下效力均不受影響。沸水浴常壓濃縮，其瀉下效力僅為原浸出液的1/3。瀉下效力隨加熱時間的延長而減弱，以煎沸30-60分鐘最理想。對這種現(xiàn)象有不同的解釋。野口等用測定大黃酸萄葡糖甙含量的方法證明，大黃熱水浸出13分鐘，其含量為原生藥的98.1%，加熱濃縮為原體積的1/2時，則只含原生藥的75.9%，由此認(rèn)為加熱使大黃水提取液瀉下效力降低是由于大黃萄葡糖甙含量減少之故。但高橋等在測定大黃煎劑和濃縮大黃湯劑的不同成分之后，發(fā)現(xiàn)加熱對瀉下主要成分番瀉甙的含量影響甚小，而對大黃酸甙的影響則較大。由此認(rèn)為加熱使瀉下效力降低，還有另外的原因。已知大黃中含有大量的鞣質(zhì)，這種鞣質(zhì)對胃腸運(yùn)動呈抑制作用。實驗中也觀察到大黃湯劑對小鼠的胃腸管初期呈運(yùn)動亢進(jìn)，后期呈運(yùn)動抑制，低濃度促進(jìn)，高濃度抑制?？梢姶簏S具有興奮和抑制胃腸運(yùn)動的雙重作用，這種作用的物質(zhì)基礎(chǔ)就是番瀉甙類和鞣質(zhì)。這兩類物質(zhì)在熱浸出液和煎煮液中均存在，浸和煎煮時間越長，溶出的鞣質(zhì)越多，溶出的鞣質(zhì)的類型亦不同。近來研究表明，晚上給藥致瀉作用強(qiáng)于白天，前者的ED50比后者大4.9倍(正常豚鼠、小鼠)和9.7倍(甲亢小鼠)，似有近似晝夜節(jié)律關(guān)系。可見，大黃作為瀉下藥用時，加熱溫度不宜過高，時間不宜過長，濃縮時以低溫減壓為好。為加強(qiáng)其瀉下效力，以除去鞣質(zhì)為最好。高應(yīng)斗和李伯陽[2]實驗研究結(jié)果顯示大黃以煎煮15分鐘者效果最好,其次是煎1小時、10分鐘和大黃粉煎煮5分鐘者效果最差，看來中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為大黃久煎則瀉效弱是對的,而大黃生用瀉效強(qiáng)是不對的,煎煮時間過短,瀉效作用也不夠強(qiáng),應(yīng)煎煮15分鐘瀉效最好,這點供臨床煎藥時參考。3.2炮制對大黃瀉下作用的影響中醫(yī)除生用大黃外，也用不同炮制品。大黃的瀉下作用由強(qiáng)到弱依次為生大黃>酒大黃>熟大黃>醋大黃>大黃炭。研究表明，生品及不同炮制品(除大黃炭外)均有瀉下效力，其中以生品的瀉下效力最強(qiáng)，口服后很快出現(xiàn)瀉下作用，且次數(shù)多，以稀便為主(生品ED50=0.18g/kg)。炮制后均有不同程度的減弱。酒炒、醋炒大黃效力降低30%，但瀉下作用出現(xiàn)的時間、次數(shù)與性狀與生品無明顯差別。酒燉大黃、清寧片效力降低95%左右，瀉下作用出現(xiàn)的時間和次數(shù)明顯推退和減少，多為軟便，但大黃炭幾乎無瀉下作用。這種瀉下效力的變化與所含瀉下成分(大黃酸甙和番瀉甙)的變化有關(guān)。酒炒、醋炒大黃所含的結(jié)合型大黃酸含量與生品相似，而酒燉、清寧片、酷煮及大黃炭的結(jié)合型大黃酸含量明顯減少，其瀉下效力也明顯減弱。番瀉甙含量的變化與瀉下效力呈平行關(guān)系，大黃酸則否。表明番瀉甙是大黃中主要瀉下成分之一。酒燉、醋燉大黃使番瀉甙的大量減少，可能是由于蒽環(huán)上的羥基在蒸煮過程中發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化—羥基氧化的結(jié)果。但酒炒、醋炒大黃，其番瀉甙含量未減少而瀉下效力仍減少30%左右，可能在加熱時破壞了大黃中的不耐熱瀉下成分或這些成分升華而丟失所致。大黃的不同炮制品可用于不同的情況，酒燉、醋燉大黃和清寧片由于瀉下作用緩和，不引起惡心、嘔吐、腹痛等副作用，適用于年老體虛者或慢性病長期服藥的患者。3.3游離型甙元對瀉效影響大黃中的游離型甙元無致瀉作用，是因為被小腸吸收,沒有到達(dá)大腸,因此，避免游離型甙元被小腸吸收可以增強(qiáng)大黃瀉下作用。2008年，閔光寧[5]等人進(jìn)行了大黃中游離蒽醌瀉下作用的初步實驗研究，實驗中將大黃提取物游離蒽醌通過結(jié)腸直接給藥,避免了小腸對它的吸收,使藥物在結(jié)腸直接發(fā)揮作用。給藥后用于實驗的燥結(jié)便秘型小鼠的首便時間明顯縮短,說明通過結(jié)腸給予大黃游離蒽醌起到了明顯的瀉下作用。此法，可提高藥效,降低給藥劑量,節(jié)約大黃資源。同時,通過將游離型蒽醌結(jié)腸定位給藥,使藥物在結(jié)腸定位釋放,可以更好的發(fā)揮藥物瀉下作用。4大黃瀉下臨床應(yīng)用4.1大黃瀉下臨床應(yīng)用大黃瀉下臨床用于治療腸梗阻、便秘、積聚，以及用于加速毒物排泄和解毒[7]：單味大黃及復(fù)方大黃對急性腸梗阻有效。治療陽明腑實證，配伍厚樸、枳實、芒硝即大承氣湯，具有緩下熱結(jié)的作用。大承氣湯加減可用于陽明腑實有兼證的治療，如厚樸七物湯用于外感表證未罷，里實已成之證；加味承氣湯用于淤血內(nèi)停、胸腹脹痛或大便不通之證；消導(dǎo)承氣湯用于食積所致腸梗阻；驅(qū)蛔承氣湯用于蟲積阻塞所致腸梗阻；大柴胡湯用于少陽、陽明合病的治療。若熱積便秘兼津液虛虧則用大黃配五玄參、麥冬如增液承氣湯治療。積聚：脾積用雞盹皮飲治療。小兒疳癥用大黃配伍桃仁、梔子、皮硝、杏仁治療。用于排毒、解毒：誤服毒物入腸后，不可能馬上完全吸收，可口服大黃、當(dāng)歸、明礬、甘草的水煎液導(dǎo)瀉，使毒物盡快排出體外。若口服導(dǎo)瀉藥物仍不能使毒物完全排出者，可用大黃適量煎水200-500ml灌腸。已吸收毒物的排泄與解毒：用大黃與甘草水煎口服，或用綠豆甘草解毒湯（大黃、綠豆、生甘草、丹參等）水煎口服以利尿解毒。4.2中藥藥理研究思考大黃狹義的“瀉下”功效，并不等同于西藥瀉藥的“導(dǎo)瀉”作用，“瀉下”功效遠(yuǎn)非一個“導(dǎo)瀉”、“通便”作用所能解釋的。例如，有人通過統(tǒng)計學(xué)方法，對以往的瀉下藥藥理研究進(jìn)行綜合和提煉，發(fā)現(xiàn)中藥的“瀉下”與導(dǎo)瀉、興奮胃腸平滑肌、止血和利尿等4種藥理活性相關(guān)。而目前對瀉下藥的瀉下功效，大部分只局限于“導(dǎo)瀉”作用，其他相關(guān)作用研究尚未展開。至于瀉下藥的“瀉下”、“清熱”、“利水”等諸多功效之間的綜合研究，更是缺乏。大黃作為瀉下藥不同于西藥中的瀉藥，“瀉下”功效不能局限于“導(dǎo)瀉”作用與西藥瀉藥一般只用于治療便秘不同，大黃在臨床上除用于通便外，其適應(yīng)證相當(dāng)廣泛，可用于治療急性腸梗阻、急性胰腺炎、急性膽囊炎等急腹癥，上消化道出血、咯血、衄血等出血性疾病，急性扁桃體炎，急性黃疸型肝炎，急性肺炎，腎功能衰竭，急性腸炎和菌痢，急性腦出血，高脂血癥，跌打損傷，燒燙傷等疾病，甚至廣泛用于減肥產(chǎn)品中。因此，人們早已認(rèn)識到其藥理作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于西藥瀉藥?？傊?，中藥的一個功效可能包含了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的多個藥理作用；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一個藥理作用也可能支撐中藥的多個功效。因此，中藥藥理研究必須始終以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，這是中藥藥理研究中必須堅持的原則。5結(jié)論大黃為中藥瀉下藥的代表藥,在大量的文獻(xiàn)中大黃瀉下的有效成分主要為番瀉甙和大黃酸甙,它們都為結(jié)合蔥醒。番瀉甙、大黃酸甙本身并不具有瀉下作用,口服后在結(jié)腸內(nèi)經(jīng)細(xì)菌代謝轉(zhuǎn)化為大黃酸蒽酮、大黃酸,后兩者才是真正的瀉下活性成分,直接作用于結(jié)腸,產(chǎn)生瀉下作用。研究證明大黃的瀉下作用主要在大腸,能使中遠(yuǎn)端結(jié)腸的張力增加,蠕動加快。黃中具有致瀉作用的主要成分是結(jié)合型蒽甙，其中以番瀉甙作用最強(qiáng)。瀉下機(jī)制為大黃口服后，結(jié)合型蒽甙大部分未經(jīng)小腸吸收而抵達(dá)大腸，在大腸被細(xì)菌酶（主要為β葡萄糖甙酶）水解生成甙元，甙元刺激腸黏膜及腸壁肌層內(nèi)的神經(jīng)叢，促進(jìn)腸蠕動而發(fā)揮致瀉作用；蒽酮具有膽堿樣作用，可興奮平滑肌上M膽堿受體，加快腸蠕動；大黃抑制腸平滑肌上Na＋,K+-ATP酶，抑制Na＋從腸腔轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，使腸腔內(nèi)滲透壓升高，腸腔容積增大,機(jī)械性刺激腸壁，使腸蠕動加快；部分原型蒽甙自小腸吸收后，經(jīng)過肝臟轉(zhuǎn)化，還原成甙元，由血液或膽汁運(yùn)至大腸而發(fā)揮瀉下作用。大黃瀉效強(qiáng)弱受煎煮時間影響，瀉效最強(qiáng)煎煮時間需定性實驗測得。大黃炮制后瀉效均有不同程度的減弱，不同炮制品可用于不同的情況。將游離型蒽醌直接結(jié)腸定位給藥,可以更好的發(fā)揮藥物瀉下作用。大黃瀉下臨床用于腸梗阻、積聚以及排解毒物。而大黃作為中藥瀉下藥，藥理作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于西方瀉藥。參考文獻(xiàn)[1]陳瓊?cè)A,高士美,杜學(xué)芳,等.中藥大黃的綜合研究Ⅳ:大黃蔥釀衍生物在體內(nèi)的吸收、排泄和分布[J].藥學(xué)學(xué)報,1963,10(09).[2]高應(yīng)斗,李伯陽,陳波.大黃的致瀉作用及其作用機(jī)理[J].山西醫(yī)藥雜志,1