單環(huán)刺螠（種質(zhì)）

單環(huán)刺螠（種質(zhì)）范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了單環(huán)刺螠Urechisunicinctus（vonDrasche，1881）的術(shù)語和定義、學(xué)名與分類、主要形態(tài)與構(gòu)造特征、繁殖、分子遺傳學(xué)特性、檢測方法和判定規(guī)則。本標(biāo)準(zhǔn)適用于XX省單環(huán)刺螠的種質(zhì)鑒定和檢測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：抽樣方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。剛毛bristle由單環(huán)刺螠剛毛囊分泌的幾丁質(zhì)物質(zhì)形成，包括腹剛毛和尾剛毛，腹剛毛位于口部略后方，尾剛毛分布于肛門周圍，有輔助運(yùn)動(dòng)功能。學(xué)名與分類學(xué)名單環(huán)刺螠Urechisunicinctus（vonDrasche，1881）。分類地位螠蟲動(dòng)物門（Echiurioidea）、螠綱（Echiurida）、無管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urchidae）、刺螠屬（Urechis）。主要形態(tài)與構(gòu)造特征外部形態(tài)體呈長圓筒狀，前部略細(xì)，后部鈍圓?？凇⒏亻T端位。體表遍布等大的皮膚乳突，其中位于腹剛毛附近的乳突呈環(huán)狀排列，9～11環(huán)。身體淡紅、紫紅或棕紅色。吻短，呈匙狀。腹剛毛1對，黃褐色，彎向后方。尾剛毛9～13根，呈單環(huán)排列，彎向環(huán)外。見圖1。單環(huán)刺螠外部形態(tài)內(nèi)部構(gòu)造體壁體壁為皮膚肌肉囊。體腔體腔發(fā)達(dá)，腔內(nèi)充滿紅色體腔液。消化道消化道長而迂回，為體長的5～10倍，通過許多懸腸肌附著于體壁。排泄系統(tǒng)腎管2對，位于體腔前端腹面，兼有生殖輸出管和排泄的功能，腎管基部近腎孔處各有1個(gè)螺旋體。體后端的排泄腔生有肛門囊1對，呈長囊狀。繁殖性成熟年齡雌性和雄性個(gè)體均在1齡性成熟。生物學(xué)最小型70?mm，體重約20?g。生殖細(xì)胞生殖腺無特定形態(tài)，在繁殖季節(jié)由體腔膜產(chǎn)生原始生殖細(xì)胞，進(jìn)而分化產(chǎn)生生殖原細(xì)胞，增殖形成精（卵）母細(xì)胞團(tuán)，游離于體腔液中，再經(jīng)增殖、生長、減數(shù)分裂，形成成熟的精、卵細(xì)胞，進(jìn)入腎管。繁殖期腎管內(nèi)充滿成熟的精、卵，透過體壁可見雄性腎管為乳白色、雌性為橘黃色。懷卵量成熟雌性可多次排卵。體重50?g～60?g個(gè)體，懷卵量一般為1.5×106?！?.0×106粒。分子遺傳學(xué)特性線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞單位I（COI）基因序列423?bp，1號(hào)單倍型序列如下：CGACCAGAACGAATGCCTTTATTTGTATGGGCCGTAGTCATTACAGCAGTACTATTACTT60TTATCCCTCCCAGTTCTAGCAGGGGCAATTACTATACTTCTGACAGACCGAAACCTAAAT120ACCGCATTTTTCGACCCCCAAGGGGGTGGTGACCCTGTGTTATACCAACATCTCTTTTGA180TTTTTTGGTCATCCAGAGGTCTACATTTTAATTCTCCCGGGCTTTGGGGCTATCTCCCAT240ATCGTCACACAACACGCATCCAAAATAGAAAGATTTGGAACACTAGGTATGATCTATGCA300ATACTTGGAATTGGGGTGTTAGGGTTCATTGTATGAGCTCATCACATATTTACCGTAGGG360ATAGATGTAGACACACGGGCATACTTTACTGCAGCTACCATAATTATTGCCGTTCCAACG420GGA423檢測方法抽樣按照GB/T18654.2規(guī)定執(zhí)行。外部形態(tài)在充足自然光線下肉眼觀察。內(nèi)部構(gòu)造解剖后用肉眼觀察。繁殖性成熟年齡養(yǎng)殖單環(huán)刺螠可通過查閱養(yǎng)殖記錄確定年齡。懷卵量取繁殖期且發(fā)育成熟的雌螠，用手術(shù)剪剪除雌螠兩端，將腎管完整收集，用過濾海水洗凈后，剪斷腎管，使用潔凈的燒杯收集流出的卵子。將獲得的卵細(xì)胞全部收集于燒杯中，加入過濾海水稀釋成1?000?mL的混合液，攪拌均勻，用移液管吸取0.1?mL，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，共取3次并計(jì)算平均值。分子遺傳學(xué)特性分析DNA的提取取體壁100?mg剪碎后，DNA提取試劑盒或常規(guī)酚-氯仿方法提取總DNA，滅菌雙蒸水溶解備用。引物序列DHCY-F：5'-CGACCAGAACGAATGCCTTT-3'；DHCY-R：5'-TCCCGTTGGAACGGCAATAA-3'。反應(yīng)條件反應(yīng)程序：94?℃變性3?min；94?℃變性30?s，55?℃退火30?s，72?℃延伸45?s，35個(gè)循環(huán)；72?℃延伸5?min，4?℃保溫。PCR反應(yīng)液配方參見附錄A。片段回收、純化與序列測定PCR產(chǎn)物經(jīng)X脂糖凝膠電泳后，回收純化目的片段，測序。判定規(guī)則符合第5章要求，且COI基因片段測序結(jié)果與第7章序列CLUSTAL比對，K2P遺傳距離小于4?%，判定為合格。

（資料性附錄）

PCR擴(kuò)增反應(yīng)液PCR擴(kuò)增反應(yīng)液反應(yīng)物加入量DNA模板50?ng～100?ng10倍擴(kuò)增緩沖液2.5?μLMgCl2（25?mmol/L）2.