利用小隨體多重CR和帶型鑒別釀酒酵母菌株

第一學(xué)習(xí)小組段志峰朱江邢英超刁文濤馮延賓張熠唐亦辰黃云何驍男利用微衛(wèi)星多重PCR和帶型分析鑒別釀酒酵母菌株摘要我們提出了一種利用多重PCR對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性分析快速鑒別釀酒酵母菌種的方法。無需使用苯酚，簡單提取DNA，利用多重PCR擴(kuò)增SC8132X,YOR267C和SCPTSY7位點(diǎn)，用瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行帶型分析，這種方法可使我們區(qū)分30種商用葡萄酒釀酒菌種。該方法被成功應(yīng)用于一項(xiàng)在15和20攝氏度這兩個(gè)發(fā)酵溫度下檢驗(yàn)兩個(gè)菌株間的顯性關(guān)系的生態(tài)學(xué)研究中。這種方法在釀酒和酵母生產(chǎn)工業(yè)中常規(guī)的低成本檢測酵母菌株的過程中應(yīng)該有應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星，PCR，酵母菌株，葡萄酒，發(fā)酵1.前言使用選育出的用于酒精發(fā)酵的酵母菌株釀造葡萄酒是現(xiàn)在普遍使用的一種方法。酵母對(duì)葡萄酒的質(zhì)量尤其是口味有很大的影響（現(xiàn)代的釀酒學(xué)家發(fā)現(xiàn)用不同的酵母菌株發(fā)酵可以使葡萄酒產(chǎn)生不同的特點(diǎn)。這導(dǎo)致了具有多種特色并可以應(yīng)用于不同領(lǐng)域的選育菌株工業(yè)生產(chǎn)化?，F(xiàn)在市場上提供了幾百種葡萄酒菌種，它們幾乎都屬于釀酒酵母菌屬。與此同時(shí)，人們對(duì)發(fā)明快速而且精確檢測酵母菌株的方法也產(chǎn)生了興趣。在葡萄酒釀造中，它的應(yīng)用包括確定接種菌株對(duì)在未發(fā)酵葡萄汁中野生菌株的顯性優(yōu)勢，實(shí)時(shí)記錄發(fā)酵中的菌株動(dòng)態(tài)過程，控制菌株生產(chǎn)的質(zhì)量并鑒別無效菌株。釀酒時(shí)，選育出的菌株被接種于富含野生釀酒酵母和非釀酒酵母的葡萄汁中?？焖勹b別酵母菌株的方法應(yīng)該考慮到菌群生長動(dòng)態(tài)的觀察，選育菌株的顯性優(yōu)勢和環(huán)境因素對(duì)酵母菌株的影響。在葡萄酒發(fā)酵，溫度是影響酵母動(dòng)力學(xué)的一個(gè)主要因素（FleetandHeard,1993）;生態(tài)研究也顯示出了釀酒酵母菌株的不同行為。(Epifanioetal.,1999;Torijaetal.,2003).訊事實(shí)側(cè)上，爬釀酒朵商要蓬求菌絕株的訊一個(gè)踏突出苦特點(diǎn)咳是能牧夠在胡特定跟的溫走度下挨進(jìn)行摔良好局的發(fā)辣酵反貸應(yīng)。冊很多隨時(shí)候查，在舅一個(gè)卡典型該的發(fā)盈酵白續(xù)葡萄廉，發(fā)感酵溫雨度甩應(yīng)煙保持總18難攝氏撫度穗，但畏達(dá)到呢12倍-1驗(yàn)5葵攝氏艘度也妨不少秤見嘗，專從而堵提高剛調(diào)味那品酯隔的含軋量并隆減少浙高酒板精形搬成。歲在此喉溫度腫下六，經(jīng)許常會(huì)緞發(fā)生走發(fā)酵胞停滯午，因北此，運(yùn)在這日種狀織況下液，選棗育菌山種的小低溫濕代謝防能力駝和對(duì)積野生鉆菌種基的顯磚性優(yōu)顯勢備情受重犧視。眨在過將去的軍幾年耽中，滴研究鼓側(cè)重經(jīng)于用屋分子糊生物讓學(xué)剛方法裁進(jìn)行夜菌株走分化柜（B玉eh喚et肉a靜l.瓣,謙20睡06達(dá)）坡，如蝴染色單體分宗析法洞（C茶ar共le奉a伏nd置O疏ls推on否,1歉98集5;圖B辛lo式nd司in持a古nd樂V昆ez況in慶he鋪t,棟1熱98銷8）大和限鞠制性透片段偉長度謀多態(tài)芝性（府R附FL奪P娃）分家析m河DN冰A男（樸Qu陶er備ol至et疤a產(chǎn)l.蝶,摘19辯92欄）歷，以腹及基南于P果CR啄的方眉法，嘆其中奶包括測內(nèi)部看轉(zhuǎn)錄泄序列乞（疤IT卡S爬）的棟核糖籍體D勢NA那測冬序（載Mo皆nt黎ro陡ch崖er藏e猜t騰al捕.,永1識(shí)99泳8翻）夸，村δ元存件插橋入位享點(diǎn)的脆多態(tài)若性消（克Ca盟me成ro跑n慨et悅a考l.切,仗19完79告;N拘es醒s頓et伶a藝l.長,悼19析93錘）著，擴(kuò)雨增片淚段長頌度多紀(jì)態(tài)性隙（次AF收LP潑）神的（沉De恥B跡ar厲ro似s夠Lo霜pe夏s要et頂a乘l.膠,摧19亮99鍬）笑，隨富機(jī)擴(kuò)青增多線態(tài)性祖DN協(xié)A推（麥RA登PD悉）夜（恩Ba圾le昏ir尿as糕-C麻ou案to虧e銳t齊al演.,篩1撇99菌6起）傘，駝內(nèi)含客子剪猛接序砍列擴(kuò)旋增（凡De慣B較ar吃ro任s饅Lo軋pe誘s巡et巾a讓l.草,點(diǎn)19粱96鄙）及址PC扯R內(nèi)供含的圾線粒徹體基頑因（膏Lo堤′郊pe照z騎et狂a與l.巷,適20屢03穴）提。律這些戰(zhàn)方法撥在關(guān)式于分丸辨率航和處例理時(shí)油間方村面對(duì)武經(jīng)典圈生理盞學(xué)實(shí)謹(jǐn)驗(yàn)起患到了音增強(qiáng)姜作用兆，但照是其憑中一臘些方綢法還撞有些蓬限制如條件產(chǎn)，因由為它棗們幾艱乎不煮能應(yīng)陳用于答日常工的分陶析中扣，或肢者當(dāng)貼它們測容易告實(shí)施批時(shí)，役它們肺并不穗能在斯菌種俊水平陸上完創(chuàng)全區(qū)各分這業(yè)些菌印株。杏此外想，在慚一些明方法訓(xùn)中，崗如δ腰元件暴分型獻(xiàn)和R侄AP報(bào)D，騰其重隱現(xiàn)性夜取決山于D焦NA弓模板望的純且度和廚濃度借。(隆Fe比rn艦a′湊n饅de已z-愧Es答pi予na姥r驅(qū)et極a守l.會(huì),紋20留01女;潑Be好h旨et汁a宏l.沙,愧20籍06抹)。下這些秧缺點(diǎn)拔意味凱著花悉費(fèi)大響量時(shí)紛間和灶資金閘進(jìn)行名DN爸A清憑理步疫驟，茫在某示些情丑況下年還需害要刊幾步遙反應(yīng)卡，刻以評(píng)倍估非奪重復(fù)彼性帶厚型發(fā)給生的處可能滾性優(yōu)。景基于返具有皆長度朱多態(tài)煌性的園簡單眨序列刪重復(fù)事基因蓄位點(diǎn)開分散誦在整惰個(gè)基絞因組府中駁，司微衛(wèi)柜星捏分析襯已成曾功地居被用朵來宗區(qū)分稀酵母搜菌株惰（慌Fi級(jí)el算d弟an鼓d餃Wi乖ll雜s,蔑1鴿99似8;博Go惜nz案al巷ez椒T裙ec豎he暫ra砌e神t驕al戰(zhàn).,丟2郊00眠1;諒P爪e′慰re妄z農(nóng)et擔(dān)a祥l.攀,奪20船01地;晨He適nn枕eq張ui訊n踩et敬a佛l.癢,朵20四01照;飽Ma尚l(wèi)g鈴oi再re持e港t餐al魄.,烏2贏00壟5搏）。剝最近辛，利鄙用對(duì)待具高艱度多追態(tài)性弊的惕微衛(wèi)拌星沖位點(diǎn)陽的多歸重P弊CR粱方法往可以派分離劑一系紀(jì)列商腫用酵趣母菌閥株移(吼Sc憶hu梯ll情er傘e暮t舅al欠.,局2溪00起4;伸Br約ad鑰bu選ry壯e豎t扛al母.,犧2唇00閱5;沿L附eg嗓ra缺s梁et蒙a膨l.虜,遙20榨05召)跨。博微衛(wèi)敗星捧位點(diǎn)濫PC躬R高氣辨別詠能力榴以及艇其穩(wěn)賊定性受和實(shí)蛛用性狠使其共成為店區(qū)分僑酵母柔菌種凍最受槐歡迎準(zhǔn)的方唇法之井一。誕這個(gè)的方法燒用于賞常規(guī)瞞檢測困的瓶摩頸發(fā)執(zhí)生在食擴(kuò)增瞞子分以析的第步驟秘：利鼠用聚眉丙烯區(qū)酰胺劑凝膠糕及測足序分決析儀袖確定童擴(kuò)增掩子的總大小炒較為虛費(fèi)時(shí)議費(fèi)力縮。為星了避底免這睛個(gè)限負(fù)制，套有人貪提出別利用杜簡單魄的高鄉(xiāng)張力鄉(xiāng)瓊脂鐵糖凝冊膠電鐘泳（紹Ro擊ut擇ma慕n童an待d抽Ch止ev陷er康ud剩,闖19淺94劇;F鈴er壺ra策ro嘴e搖t刊al特.,賽1馬99脅8)狼。挺最近狐，睛Ho勸we術(shù)ll籠等心人（嶺20可04俗）建憂議利它用對(duì)攻SC能81艘32乞X叫位構(gòu)點(diǎn)的腹PC絕R擴(kuò)聲增和蠻聚丙部烯酰汁胺凝糠膠加儀EB鹿染色扇電泳威來進(jìn)綁行釀辣酒酵味母的經(jīng)分型西。深為了方建立處一種面快速功精確芹并且浴甚至糖適用宇于那毅些低振預(yù)算蟲高通擺量實(shí)陶驗(yàn)室兇的鑒鍵別菌扭種的饞方法位，我偉們對(duì)艦3個(gè)群高多撞態(tài)性悄微衛(wèi)鄙星逐位點(diǎn)販的多裹重?cái)U(kuò)格增（承Go港nz摩al剃ez缺T瘡ec憐he憶ra駐e莊t圍al倘.,鳴2展00斗1雕），菊然后躍用瓊盤脂糖身凝膠芬電泳奶進(jìn)行漁帶型舌分析通。掠作為穩(wěn)第一我步第，園我們許對(duì)一園組2居9種蓄商用串酵母拌菌株蓋進(jìn)行責(zé)測試甜，另連加一洲釀酒摘酵母平菌株及作為幫參考伍，以廉檢查繞該方沿法的叛鑒別成能力狀。然唉后，兩我們酬在測底試貧發(fā)酵謊溫度屢對(duì)共牧接種危的兩運(yùn)個(gè)選肯育菌激株的磚生長鹿速率搭和競寫爭能拐力的奧影響孕的實(shí)易驗(yàn)中范檢查競了這探種方摘法的興實(shí)際吐適用宇性。悲2.頸材料紹與方溜法配2.投1酵訂母菌手株和帶培養(yǎng)倉基下釀酒共酵母兵菌株葵采購招于釀?lì)~酒酵繡母生脊產(chǎn)商仍。釀畜酒酵輔母菌視株見侍表1屯。酵警母菌真模式療菌株松（C粘BS慧1筋17烤1）鉤從慕CR歲A-印Is悄ti戲tu叫to酬S閑pe吧ri工me私nt戒al戀e朱pe銳r解l叫’咐En筑ol與og吃ia孔o(hù)f弓A爛st涂i,豪I陵ta型ly疊(繭IS層E)鉆的收擾集品績中獲沸得。襪商用妨干菌壽株懸劃浮于懼無菌霜5%遞的蔗梨糖液耍體培蠻養(yǎng)基貼中，培40吼攝氏揪度下徒放置伴30疲分鐘培，稀鞠釋，盈然后娃涂布熔于Y水MA位平板蹲(1晚0g圈/惱L兼葡萄面糖旅,岸5g燙/刮L提蛋白基胨差,揮3g番/L疼酵母晝浸出檔物籌,冰3g唐捎/炸L架麥態(tài)芽膏怪和籍20暢g悅/當(dāng)L賴瓊脂經(jīng)),瓣然后貓?jiān)?哥4攝埋氏度艦下培好養(yǎng)4詞8小叔時(shí)。洗2.鏟2診DN骨A抽段提蘆嗚定在第側(cè)一步蓋檢驗(yàn)扣這種疊方法豪的鑒舍別能嘩力時(shí)境，我察們用錦Ha崗rj離u脹等人企（2賀00循4）歉的方岸法溫抽提價(jià)DN牲A。黑簡單制的說該，將憶單個(gè)徑菌落折重懸細(xì)浮于竹20李0m陸l的態(tài)ly藍(lán)si繳s忌bu勻ff籃er儀(2捏%蹦(w袍/v道)賽Tr饒it撥on晴X-彎10歉0,落1杏%蠢(w多/v逝)記SD育S,桑1暫00處m蠢m(xù)o待l版L_吸1淹Na錦Cl府,荷10經(jīng)m濱mo穴l板L_火1T端ri洲s泡–龜HC騰l罵pH乒8庭.0為,辭1辱mm荷ol漠L對(duì)_1聾E算DT良A毀pH油8朋.0巨)廳中。必這些鄭試管漂放置銜于-隸80懇度冰疏箱中嫂3分刻鐘（類直到呼完全厭凍住發(fā)），盟然后皇在炊9汽5攝兄氏度慶下于機(jī)Th木er秤mo揉mi嘆xe殃r（阻Ep扒pe妹nd閑or張f狼AG桶,汗Ha風(fēng)mb沸ur墻g,陪G亦er班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