豬圓環(huán)病毒2型疫苗研究進展-課件

豬圓環(huán)病毒2型疫苗研究進展1ppt課件目錄圓環(huán)流行情況介紹A存在問題及展望C國內(nèi)、外圓環(huán)疫苗情況B2ppt課件豬圓環(huán)病毒病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟影響性疾病，也是我國養(yǎng)豬業(yè)的三大疾病之一，與豬瘟和豬藍耳病并稱我國養(yǎng)豬業(yè)的三座大山。3ppt課件PMWSPCVAD4ppt課件5ppt課件6ppt課件

目前，對于豬2型圓環(huán)病毒（ＰＣＶ２）造成的相關(guān)疾病尚無有效的治療措施，而且圓環(huán)病毒對各種消毒劑都有很強的抵抗性，豬場難將其凈化，預(yù)防該病的首要方案是采用疫苗進行預(yù)防接種。7ppt課件PCV2屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員，是一種共價閉合、單股環(huán)狀負鏈DNA病毒，呈二十面體對稱，無囊膜。PCV2病毒粒子直徑為17nm，基因組大小約1.7kb，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。PCV2的基因組結(jié)構(gòu)存在11個開放閱讀框(ORFs)，即ORF1-ORF11，ORFs之間大小相差懸殊，所編碼的蛋白大小在2～36ku。ORF1與ORF2是PCV2最大的２個開放閱讀框，分別編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白Ｒep和Ｒep’以及病毒的結(jié)構(gòu)蛋白Ｃap。8ppt課件9ppt課件10ppt課件Ｃap蛋白作為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒的核衣殼，是PCV2的主要免疫保護性抗原，能誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。ORF3為病毒復(fù)制的非必需基因，其編碼的蛋白可誘導(dǎo)PCV2感染的細胞發(fā)生凋亡。許多學(xué)者在PCV2基因組結(jié)構(gòu)與功能方面開展了大量研究，除ORF1,ORF2與ORF3的功能研究較為透徹外，其他ORFs的功能尚不十分清楚。11ppt課件目前，國際上統(tǒng)一將PCV2分為PCV2a、PCV2b、PCV2c三個基因亞型，其中PCV2a和PCV2b是目前存在的主要基因型，PCV2a僅分離自無PMWS感染豬場，PCV2b多分離自PMWS發(fā)生的豬群，PCV2c亞型毒株僅在20世紀80年代于丹麥分離，在致病性方面未見報道。PCV2在世界范圍內(nèi)廣泛分布并且在豬群中存在至少有50多年，血清學(xué)和病原學(xué)調(diào)查己證實全世界范圍內(nèi)許多國家和地區(qū)的豬群均存在PCV2感染，幾乎100%的商品化養(yǎng)豬場感染過PCV2，嚴重影響世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。12ppt課件目前對該病毒的防控主要依靠疫苗，滅活疫苗、亞單位疫苗和嵌合病毒滅活疫苗已投入使用，核酸疫苗、活載體疫苗和標記疫苗等新型疫苗已成為PCV2疫苗研究的熱點。13ppt課件PCV2國外流行情況

2003

2008OlveraPCV2aPCV2b14ppt課件Dupont等對GenBank中1997年至2006年間上傳的218個PCV2全基因組進行遺傳進化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2003年前豬群中主要流行PCV2a,之后世界范圍內(nèi)豬群PCV2感染存在轉(zhuǎn)型趨勢，主要以PCV2b基因型流行為主，同時PCVAD臨床表現(xiàn)較2003年之前更為嚴重，但是這些國家不包括韓國、日本和澳大利亞。15ppt課件基于以上研究，TanjaOprissnig等分析了1996-2013年間分離自美國和加拿大的750份樣品，1996-2004年間分離到的毒株均屬于PCV2a基因型，2005年出現(xiàn)新基因型PCV2b,2006-2013年的流行株為PCV2b基因型。16ppt課件2012年５月，美國在一PCV2免疫失敗豬場首次分離到毒力均強于PCV2a和PCV2b的突變毒株(Mutantporcinecircovirustype2b,ｍPCV2b），由于美國商品化疫苗基于PCV2a基因型，ｍPCV2b毒株的發(fā)現(xiàn)讓人們更加關(guān)注當前PCV2a型疫苗的免疫效果。17ppt課件北美地區(qū)在2004年前僅流行PCV2a基因型,2005年爆發(fā)嚴重的PCVAD,PCV2b基因型替代PCV2a型在北美地區(qū)商業(yè)化豬場迅速蔓延，引起高發(fā)病率和死亡率。隨后在中國、泰國、韓國、丹麥、瑞士也相繼報道了PCV2b基因型的出現(xiàn)，并在一段時間內(nèi)與PCV2a基因型循環(huán)流行。18ppt課件2007年Chae等在韓國分離到36株P(guān)CV2(PCVAD發(fā)病豬場分離到29株，PCVAD未發(fā)病豬場９株)，29株均屬于PCV2b，PCVAD未發(fā)病豬場中有4株屬于PCV2b。2006-2007年間，日本存在PCV2a與PCV2b兩種亞型，但是以PCV2b為主要流行基因型。19ppt課件目前，PCV2b基因型替代PCV2a型成為優(yōu)勢基因型，有關(guān)PCV2流行毒株遺傳變異的報道也逐漸增多，在遺傳變異及免疫壓力下可能出現(xiàn)其它形式的突變毒株。2008年Ｈess等報道了PCV2a與PCV2b重組毒株，隨后有關(guān)不同PCV2b毒株之間以及PCV1與PCV2a之間毒株發(fā)生基因重組相繼報道。同時進一步研究發(fā)現(xiàn)，重組毒有很高的體外繁殖能力，且抗原性發(fā)生改變，這些改變對致病性的影響有待進一步研究。20ppt課件PCV2基因型的漂移最早起源于歐洲，發(fā)生于2003年或更早時間，北美洲和亞洲約發(fā)生于2005年，大洋洲發(fā)生這種優(yōu)勢流行株轉(zhuǎn)變約在2006年，時間上均比歐洲PCV2基因型的改變有輕微的推遲，潛在原因還未得到證實，可能與進口處于該病潛伏期的動物有關(guān)?；蛐桶l(fā)生漂移的同時伴隨著嚴重的圓環(huán)病毒病的爆發(fā)，雖然現(xiàn)有數(shù)據(jù)不能直接證明這些爆發(fā)是由PCV2b毒株導(dǎo)致，但是時間和地點上的巧合推測PCV2主導(dǎo)型的變化與PCVAD的發(fā)生存在很大關(guān)系，而基因型轉(zhuǎn)變的原因與機制目前尚不清楚。相對于PCV2遺傳變異，PCV2自然重組變異的報道比較少，其重組與病毒致病性和遺傳進化的關(guān)系尚不明確。21ppt課件我國PCV2流行情況Ｗang等從全國分離到49株P(guān)CV2，其中2001年分離到３株均屬于PCV2a型，2002-2006年分離到34株P(guān)CV2中PCV2b有18株，2007-2008年間分離到12株均為PCV2b型。Li對2001-2009年間分離自我國東部的136株P(guān)CV2進行遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，PCV2b有127株，PCV2a僅有9株，其中8株P(guān)CV2a分離自2001-2005年間，從2005年以后，幾乎所有的分離株都是PCV2b型，PCV2a型越來越少，中國東部地區(qū)PCV2流行毒株存在由PCV2a向PCV2b漂移的現(xiàn)象。22ppt課件王佳慧利用PCR方法對中國16個省市75個規(guī)模化豬場2010-2011年間的688份樣品進行檢測，被檢豬場PCV2陽性率為58.67%,共分離到53株P(guān)CV2,與GenBank下載的192株中國分離株進行遺傳變異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，53株P(guān)CV2中PCV2b基因型有50株,且2001年前我國優(yōu)勢PCV2基因型為PCV2a型,2002年之后流行的PCV2基因型轉(zhuǎn)變?yōu)镻CV2b型,但同期仍有PCV2a型毒株存在。23ppt課件趙英杰對2011-2012年間采集自我國18個省市932份樣品分析發(fā)現(xiàn)，2011-2012年我國主要養(yǎng)豬地區(qū)規(guī)?；i場PCV2的感染率高達67.8%，并選取具有代表性的74株P(guān)CV2進行全基因組測序，其中56株P(guān)CV2b基因型。同一時期，Wei等自我國南方14個商業(yè)化豬場分離到66株P(guān)CV2，其中92.42%的毒株屬于PCV2b基因型。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國優(yōu)勢流行基因型為PCV2b。24ppt課件目前，國外有很多關(guān)于PCV2流行毒株的變異的報道，但是我國對此研究比較少。2011年Cai分離到了5株P(guān)CV2a和PCV2b基因型間重組毒，重組位點均位于ORF2區(qū)段內(nèi)。Guo對2004-2008年采集自我國10個省份疑似PCV2感染的病料中分離到19株P(guān)CV2，有4株病毒ORF2編碼基因發(fā)生突變，同時選取了2株突變株進行致病性實驗，發(fā)現(xiàn)突變株所造成的病理損傷、病毒血癥、淋巴組織等免疫器官損傷明顯嚴重，新出現(xiàn)的突變株如何增強毒力的分子機制還需進一步研究。25ppt課件PCV2在我國豬群中已經(jīng)廣泛存在，主要有PCV2a和PCV2b兩種基因型，自2005以來主要以PCV2b基因型流行為主，同時出現(xiàn)mPCV2b毒株，未發(fā)現(xiàn)PCV2c基因型。26ppt課件國外上市疫苗有滅活疫苗、Cap亞單位疫苗和PCV1-2嵌合病毒滅活疫苗,均基于PCV2a基因型，雖然PCV2a疫苗能降低豬臨床PCVAD,減少PCV2a的流行,但是不會顯著減少PCV2b在豬群中的傳播。日本研究者發(fā)現(xiàn),PCV2疫苗的免疫效果與PCV2基因型有很大關(guān)系,流行毒株與疫苗株遺傳關(guān)系越近，疫苗產(chǎn)生的免疫保護效力越好。為了進一步證實這一發(fā)現(xiàn)，TanjaOpriessniga用PCV2a型疫苗和PCV2b型疫苗分別免疫豬群，PCV2進行攻毒，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV2b型疫苗可以抵抗PCV2b、PCV2a/PCV2b共感染提供更好的免疫保護。27ppt課件國內(nèi)上市疫苗屬于PCV2b型滅活疫苗，雖然與流行毒株屬于同一基因型，但是傳統(tǒng)滅活疫苗抗原制備上病毒滴度低，生產(chǎn)周期長，且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答主要為體液免疫，忽視了細胞免疫應(yīng)答在PCV2免疫保護中的作用。雖然商品化疫苗的應(yīng)用為有效防控PCV2感染發(fā)揮了重要作用，但是疫苗株與流行株分屬不同基因型，且傳統(tǒng)疫苗在免疫保護效力和生產(chǎn)制備上存在缺陷。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，基于PCV2b型的活載體疫苗、核酸疫苗及標記疫苗等新型疫苗也展現(xiàn)出良好的研究前景。28ppt課件PCV2滅活疫苗PCV2滅活疫苗是將PCV2感染的細胞培養(yǎng)物通過理化方法處理，使其喪失感染性但仍保持良好的免疫原性，然后加入佐劑乳化制備而成。該類疫苗具有使用安全，易于保存，性能穩(wěn)定等優(yōu)點。29ppt課件30ppt課件31ppt課件32ppt課件33ppt課件34ppt課件國外學(xué)者較早投入PCV2滅活疫苗的研究工作中，法國梅里亞公司于2006年成功研制出通過歐盟認證的首例PCV2全病毒滅活疫苗Circovac?。Opriessnig等研究發(fā)現(xiàn)，用Circovac?免疫妊娠母豬和仔豬均能降低仔豬PCV2病毒血癥和各組織器官中病毒載量，促進新生仔豬的生長，其原因可能是由于在給妊娠母豬注射疫苗后，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生了抗PCV2的特異性抗體，仔豬通過吮吸初乳獲得了抵抗PCV2感染的被動免疫力。35ppt課件Kurmann用該疫苗免疫PCV2亞臨床感染的母豬，共分３次免疫，首免和二免分別在妊娠前４周和２周進行，三免在妊娠期第12周進行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫母豬的血清抗體水平比未免疫母豬的血清抗體水平提高了３～９倍，新生仔豬的血清抗體水平也隨之增加，并能提高仔豬平均日增重率，縮短仔豬育肥期。由此可見，Circovac?具備優(yōu)良的免疫效果，能使免疫母豬和免疫仔豬獲得穩(wěn)定的群體免疫力，保護其免受PCV2感染。36ppt課件在國內(nèi)，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長明研究員成功地研制出中國首例PCV2滅活疫苗(LG株)，該疫苗具有抗原含量高、免疫原性強、安全性好、抗母源抗體干擾及免疫效果好等特點，臨床試驗結(jié)果表明，疫苗接種豬群與空白對照組對比，主動免疫仔豬發(fā)病率下降15.1%，死淘率下降3.6%；被動免疫母豬結(jié)果顯示，出生時死胎率下降2.3%，初生仔豬成活率提高7.6%，斷奶時成活率提高7.5%。該疫苗的使用對我國PCV2流行有效地進行防控，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟效益。此外，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授研制的PCV2滅活疫苗（SH株）也已注冊上市，目前正在全國大部分地區(qū)推廣使用，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。這２種疫苗的成功研制和應(yīng)用對防控我國PCV2感染發(fā)揮了重大作用。37ppt課件38ppt課件39ppt課件40ppt課件41ppt課件42ppt課件43ppt課件44ppt課件45ppt課件PCV2弱毒疫苗弱毒疫苗又稱為減毒活疫苗，是將病原體的致病力通過自然篩選或人工致弱等方式減弱制備而成。盡管該類疫苗的毒力已經(jīng)致弱，但仍然保持著原有的免疫原性，并能在動物體內(nèi)繁殖，刺激動物機體免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生堅實的免疫力和持久的保護力。46ppt課件國內(nèi)外對PCV2弱毒疫苗研究的報道較少，目前還沒有商品化的PCV2弱毒疫苗，主要原因與病毒毒力易返強、致弱毒株毒力評價困難等因素有關(guān)。Fenaux等將PCV2分離株在PK15細胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第120代病毒(VP120)滴度約為第１代病毒(VP1)滴度的10倍，VP120感染的仔豬出現(xiàn)病毒血癥的發(fā)生率明顯低于VP1感染的仔豬，并且感染仔豬的血清中PCV2DNA拷貝數(shù)更低，眼觀和病理組織學(xué)變化也更輕，表明體外傳代可促進PCV2在細胞內(nèi)的繁殖能力，并能減弱其致病力，這為研制PCV2弱毒疫苗提供了科學(xué)依據(jù)。由于單一PCV2感染對豬的致病性并不十分典型，病毒在體內(nèi)持續(xù)存在，其毒力是否返強等關(guān)鍵問題沒有闡明，試驗數(shù)據(jù)有限，這種方法得到的毒力減弱毒株作為疫苗離應(yīng)用還有很長的路要走。47ppt課件PCV2亞單位疫苗Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白和免疫保護性抗原，能刺激動物機體產(chǎn)生針對PCV2的特異性免疫應(yīng)答，是研制PCV2基因工程亞單位疫苗的理想靶抗原。常用于PCV2亞單位疫苗生產(chǎn)的表達系統(tǒng)主要是昆蟲細胞／桿狀病毒表達系統(tǒng)。國外已有3種PCV2亞單位疫苗注冊上市，分別是勃林格公司研制的IngelvacCircoFLEX?，英特威公司研制的Circumvent?以及先靈葆雅公司研制的Porcilis?PCV，這3種疫苗均為桿狀病毒表達的Cap蛋白亞單位疫苗。48ppt課件Opriessnig等比較了單劑量的IngelvacCircoFLEX?和兩劑量的Circumvent?對３周齡以上仔豬的免疫保護效力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在用PCV2、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及豬流感病毒(SIV)感染免疫仔豬后，無論以單劑量還是兩劑量疫苗免疫，均能明顯降低病毒血癥的發(fā)生率，減輕PCV2、PRRSV及SIV混合感染對淋巴組織的損傷。49ppt課件Fort等研究了單劑量Porcilis?

PCV對不同地區(qū)、不同基因型PCV2感染的免疫保護效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗對來自不同地區(qū)、不同基因型的PCV2感染具有良好的免疫保護力，既能誘導(dǎo)免疫仔豬產(chǎn)生針對PCV2的特異性體液免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，能顯著減輕病毒血癥，減少鼻腔和排泄物中PCV2的排出量，降低各組織器官中PCV2的病毒載量。50ppt課件51ppt課件52ppt課件青島易邦生物工程有限公司常務(wù)副總經(jīng)理范根成博士介紹了易邦“易圓凈”擁有的幾個突出特點：1）率先建立豬圓環(huán)疫苗評價體系，引領(lǐng)行業(yè)標準；2）表達病毒樣顆?？乖╒LPS/CAP），抗原性好，能高效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好體液免疫與細胞免疫，免疫后15-20天100%轉(zhuǎn)陽，持續(xù)時間可達5個月；3）水性佐劑+免疫增強劑，注射方便，無副反應(yīng)；4）100多萬頭豬臨場使用表明“易圓凈”安全、高效、無副作用，免疫豬各項生產(chǎn)性能良好。只需一針，保護至出欄；5）2-4周齡豬免疫，每頭2ml；管理良好豬場每頭1-1.5ml；在未免疫或免疫失敗豬群，在發(fā)病早期可以緊急接種，每頭2ml。53ppt課件54ppt課件重組PCV2活載體疫苗PCV2病毒活載體疫苗腺病毒活載體疫苗偽狂犬病毒活載體疫苗假型桿狀載體疫苗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒載體疫苗噬菌體載體疫苗PCV2細菌活載體疫苗乳酸菌口服活載體疫苗博德特氏菌載體疫苗55ppt課件腺病毒活載體疫苗腺病毒作為基因轉(zhuǎn)移載體具有諸多優(yōu)勢：宿主范圍廣，插入外源基因能力強，能在許多哺乳動物細胞和組織中表達重組蛋白，表達外源基因效率高，能對表達的外源蛋白進行精細的修飾?；谝陨蟽?yōu)勢，腺病毒載體現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因工程疫苗研發(fā)，基因治療以及腫瘤治療等領(lǐng)域。56ppt課件Wang等成功構(gòu)建了表達PCV2ORF2基因的重組腺病毒rAD-Cap，然后通過動物免疫保護試驗評價rAD-Cap對仔豬的免疫保護效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在首免后３７ｄ即能檢測到抗PCV2的高水平ELISA抗體和病毒中和抗體，免疫仔豬的相對日增體質(zhì)量率顯著高于攻毒對照組，而組織損傷程度和病毒血癥的發(fā)生率卻明顯低于攻毒對照組。57ppt課件Liu等成功構(gòu)建了融合表達PCV2ORF2基因與豬IFN-γ基因的重組腺病毒PCV2ORF2-IFN-γ，并證實PCV2ORF2-IFN-γ在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2特異性抗體的能力比單獨表達Cap蛋白的PCV2ORF2強，表明豬IFN-γ作為細胞因子佐劑可以顯著增強Cap蛋白的免疫原性。58ppt課件由此可見，表達Cap蛋白的重組腺病毒能誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生針對PCV2的特異性免疫應(yīng)答，保護動物抵抗PCV2感染，是一種具有潛在應(yīng)用價值的PCV2候選疫苗。然而，腺病毒作為表達載體也存在些許不足，如腺病毒載體由于不能整合到靶細胞的基因組DNA中，因此不能形成外源基因的穩(wěn)定表達；腺病毒的靶向性差；腺病毒顆?？杀桓闻K的Kupffer細胞非特異性吸收，表現(xiàn)出很強的首過效應(yīng)等。因此，只有對腺病毒載體不斷進行改進和完善，才能充分發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價值。59ppt課件偽狂犬病毒活載體疫苗偽狂犬病毒基因組是線狀雙鏈DNA分子，大小約150ｋｂ，含有許多病毒非必需基因，可以插入和表達多種病原體的免疫保護性抗原基因。偽狂犬病毒較穩(wěn)定，免疫原性持久；缺失毒力基因的偽狂犬病毒安全性好，能誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生持續(xù)的體液免疫與細胞免疫應(yīng)答，因此，該病毒已逐漸發(fā)展成為哺乳動物細胞系統(tǒng)的高效表達載體之一，廣泛應(yīng)用于基因工程藥物和基因工程疫苗的開發(fā)與研制等領(lǐng)域。60ppt課件Ju等成功構(gòu)建了表達PCV2ORF1-ORF2融合蛋白的重組偽狂犬病毒PRV-PCV2，Westernblot試驗證實ORF1-ORF2融合蛋白在重組病毒中正確表達，用PRV-PCV2免疫小鼠后，能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PRV-PCV2的特異性抗體，保護小鼠抵抗PRVEa強毒株攻擊；而且，仔豬免疫試驗也證實PRV-PCV2能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生針對PRV和PCV2的特異性免疫應(yīng)答。61ppt課件Song等將PCV2ORF2基因插入ｐIECMV質(zhì)粒中，并同偽狂犬病毒Tk-/gE-/LacZ+基因組共轉(zhuǎn)染IBRS-2細胞，通過同源重組成功構(gòu)建了Tk-/gE-/ORF2重組病毒，Westernblot和間接免疫熒光試驗證實PCV2ORF2基因在重組病毒中正確表達。４周齡仔豬接種Tk-/gE-/ORF2后，PRV-ELISA、PRV－中和試驗、ORF2-ELISA和ORF2特異性淋巴細胞增殖試驗證實重組病毒具有良好的免疫原性，能產(chǎn)生針對PRV和PCV2的特異性免疫應(yīng)答。由此可見，重組偽狂犬病病毒能誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生針對PRV和PCV2的特異性免疫應(yīng)答，保護動物抵抗PRV和PCV2感染，與重組腺病毒對比，該重組偽狂犬病毒能在豬體內(nèi)很好地繁殖，因此，在PRV-PCV2二聯(lián)活載體疫苗研制方面具有巨大的潛力和應(yīng)用價值。62ppt課件假型桿狀病毒載體疫苗Ｆan等將水皰性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac１多角體蛋白基因啟動子下游，并在VSV-G表達元件下游引入巨細胞病毒早期（CMV-1E）啟動子和BGHpoly(A),成功構(gòu)建了一種類似桿狀病毒的假型桿狀病毒BV-G-CMV，但其能感染哺乳動物細胞，并能在病毒粒子囊膜展示VSV-G。63ppt課件隨后，F(xiàn)an等將PCV2ORF2基因定向插入BV-G-CMVCMV-1E啟動子下游，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞后獲得了重組假型桿狀病毒BV-G-ORF2，Westernblot與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示BV-G-ORF2能在PK15細胞中高效表達Cap蛋白。64ppt課件以1×108或1×109PFU劑量的BV-G-ORF2免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗PCV2特異性ELISA抗體、中和抗體及細胞免疫應(yīng)答，而且即使以1×108PFU劑量免疫，BV-G-ORF2也展現(xiàn)出比PCV2DNA疫苗更強的免疫原性。BV-G-CMV作為基因轉(zhuǎn)移載體具有操作簡單、病毒易培養(yǎng)、無毒性、免疫原性強及宿主體內(nèi)不存在抗桿狀病毒的抗體等優(yōu)點，因此，假型桿狀病毒可用于新型PCV2活載體疫苗的研究。65ppt課件豬繁殖與呼吸綜合征病毒載體疫苗Pei等在PRRSVcDNA克隆的ORFs1b與2a之間插入２個限制性酶切位點和１個轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列TRS6，將其改造成一個通用的病毒載體，然后將PCV2ORF2基因插入２個限制性酶切位點之間，由TRS6啟動轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建了表達Cap蛋白的重組質(zhì)粒，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145細胞成功獲得了P129-PCV重組PRRSV。66ppt課件動物免疫試驗證實：免疫５周后，在P129-PCV免疫的豬體內(nèi)能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PCV2特異性抗體應(yīng)答，表明重組PRRSV能在體內(nèi)和體外成功表達Cap蛋白，并誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，可作為一種表達載體用于PCV2及其他豬病活載體疫苗的研究。然而，該重組PRRSV體外傳代是否穩(wěn)定、目的基因經(jīng)傳代是否會丟失等問題有待進一步的試驗數(shù)據(jù)加以證實。67ppt課件

噬菌體載體疫苗研究表明，噬菌體表面展示技術(shù)現(xiàn)已應(yīng)用于疫苗的開發(fā)與研究。將病原體的保護性抗原與噬菌體的外殼蛋白以融合蛋白形式展示于噬菌體的表面，以此來構(gòu)建表達外源抗原的重組噬菌體顆粒，即噬菌體載體疫苗。噬菌體載體疫苗因安全，穩(wěn)定，不需要佐劑及易于規(guī)模化生產(chǎn)等特點而日益受到研究人員的重視。68ppt課件Gamage等將PCV2Cap蛋白的優(yōu)勢表位區(qū)克隆至λ噬菌體展示顆粒(LDP)頭部蛋白(D)基因下游形成融合基因，成功構(gòu)建了表達融合蛋白D-CAP的重組λ噬菌體展示載體LDP-D-CAP，ELISA和Westernblot檢測結(jié)果顯示D-CAP在LDP的表面正確表達，用LDP-D-CAP免疫仔豬后，沒有出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，首免后即可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗PCV2的特異性免疫反應(yīng)，不僅能誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2中和抗體，而且能誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，表明PCV2噬菌體載體疫苗有望作為一種新型的活載體疫苗用于防控PCV2感染。69ppt課件

乳酸菌口服活載體疫苗乳酸菌在食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用，是一類安全的口服細菌，可以作為活疫苗載體表達外源抗原，因而日益受到研究者的重視。Wang等將缺失核定位信號區(qū)的PCV2ORF2基因克隆入大腸桿菌／乳酸鏈球菌穿梭載體pSEC:LEISS，構(gòu)建了重組穿梭載體pSEC:LEISS-dCap,電轉(zhuǎn)化乳酸菌后獲得了重組乳酸菌NZ9000/pSEC:LEISS-dCap,Westernblot試驗證實Cap蛋白在乳酸鏈球菌中正確表達，在給小鼠口服重組乳酸鏈球菌培養(yǎng)物后可檢測到高水平的PCV2特異性抗體，表明乳酸鏈球菌作為抗原轉(zhuǎn)移載體可用于PCV2口服活疫苗的研發(fā)，具有開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。70ppt課件博德特氏菌載體疫苗研究證實，支氣管炎博德特氏菌具有很強的感染性，這使得其很容易定植于呼吸道黏膜，因此，應(yīng)用致弱的支氣管炎博德特氏菌作為活載體將異種抗原遞呈至哺乳動物乃至人的呼吸道是可以實現(xiàn)的。Kim等將PCV2ORF2基因定向克隆入aroA突變的支氣管炎博德特氏菌，電轉(zhuǎn)化后獲得了表達Cap蛋白的重組博德特氏菌(BBS-MCP)，然后用活BBS-MCP免疫小鼠和豬，ELISA檢測結(jié)果顯示在血清中存在高水平的抗Cap蛋白特異性IgG抗體，用PCV2感染后，在活BBS-MCP免疫的豬淋巴結(jié)中檢測不到PCV2DNA，結(jié)果表明BBS-MCP免疫能有效保護豬群抵抗PCV2感染，這一發(fā)現(xiàn)為PCV2減毒活疫苗的研發(fā)提供了新的思路。71ppt課件此外，酵母表達系統(tǒng)作為一種真核表達系統(tǒng)，因其操作簡單、細胞生長快速、能大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，而且能對重組蛋白進行相對正確的折疊和翻譯后加工修飾等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于外源蛋白的商品化疫苗研發(fā)。Bucarey等將PCV2Cap蛋白基因密碼子優(yōu)化后克隆入大腸桿菌／釀酒酵母穿梭載體(pYES2)，然后轉(zhuǎn)化宿主菌INVSc1，Westernblot試驗證實Cap蛋白在酵母細胞中正確表達，電鏡下觀察到Cap蛋白表達后可以自我組裝形成類似PCV2的病毒樣顆粒，給小鼠口服含Cap蛋白的酵母提取物后，在血清中可檢測到抗Cap蛋白的特異性抗體，表明釀酒酵母作為一種非常有吸引力的表達載體可用于PCV2口服活疫苗的研制。72ppt課件

PCV2核酸疫苗核酸疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，因免疫效果好，免疫應(yīng)答持久，制備簡便，穩(wěn)定性強，安全性好，成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點，現(xiàn)已成為疫苗學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。研究證實，含PCV2ORF2基因的質(zhì)粒載體（ｐORF2）能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)PCV2特異性抗體陽轉(zhuǎn)，能誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生抗PCV2感染的保護性免疫應(yīng)答，而且ｐORF2免疫的小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生PCV2中和抗體的能力比單獨用Cap蛋白免疫的小鼠強，攻毒后免疫組小鼠臨床癥狀和病理變化明顯減輕，PCV2病毒載量也顯著下降。73ppt課件Fenaux等用PCV1-2嵌合病毒DNA疫苗免疫仔豬，免疫后42d，檢測到大部分仔豬PCV2抗體陽轉(zhuǎn)，攻毒后21d，對照組仔豬出現(xiàn)病毒血癥，淋巴結(jié)腫大，淋巴組織衰竭等癥狀，而免疫組仔豬未出現(xiàn)病毒血癥，淋巴組織損傷程度較輕，淋巴組織的病毒載量顯著降低，表明PCV1-2嵌合病毒DNA疫苗可以有效預(yù)防PCV2感染。74ppt課件Ａｒａｖｉｎｄａｒａｍ等分別構(gòu)建了含PCV2ORF-1、ORF-2、ORF-3的重組質(zhì)粒p3224-ORF-1、-2和-3，3種重組質(zhì)粒單獨或聯(lián)合免疫小鼠２周后，用相應(yīng)的MVA-ORF-1、-2和-3以單獨或聯(lián)合形式加強免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF-2/-3與ORF-1/-2/-3這２種組合免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF以及PCV2抗體水平均較其它免疫組高，攻毒后這２種組合免疫組PCV2病毒載量顯著減少，小鼠的肺部病變也明顯減輕。盡管核酸疫苗具有諸多優(yōu)點，但外源基因在體內(nèi)的表達調(diào)控及其在體細胞中的轉(zhuǎn)移可能會產(chǎn)生意外的免疫病理反應(yīng)等瓶頸問題使得目前絕大部分核酸疫苗的研究還僅局限于實驗室。75ppt課件PCV1-2嵌合疫苗嵌合疫苗是應(yīng)用基因工程手段來構(gòu)建的一類新型疫苗，美國富道公司已經(jīng)研發(fā)出商品化的PCV1-2嵌合疫苗Suvaxyn?PCV2OneDoseTM，其原理是用PCV2ORF2基因置換無致病性的PCV1ORF2基因，構(gòu)建PCV1-2嵌合病毒，然后將其滅活制備而成，該類疫苗現(xiàn)已在美國、加拿大、墨西哥、丹麥、菲律賓及新西蘭等國申請注冊。2011年，美國輝瑞公司與富道公司合并后，將Suvaxyn?PCV2OneDoseTM更名為FosteraTMPCV。76ppt課件Ｓｅｇａｌéｓ等對Suvaxyn-PCV2的免疫保護效力進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫豬群的臨床癥狀大大減輕，淋巴組織和血液中PCV2的病毒載量、保育豬和育肥豬的死亡率以及PMWS的發(fā)生率均顯著降低，表明Suvaxyn-PCV2能有效誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生PCV2中和抗體，保護豬群抵抗PCV2感染，并降低PMWS的發(fā)生率，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致。77ppt課件眾所周知，如果仔豬體內(nèi)存在母源抗體，將會干擾疫苗的免疫效能，為驗證母源抗體的存在對Suvaxyn?PCV2OneDoseTM免疫效能的影響，Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇ等選擇有母源抗體存在的仔豬作為實驗動物，在Suvaxyn?PCV2OneDoseTM免疫后28d進行PCV2感染試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組對比，免疫組仔豬血清中PCV2病毒載量顯著降低，淋巴組織損傷程度也明顯減輕，表明即使存在母源抗體，Suvaxyn?PCV2OneDoseTM仍能顯著提高仔豬對PCV2感染的免疫力。78ppt課件79ppt課件

PCV2標記疫苗PCV2標記疫苗是指應(yīng)用DNA重組技術(shù)將分子標記插入PCV2基因組中而研制的一類新型的重組疫苗，該類疫苗毒株可與野毒株相區(qū)別。80ppt課件Beach等將GLU或KT3標簽定向克隆至PCV1-2嵌合病毒Cap蛋白