實驗一 培養(yǎng)基的配制和滅菌

實驗一培養(yǎng)基的配制和滅菌第一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二一、目的要求了解培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。

了解幾種滅菌方法，重點掌握高壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。第二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二二、基本原理培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無機鹽、生長因子以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長繁殖還必須在最適酸堿度范圍內(nèi)才能表現(xiàn)它們最大生命力，因此不同種類的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)到一定pH值范圍。培養(yǎng)基種類很多，不同的微生物所需培養(yǎng)基不同。按其組成可分合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。按其物理狀態(tài)可分固體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。按其特殊用途可分加富培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制后還必須進行滅菌。滅菌和消毒是二個不同含義的名詞。消毒是指消滅病原菌或有害微生物，而滅菌則是殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物。消毒與滅菌的方法很多，但總的可分為物理法與化學(xué)法兩大類。物理法包括加熱滅菌（干熱滅菌與濕熱滅菌），過濾滅菌、紫外線滅菌等?；瘜W(xué)方法主要是利用有機或無機的化學(xué)藥品對實驗室用具和其它物體表面進行滅菌與消毒。

第三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二三、實驗分組與任務(wù)整個班分10個組，一排為一組，每組六人第1-2組：配制200ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,分裝成15支試管，每支試管裝液量為試管高度的四分之一第3-4組：配制200ml葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝成15支試管，每支試管裝液量為試管高度的四分之一第5-6組：

配制200ml乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝成15支試管，每支試管裝液量為試管高度的四分之一第7-8組：

配制150ml明膠培養(yǎng)基，分裝成15支試管，每支試管裝液量為試管高度的四分之一第9-10組：配制300ml淀粉培養(yǎng)基。用兩個三角瓶裝好第四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方（見實驗課本214頁）2、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方（見實驗課本217頁）3、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方（見實驗課本217頁）4、明膠培養(yǎng)基配方（見實驗課本217頁）5、淀粉培養(yǎng)基配方（見實驗課本217頁）四、各培養(yǎng)基的配方第五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二四、實驗內(nèi)容（一）、培養(yǎng)基的配制：同學(xué)們先將試管貼好標(biāo)簽。注明培養(yǎng)基名稱，日期。標(biāo)簽粘貼位置在離管口1/3管身處。

注意：標(biāo)簽用鉛筆書寫，以防高溫滅菌時蒸汽模糊字跡

操作圖示：第六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二第七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二3．注意事項：在配制培養(yǎng)基時一定要注意調(diào)溶液的pH。稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再取另一種藥品。瓶蓋也不要蓋錯。在燒杯融化瓊脂的過程中，人要在電爐旁看著，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出燒杯。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。注意帶上棉紗手套防止?fàn)C傷。分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。四、實驗內(nèi)容第八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二（二）培養(yǎng)基滅菌培養(yǎng)基分裝好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮紙，便可滅菌。滅菌的時間和溫度按各培養(yǎng)基規(guī)定進行，以保證滅菌效果和不損壞培養(yǎng)基的必要成分。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，可放在37恒溫箱培養(yǎng)24小時，無菌者方可使用。在實驗室里用得最多的加熱滅菌法是高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌。一般培養(yǎng)基和滅菌水等用高壓蒸汽滅菌，而玻璃器皿常用干熱滅菌。蒸汽滅菌為105-121℃，15-20分鐘，干熱滅菌為160-170℃，1-2小時。目的都是使細菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。

在同一溫度下，濕熱殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固，同時濕熱穿透力強，而且當(dāng)蒸汽與被滅菌物體接觸凝成水分時，又可放出熱量，使溫度迅速增高，從而增加滅菌效力。四、實驗內(nèi)容第九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二四、實驗內(nèi)容高壓蒸汽滅菌法其步驟如下：

1.滅菌器內(nèi)加入一定量的水，將包扎好的物品放入其中。

2.接通電源，進行加熱

3.排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待排出大氣后關(guān)閉排氣閥；或關(guān)閉排氣閥，待壓力上升到0.5kg/cm2時再打開排氣閥，待壓力回復(fù)到0時再關(guān)閉排氣閥。

4.當(dāng)壓力達1.05kg/cm2時，此時滅菌器內(nèi)的溫度為121℃，維持30min。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長時間。

5.滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品第十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二五、實驗報告思考題：培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件?

在培養(yǎng)基配制操作過程中應(yīng)注意什么問題?為什么?

培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的?

高壓蒸汽滅菌前為什么要將滅菌鍋內(nèi)的冷空氣排盡?

玻璃器皿為什么在滅菌前要先行干燥?

加熱蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌所要求的溫度低、時間短？第十一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二實驗

大分子物質(zhì)的水解實驗

及糖發(fā)酵實驗第十二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二一、實驗?zāi)康?.證明不同的微生物對各種有機大分子的水解能力的不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2.掌握進行微生物大分子水解實驗的原理和方法3.了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細菌鑒定中的重要作用4.掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法第十三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二二、實驗原理微生物代謝與其他生物代謝有著許多相似之處，也有不同之處。微生物代謝重要特征之一，就是代謝類型的多樣性，因此使得微生物在自然界的物質(zhì)循環(huán)中起著重要的作用，同時也為人類開發(fā)利用微生物資源提供更多的機會與途徑。人們在微生物的分類鑒定工作中，常利用其生理生化反應(yīng)作用作為重要依據(jù)。本實驗分別安排微生物對生物大分子的分解利用（淀粉水解實驗水解試驗、明膠液化試驗），對含碳化合物的分解利用（糖發(fā)酵試驗）讓同學(xué)們對微生物的代謝類型多樣性有一個初步和感性的了解，同時學(xué)習(xí)利用微生物形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及生化反應(yīng)的特征對某些細菌進行初步的分類。本實驗學(xué)習(xí)平板接種法、穿刺接種法、液體接種法。第十四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二三、實驗材料

1．培養(yǎng)基：淀粉水解培養(yǎng)基：2皿明膠液化培養(yǎng)基：2支葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：3支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基：3支2.接種用具：接種環(huán)（針、鉤），酒精燈，鑷子，消毒棉球，打火機，標(biāo)簽貼紙，廢物杯，紙巾，油性筆。3.實驗菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌第十五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二四、實驗內(nèi)容試驗名稱培養(yǎng)基名稱接種菌名稱接種方式每組個數(shù)淀粉水解淀粉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌/大腸桿菌

平板2明膠水解明膠培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌/大腸桿菌穿刺2葡萄糖發(fā)酵葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基大腸桿菌和變形桿菌液體3乳糖發(fā)酵乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基大腸桿菌和變形桿菌液體3第十六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二四、實驗內(nèi)容（1）將固體淀粉培養(yǎng)基溶化后冷卻至50℃，無菌操作制成平板（2）用記號筆在平皿背面劃成兩部分。（3）將枯草芽孢桿菌，大腸桿菌分別在不同的部分劃線接種，并在平板的反面分別記下兩部分的菌名。（3）將接完種的平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。（4）觀察結(jié)果時，可打開皿蓋，滴加少量的碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)，是碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，則說明淀粉已被水解，為陽性。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的強弱，即產(chǎn)生胞外酶活力的高低。（以“+”、“—”表示有無透明圈）操作步驟：1.淀粉水解試驗：（2皿）第十七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二四、實驗內(nèi)容（1）取兩支明膠培養(yǎng)基試管，用記號筆標(biāo)明各管欲接種菌的菌名。（2）用接種針分別以穿刺接種法接種枯草芽孢桿菌和大腸桿菌于對應(yīng)的明膠培養(yǎng)基中。（2）接種后置于20℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2-5d。（3）觀察結(jié)果時，注意培養(yǎng)基有無液化現(xiàn)象。（以“+”、“－”表示有無液化現(xiàn)象）注意：如果細菌在20℃時不能生長，則必須培養(yǎng)在所需的最適溫度下，觀察結(jié)果時需將試管從恒溫箱里取出，置于冰浴中，才能觀察液化程度。2.明膠液化試驗：第十八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二四、實驗內(nèi)容（1）用記號筆在各試管外壁上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的菌名。（2）取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，以液體接種的方式分別接種變形桿菌和大腸桿菌，第三支不接種，作為對照。另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，同樣分別接入變形桿菌和大腸桿菌，第三支不接種，作為對照。接種后，輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小試管進入氣泡。（3）將接種過和作為對照的6支試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。（4）觀察結(jié)果時，看各管顏色變化及杜氏小管有無氣泡。3.糖類發(fā)酵試驗：第十九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二圖糖類發(fā)酵試驗

第二十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期二五、實驗報告菌名淀粉水解試驗明膠液化試驗枯草芽孢