實驗一薄層層析板的制備

..可修編-實驗一薄層層析板的制備實驗目的制備薄層層析板，使葉綠素在層析板上分離顯色。實驗原理薄層層析，常用TLC（Chromatography）表示，又稱薄層色譜，屬于液-固吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01Pg）的分離；另一方面若在制作薄層板時，把吸附層加厚，將樣品點成一條線，則可分離多達500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。薄層吸附色譜的吸附劑最常用的是氧化鋁、硅膠、硅藻土、聚酰胺和纖維素。其顆粒大小，一般要求直徑為10~40pm。硅膠是無定形多孔性物質，略具酸性,適用于酸性物質的分離和分析。薄層色譜用的硅膠分為：“硅膠H”—不含粘合劑；“硅膠G”—含煅石膏粘合劑；“硅膠HF254”—含熒光物質，可用于波長為254nm紫外光下觀察熒光；“硅膠GF254”—既含煅石膏又含熒光劑等類型。粘合劑除上述的煅石膏（半水合硫酸鈣：2CaSO4?H2O）外，還可用淀粉、羧甲基纖維素鈉。實驗材料、器具1、試劑硅膠、4%（的CMC溶液（羧甲基纖維素鈉）2、實驗用具：藥匙、研缽、載玻片、量筒、玻棒四、實驗步驟1、載玻片要求平滑清潔，沒有劃痕，在使用前可用洗滌液或肥皂水洗滌，再用水沖洗干凈。（干凈的標準：水不是呈股流下，而是呈瀑布狀態(tài)流下。）2、與硅膠混合：CMC-Na溶液與硅膠的比例為3:1（3ml：1g）°WCMC-Na溶液倒入研缽中，然后加入硅膠，在研缽中研磨，按一個方向研磨，自下而上，然后自上而下，以趕盡氣泡為佳。3、鋪板：將載玻片置于平臺上，用藥匙舀取糊狀硅膠，均勻地鋪在載玻片表面。鋪板時，可以順著板中間倒，也可以順著某個邊緣倒，也可以用玻璃棒引著溶液平鋪在玻璃板上，倒時也要注意不要引入小氣泡。尤其是載板的四個角，容易高出玻璃板其他部位，所以要格外注意。后輕顛幾下薄層板即可。顛好的板，表面看上去要光滑平整，沒有氣孔。薄層板鋪好后一定要放置在平的臺面上，否則難保證板面硅膠的厚度均勻。（3g硅膠大約可鋪7.5x2.5cm載玻片5-6塊）4、晾干：置水平臺上于室溫下晾干。5、活化：將晾干的板子在105℃烘箱中干燥30團而，然后取出，放入干燥器中，備用?；罨枘z有利于提高硅膠的吸附性能，同時排除硅膠部已吸收的水分及其他氣體。通過活化硅膠，主要改變了硅膠部的微孔結構，使其孔徑的大小及微孔結構的排列得到進一步的改善。但是這樣硅膠的吸附變大，可能會使樣品分離困難。下面先介紹一下配置方法：.CMC-Na溶液的配置：一般其濃度為0.3~0.5%,根據(jù)自己經(jīng)驗而定（我習慣用0.4%的）。具體方法如下：先將預用的水加熱至60~70℃,然后加入CMC-Na,邊加邊攪拌,使之溶解，即得。.與硅膠混合：CMC-Na溶液與硅膠的比例為3：1。具體方法如下：先將CMC-Na溶液倒入自動攪拌器或研缽中，然后加入硅膠，攪勻即可。若是在研缽中研磨，按一個方向研磨,自下而上，然后自上而下，以趕盡氣泡為佳。.鋪板：手動或機械。手動鋪出的板的薄厚與所加的混合后的硅膠量有關，而機械鋪出的板的薄厚與機械所選用的鋼板有關，可根據(jù)需要來定。但此過程中最關鍵的是板子邊緣鋪得好壞，手動鋪板一定要將玻璃板邊緣硅膠涂勻（我習慣用兩頭掂法，即板下方的中間型一物體，兩頭懸空，兩手均勻掂動）。而機械鋪板要注意板與板之間平整性，或者由高到低排列。.晾干：自然晾干。.活化：將晾干的板子在105℃烘箱中干燥30團訪，取出，放入干燥器中，備用。這是實驗室和檢驗室薄層層析板常用的制備方法之一，供大家參考！層析英文名稱：chromatography定義1：基于不同物質在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同而將混合組分分離的技術。當流動相（液體或氣體）流經(jīng)固定相（多孔的固體或覆蓋在固體支持物上的液體）時，各組分沿固定相移動的速度不同而分離。能用于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。定義2：利用某種類型的固定介質，根據(jù)混合物分子的電荷大小和分子量不同等性質，在流動相和固定相之間進行分離的一種生物化學技術。層析（chromatography）是“色層分析”的簡稱。利用各組分物理性質的不同，將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用于有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。層析利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力在把微細分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統(tǒng)中，使試料上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統(tǒng)中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。根據(jù)移動相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當?shù)囊后w，也可使用其他物質。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（columnchromatogra-phy）,在玻璃板上涂上一層薄而均的物質作為固定相的稱為薄層層析（thin-layerchromatography），后者可與用濾紙作為固定相的紙上層析進行同樣的分析，即在固定相的一端，點上微量試料，在密閉容器中，使移動相（液體）從此端滲入，移動接近另一端。通過這種展開操作，各成分呈斑點狀移動到各自的位置上，再根據(jù)Rf值的測定進行鑒定。當斑點不易為肉眼觀察時，可利用適當?shù)娘@色劑，或通過紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進行觀察。也可采用在第一種移動相展開后再用另一移動相進行展開（這時的展開方向應與原方向垂直），使各成分分離完全的雙相層析（two-dimensionalchromatography）。分離后，將斑點位置的固定相切取下來，把其中含有來自試料的物質提取進行定量分析。但為制備與定量，柱層析則更為適宜。在柱層析中，移動相從加入試料的一端展開到達另一端后，繼續(xù)展開使各成分和移動相一起向柱外分別溶出，這就是廣泛使用的所謂洗提層析（elutionchromatography）。層析根據(jù)固定相與溶質（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型（離

子交換層析）等三種類型。但這并不是很嚴格的，有時常見到其中間類型。此外，近來也應用親和層析，即將與基質類似的化合物（通常為共價鍵）結合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對應的特定的酶或蛋白質。按層析的機理劃分：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析:利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。?按流動相與固定相的不同劃分：氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區(qū)分流動相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。?按操作形式劃分：柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。柱層析：將固定相裝于柱，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。鑒定的目的。薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。以上劃分無嚴格界限，有些名稱相互交叉，如親和層析應屬于一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析?；驹韺游鲰氃趦上嘞到y(tǒng)間進行。一相是固定相，需支持物，是固體或液體。另一相為流動相，是液體或氣體。當流動相流經(jīng)固定相時，被分離物質在兩相間的分配，由平衡狀態(tài)到失去平衡到又恢復平衡，即不斷經(jīng)歷吸附和解吸的過程。隨著流動相不斷向前流動，被分離物質間出現(xiàn)向前移動的速率差異，由開始的單一區(qū)帶逐漸分離出許多區(qū)帶,這個過程叫展層。系數(shù)K是物質在兩相中的濃度比oK值大，則在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物質間的K值差別大，則易被分離。不同類型層析的K值含義不同,可視為吸附平衡常數(shù),分配常數(shù)或離子交換常數(shù)等o研究層析現(xiàn)象而發(fā)展的塔板理論,與有機化學實驗中的分餾法原理有些相似。被分餾的有機溶劑在分餾柱的填充物上形成許多熱交換層，從而把低沸點溶劑先分餾出來,達到純化的目的。在層析時用理論塔板數(shù)n來衡量層析效能。tR為物質在層析柱上的保留時間，W為洗脫下來的物質峰形的寬度。門值愈大表示層析柱的效能愈高。如用值愈大表示層析柱的效能愈高。如用理論塔板高度H表示，則包含了層析柱長度的因子。式中1為層析柱的柱長。H值越大，則柱效越低。此外影響層析分離效果的還有渦流擴散、縱向擴散和傳質阻抗等因素。因此選擇層析固定相支持物的粒度、均勻度等物理性能，流動相的層析系統(tǒng)和溫度等都是做好層析的關鍵幾種常用的層析.吸附層析吸附劑的吸附力強弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來決定。被吸附物的化學結構如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、淀粉和糖等。以活性炭的吸附力最強。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數(shù)吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用于能溶于有機溶劑的有機化合物的分離，較少用于無機化合物。洗脫溶劑的解析能力的強弱順序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數(shù)種不同強度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統(tǒng)，以獲得最佳分離效果。

.分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等，這些親水物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區(qū)帶。.離子交換層析支持物是人工交聯(lián)的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團的，如磺酸基（-SO3H）、羧甲基（一CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE一（二乙基胺乙基）和QAE一（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用于能在水中解離的化合物，包括有機物和無機物。對于蛋白質、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離后,能吸引水中被分離物的離子，各種物質在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態(tài)，各種離子有不同的交換常數(shù),K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變PH,增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區(qū)帶。?凝膠過濾層析支持物是人工合成的交聯(lián)高聚物，在水中膨脹后成為凝膠。凝膠為水層，凝膠周圍的水為外水層?？刂平宦?lián)度以形成不同孔徑的網(wǎng)狀結構。交聯(lián)度小的孔徑大，交聯(lián)度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質中小于孔徑的分子進入，大于孔徑的分子被排斥在外水層，最先被洗脫下來。而進入

孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區(qū)帶。選擇不同規(guī)格的凝膠，可把一個混合物按分子量的差異分成不同的組分。這種方法曾被稱為分子篩。目前常用的凝膠商品有：葡聚糖凝膠(sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠(bio-gel)、瓊脂糖凝膠(sepharose)和聚苯乙烯凝膠(styragel)等。.親和層析在一對有專一的相互作用的物質中，把其中之一聯(lián)結在支持物上，用于純化相對的另一物質。常見的親和對如：酶和抑制劑，抗原和抗體，激素和受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。.氣相層析屬于分配層析或吸附層析，僅適用于分析分離揮發(fā)性和低揮發(fā)性物質。固定相是在惰性支持物(如磨細的耐火磚)上覆蓋一層高沸點液體，如硅油、高沸點石蠟和油脂、環(huán)氧類聚合物。外涂層約為支持物重量的20%。分析時操作溫度圍，一般從室溫到200℃。特殊的層析柱能達到500℃。流動相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區(qū)帶十分清晰，是由于揮發(fā)性物質在兩相間能很快達到平衡，所需分析時間大為縮短，一般為數(shù)分鐘至10余分鐘。檢測記錄系統(tǒng)繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優(yōu)點。氣相層析也能用于分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。.紙層析以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質，能形成水相和展層溶劑的兩相系統(tǒng)，被分離物質在兩相中的分配保持平衡關系。紙層析用于分析簡單的混合物時可做單向層析。對于復雜的混合物，可做雙向層析。雙向層析。1944年A.J.P.馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創(chuàng)了近代層析的發(fā)展和應用的新局面。70年代以后，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替。.薄層層析在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1~2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等，根據(jù)需要做不同類型的層析。聚酰胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解于濃甲酸中,涂在滌綸片基上，當甲酸揮發(fā)后，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高，展層時間短。例如用紙層析做氨基酸分析,往往需要兩天時間，而且對層析條件要求嚴格，不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時，分離效果更好。薄層層析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制備樣品。.高效液相層析(又名高壓液相色譜)70年代新發(fā)展的層析法。其特點是：用高壓輸液泵，壓強最高可達5000psi(相當于34個標準大氣壓)。用直徑約3~10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層1~2微米的二氧化硅，經(jīng)硫酰氯反應生成Si—Cl,進一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37,或陽離子交換基團—Si(CH2)n—C6H4SO3H,或陰離子交換基團—Si(CH2)nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學性能穩(wěn)定。用不同類型支持物的HPLC,可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可

達10-10克水平。但用于制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發(fā)和極性物質。而氣相層析只適用于揮發(fā)性物質，兩者互為補充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數(shù)據(jù)處理的積分儀和記錄儀等電子系統(tǒng)，成為一種先進的分析儀器，在生物化學、化學、醫(yī)藥學和環(huán)境科學的研究中發(fā)揮了重要作用。.反相層析在吸附層析中，高極性物質在層析柱上吸附較牢，洗脫時發(fā)生拖尾現(xiàn)象和保留時間長的問題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類,洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合