實驗三離心技術及酶學實驗

實驗三離心技術及酶學實驗第一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二概念生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒(細胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離的一種技術。沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度，離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備。第二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二第一節(jié)基本原理離心力當一個粒子(生物大分子或細胞器)在高速旋轉下受到離心力作用時，此離心力“F”由下式定義，即：第三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二相對離心力（RCF）通常離心力常用地球的引力的倍數(shù)來表示，所以稱為相對離心力。在離心場中，作用于顆粒的離心力相當于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度g（980cm/s2）。第四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二

∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2r(rpm-revolutionsperminute為每分鐘轉數(shù)，r/min)低速離心時常以轉速“rpm”來表示高速離心時則以“g”表示第五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)離心機的主要構造和類型

工業(yè)用離心機離心機制備性離心機實驗用離心機分析性離心機第六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二一、制備性離心機的三類1．普通離心機：最大轉速6000rpm左右2．高速冷凍離心機：最大轉速為20000～

25000rpm（r/min）3．超速離心機：轉速可達50000～80000rpm，超速離心機裝有真空系統(tǒng)，這是它與高速離心機的主要區(qū)別。第七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二二、轉頭1．角式轉頭

第八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二2．蕩平式轉頭：

這種轉頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶(離心套管)構成。

3．區(qū)帶轉頭：

區(qū)帶轉頭無離心管，主要由一個轉子桶和可旋開的頂蓋組成。

4．垂直轉頭：

其離心管是垂直放置的。

5．連續(xù)流動轉頭：

轉頭與區(qū)帶轉頭類似，由轉子桶和有入口和出口的轉頭蓋及附屬裝置組成。第九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二三、離心管

塑料離心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能較好。塑料離心管的優(yōu)點是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺點是易變形，抗有機溶劑腐蝕性差，使用壽命短。第十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二不銹鋼管強度大，不變形，能抗熱，抗凍，抗化學腐蝕。但用時也應避免接觸強腐蝕性的化學藥品，如強酸、強堿等。離心管蓋離心前必須蓋嚴，配平時需帶管蓋重量防止樣品外泄、揮發(fā)支持離心管，防止離心管變形第十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二制備性超速離心的分離方法差速沉降離心法逐漸增加離心速度，或者低速、高速交替進行離心，使不同的離心速度及不同離心時間下分批分離的方法。用途：分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒優(yōu)點：操作簡便缺點：分理效果差，顆粒受擠壓易變性失活第十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二密度梯度區(qū)帶離心法（區(qū)帶離心法）定義：將樣品加在惰性梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。優(yōu)點：分理效果好、適應范圍廣、顆粒不會擠壓變形保持活性缺點：離心時間長、需制備惰性梯度介質溶液、操作嚴格不易掌握第十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二五、離心操作的注意事項使用各種離心機時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內容物，轉頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當轉頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉頭中，以便使負載均勻地分布在轉頭的周圍。每個轉頭各有其最高允許轉速和使用累計期限，使用轉頭時要查閱說明書，不得過速使用。第十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機的具體操作說明進行，根據(jù)待離心液體的性質及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉頭不平衡、生銹或被腐蝕;而制備性超速離心機的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。若要在低于室溫的溫度下離心時。轉頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉頭室內預冷。離心過程中不得隨意離開第十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二實驗內容酶的提取及比活性測定第十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二一、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)的分離純化及比活性測定

[目的]1．掌握AKP分離純化的實驗原理、方法及注意事項

2．了解檢測AKP活性測定的原理和方法。第十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二方法酶的本質：蛋白質鹽析法有機溶劑沉淀法層析法電泳第十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二酶組織細胞：先破碎細胞，再用一定的試劑提取體液：直接提取方法物理方法化學方法第十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二原則制備的原料初期采用、后期采用方法影響因素第二十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二影響因素pH：最適pH溫度：低溫時酶比較穩(wěn)定，有機溶劑需預冷氧化：－SH對某些酶的活性必需，加入還原劑重金屬離子污染：與－SH發(fā)生作用而失活：EDTA蛋白酶的污染，PMSF、DFP介質的極性和離子強度：疏水最穩(wěn)定pH第二十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二評估指標酶的純度－－用比活性代表定義：單位重量（mg）蛋白樣品中所含酶的活性單位表示方法：每mg蛋白質所具有酶的活性單位測定方法：①每ml樣品中的蛋白質mg數(shù)②每ml樣品中酶的活性單位酶的活性單位：酶促反應在單位時間（秒、分鐘、小時）內生成一定量的產物或消耗一定量的底物所需要的酶量。第二十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二酶的回收率提取純化過程中雜蛋白逐步去除，同時伴隨部分酶的損失。在保證純度的前提下，應盡可能提高酶的收率。第二十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二

[原理]

機械破碎法制備肝勻漿

勻漿液低濃度醋酸鈉：低滲破膜

低濃度醋酸鎂：保護和穩(wěn)定AKP

有機溶劑沉淀法分離純化AKP

加入不同有機溶劑，重復離心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白質

33％丙酮(30％乙醇)：AKP溶解

50％丙酮(60％乙醇)：AKP不溶解

(一)堿性磷酸酶的分離提純

第二十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二[操作步驟]

25g肝組織剪碎

+0.01M醋酸鎂-醋酸鈉溶液75ml，勻漿機中勻漿取肝勻漿4ml(A液）A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性A2：取0.1mlA液+4.9ml生理鹽水，待測蛋白濃度

+2ml正丁醇，混勻2min，室溫置30min，離心（2500rpm)5min下清液（吸?。┏恋恚墸?/p>

+等體積丙酮，離心（2000rpm)5min

上清液（棄）沉淀

+0.5M醋酸鎂2ml溶解（B液）第二十五頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二[操作步驟]

B液

+95%冷乙醇至30%，離心（2500rpm）5min上清液（吸?。┏恋恚墸?/p>

+95%冷乙醇至60%，離心（2500rpm）5min上清液（棄）沉淀

+0.01M醋酸鎂-醋酸鈉2ml,溶解（C液）

C1：取0.1mlC液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性

C2：取0.1mlC液+0.1ml生理鹽水，待測蛋白濃度

B1：取0.1mlB液+1.9mlpH8.8Tris緩沖液，待測比活性B2：取0.1mlB液+0.9ml生理鹽水，待測蛋白濃度第二十六頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二加入有機溶劑計算公式設加入Xml95%乙醇※至終濃度30%30%（B液體積+X）=95%×XX=30%B液體積÷95%-30%=0.462B液體積※至終濃度60%60%（上清液體積+X）－30%上清液體積=95%XX=（60%-30%）上清液體積÷95%-60%=0.867上清液體積第二十七頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二[注意事項]各步加入有機溶劑量要準確。否則會影響整個實驗結果。操作要在低溫下進行加入有機溶劑時要慢慢滴加，充分攪拌，避免局部濃度過高而引起升溫和變性。加入有機溶劑混勻后不宜放置過久，應立即離心。離心析出的蛋白質沉淀應立即將溶于適量的緩沖液中，以避免酶活力的喪失。第二十八頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二(二)堿性磷酸酶的比活性測定[原理]比活性的定義單位重量的蛋白質樣品中所含的酶活性單位。通常用每毫克蛋白質具有的酶活性單位來表示。用以鑒定酶的純化程度，是酶提取與純化成功與否的評價指標之一。第二十九頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二測定樣品的比活性必須測定：每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。每毫升樣品中的蛋白質毫克數(shù)。第三十頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶活性

AKP4-氨基安替比林磷酸苯二鈉酚醌衍生物（紅色）鐵氰化鉀根據(jù)紅色的深淺用比色法測定酚的含量。37℃保溫15分鐘產生1μg酚者為1個酶活性單位。第三十一頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二第三十二頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二考馬斯亮藍法測定蛋白質含量回顧實驗原理（實驗講義第60頁）。第三十三頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二

[操作步驟]

1.AKP活性單位測定取試管5支，按下表操作：試劑（ml）空白管標準管ABC0.04mol/L基質液1.01.01.01.01.0pH10碳酸緩沖液0.50.50.50.50.537℃水浴保溫5分鐘蒸餾水0.1____酚標準液（0.1mg/ml）_0.1___測定液__A1液0.1B液0.1C1液0.1混勻，立即置于37℃水浴保溫15分鐘第三十四頁，共三十八頁，編輯于2023年，星期二加0.2MNaOH溶液1ml加0.3%4-氨基安替比林1ml,0.5%鐵氰化鉀溶液2ml，混勻，室溫10min，各溶液進行A510測定計算：酶活性單位/