色譜分析法基礎(chǔ)演示文稿

色譜分析法基礎(chǔ)演示文稿當(dāng)前第1頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)（優(yōu)選）色譜分析法基礎(chǔ)當(dāng)前第2頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)經(jīng)典的分離方法：沉淀、蒸餾和萃??；現(xiàn)代分析中，大量采用色譜和電泳分離方法。迄今為止，色譜方法是最為有效的現(xiàn)代分離分析手段！2.1 概述

色譜法是一種物理化學(xué)分離方法。將這種分離方法與適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段相結(jié)合，應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域，就是色譜分析法。當(dāng)前第3頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)一、色譜法簡介色譜法早在1906年由俄國植物學(xué)家M·Rswett(茨維特)使用CaCO3粉末作為，石油醚作為,玻璃管作為，分離植物中色素時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名的“色譜法”(chromatography)色譜法是一種分離技術(shù)，其研究對(duì)象是復(fù)雜的混合物質(zhì)。固定相流動(dòng)相色譜柱當(dāng)前第4頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)二、色譜法的歷史俄國植物學(xué)家茨維特Tsweet首先將這種層析現(xiàn)象用于分離植物色素紅蘿卜素、葉黃素和葉綠素A、B，并將這種方法命名為色譜法——液-固色譜（是最先創(chuàng)立的色譜方法）20年后（1931）Kuhn（庫恩）為了證實(shí)蛋黃中的葉黃素是植物葉黃素與玉米黃質(zhì)的混合物，參考了Tsweet的論文并采用的色譜法進(jìn)行其研究工作（吸附色譜）1938年，Martin（馬?。┖蚐ynge（辛格）采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動(dòng)相分離乙?；被岵⑶姨岢隽松V塔板理論——分配色譜

當(dāng)前第5頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)1951年，Martin和James采用氣體作為流動(dòng)相，以自動(dòng)滴定儀作為檢測(cè)器分析脂肪酸——?dú)庀嗌V法。建立形成色譜學(xué)理論中有著重要地位的塔板理論和VanDeemter方程，以及保留時(shí)間、保留指數(shù)、峰寬等概念。

1952年，A.J.P.Martin和R.L.M.Synge獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。在他們獲得諾貝爾獎(jiǎng)的論文中還指出“采用氣體代替液體作為流動(dòng)相分離各類化合物的可能性是存在的?！薄叭绻鲃?dòng)相用氣體來代替，對(duì)分離更有好處”，“使用非常細(xì)的顆粒填料和柱的兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到較小的理論塔板商”當(dāng)前第6頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)1957年，Golay又提出了使用毛細(xì)管柱代替填充柱可獲得極高的分離效率——毛細(xì)管氣相色譜法從此，氣相色譜法得以蓬勃發(fā)展。氣相色譜學(xué)的誕生及其獲得廣泛的應(yīng)用使色譜學(xué)逐漸成為分析化學(xué)的一個(gè)重要分支學(xué)科1960年代，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易汽化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭等人開發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時(shí)代。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法(HPLC)正式建立。1937-1972年，15年中有12個(gè)Nobel獎(jiǎng)是有關(guān)色譜研究的！當(dāng)前第7頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)三、色譜的分類1.色譜過程中兩相的物理狀態(tài)分類2.色譜分離過程的作用原理分類3.固定相的使用分類當(dāng)前第8頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)1.色譜過程中兩相的物理狀態(tài)分類3）超臨界流體色譜(SFC)1）氣相色譜(GC)：氣—固色譜（GSC）、氣—液色譜（GLC）2）液相色譜(LC)：液—固色譜（LSC）、液—液色譜（LLC）當(dāng)前第9頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)2.色譜分離過程的作用原理分類吸附色譜法adsorptionchromatography分配色譜法

partitionchromatography離子交換色譜法ionexchangechromatography空間排阻色譜法stericexclusionchromatography不同組份在固定相的吸附作用不同不同組份在固定相上的溶解能力不同不同組份在固定相（離子交換劑）上的親和力不同不同尺寸分子在固定相上的滲透作用當(dāng)前第10頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)3.固定相的使用的形式分類柱色譜columnchromatography平面色譜

planechromatography紙色譜法

paperchromatography薄層色譜法

thinlayerchromatography當(dāng)前第11頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)四、色譜法的特點(diǎn)（1）分離效率高復(fù)雜混合物，有機(jī)同系物、異構(gòu)體，手性異構(gòu)體。（2）靈敏度高可以檢測(cè)出μg/g(10-6)級(jí)甚至ng/g

(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。（3）分析速度快一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。（4）應(yīng)用范圍廣氣相色譜：沸點(diǎn)低于350℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜：高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析和制備。當(dāng)前第12頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)2.2

色譜流出曲線及有關(guān)術(shù)語一、色譜分離過程及流出曲線二、色譜相關(guān)術(shù)語三、色譜流出曲線的意義當(dāng)前第13頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)一、色譜分離過程及流出曲線1、色譜分離過程混合組分的分離過程及檢測(cè)器對(duì)各組份在不同階段的響應(yīng)當(dāng)前第14頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)色譜分離基本原理：

使用外力使含有樣品的流動(dòng)相（氣體、液體或超臨界流體）通過一固定于柱或平板上、與流動(dòng)相互不相溶的固定相表面。樣品中各組份在兩相中進(jìn)行不同程度的作用。與固定相作用強(qiáng)的組份隨流動(dòng)相流出的速度慢，反之，與固定相作用弱的組份隨流動(dòng)相流出的速度快。由于流出的速度的差異，使得混合組份最終形成各個(gè)單組份的“帶(band)”或“區(qū)(zone)”，對(duì)依次流出的各個(gè)單組份物質(zhì)可分別進(jìn)行定性、定量分析。當(dāng)前第15頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)由檢測(cè)器輸出的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間作圖，所得曲線即色譜流出曲線，也稱色譜圖

。2、色譜流出曲線當(dāng)前第16頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)1、色譜峰（peak）：當(dāng)某組分從色譜柱中流出時(shí)，檢測(cè)器對(duì)該組分的響應(yīng)信號(hào)隨時(shí)間變化所形成的峰形曲線。

2、基線（baseline）：在正常操作條件下（操作條件穩(wěn)定后），僅有流動(dòng)相通過檢測(cè)器時(shí)，儀器記錄到的一條平行于橫軸的直線。圖中CD所示。

2)基線漂移（baselinedrift）：基線隨時(shí)間定向的緩慢變化。1)基線噪聲（baselinenoise）：由各種因素引起的基線起伏。3、峰高（peakheight）：色譜峰頂點(diǎn)與基線的距離。以h表示，圖中AB。二、色譜相關(guān)術(shù)語當(dāng)前第17頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)1)標(biāo)準(zhǔn)偏差（standarddeviation）：0.607倍峰高處色譜峰寬度的一半，圖中EF的一半。2)半峰寬（peakwidthathalf-height）Y1/2：峰高一半處的峰寬，圖中GH

。

Y1/2=2.353)峰底寬(peakwidthatpeakbase)Y：色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上切線在基線上的截距，圖中IJ

。Y=44、區(qū)域?qū)挾龋╬eakwidth）：用于衡量柱效及反映色譜操作條件下的動(dòng)力學(xué)因素。通常有三種表示方法：通常表示區(qū)域?qū)挾犬?dāng)前第18頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)1）死時(shí)間(deadtime)

tM：不被固定相吸附或溶解的組分（如空氣、甲烷）從進(jìn)樣到出現(xiàn)其色譜蜂最大值所需的時(shí)間，圖中O'A'所示。tM也是流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱所需的時(shí)間。據(jù)tM

可求出流動(dòng)相平均流速5、保留值R（retentionvalue）：是試樣各組分在色譜柱中滯留時(shí)間的數(shù)值，它反映組分與固定相間作用力大小，通常用保留時(shí)間和保留體積表示。它是色譜定性分析和色譜過程熱力學(xué)特性的重要參數(shù)。

當(dāng)前第19頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)3）調(diào)整保留時(shí)間(adjustedretentiontime)

t'R

：扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間，它是組分在固定相中的滯留時(shí)間。圖中A'B所示，即t'R=tR－tM

t'R反映了組分在色譜過程中，與固定相相互作用所消耗的時(shí)間，是各組分產(chǎn)生差速遷移的物理化學(xué)基礎(chǔ)。

2)

保留時(shí)間(retentiontime)

tR：指某組分通過色譜柱所需時(shí)間，即試樣從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值時(shí)的時(shí)間，圖中Ｏ'Ｂ所示。

在一定色譜體系和操作條件下，任何一種化合物都有一個(gè)確定的保留時(shí)間，這是色譜定性的依據(jù)。

當(dāng)前第20頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)4）死體積(deadvolume)

VM：色譜柱內(nèi)載氣所占的體積。6）調(diào)整保留體積（adjustedretentionvolume)

V'R

：扣除死體積后的保留體積。

5）保留體積(retentionvolume)

VR：指從進(jìn)樣到待測(cè)物在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相的體積。其中，qv,o為柱出口的載氣流速（mL?min-1)當(dāng)前第21頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)7）相對(duì)保留值（relativeretentiontime）r21：組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比。注意：

1、

r21只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱內(nèi)徑、柱長L、填充情況及流動(dòng)相流速無關(guān)，因此，在色譜分析中，尤其是GC中廣泛用于定性的依據(jù)！2、

r21亦可用來表示固定相（色譜柱）的選擇性α。r21值越大，相鄰兩組分的t’R相差越大，分離得越好。r21＝1，兩組分不能被分離。選擇性因子α當(dāng)前第22頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)三、色譜流出曲線的意義（重要信息

）：色譜峰數(shù)＝樣品中單組份的最少個(gè)數(shù)；色譜保留值——定性依據(jù)；色譜峰高或面積——定量依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾取V柱分離效能評(píng)價(jià)指標(biāo)；色譜峰間距——固定相或流動(dòng)相選擇是否合適的依據(jù)。當(dāng)前第23頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)2.3色譜基本理論一、描述分配過程的參數(shù)二、色譜分離的基本理論塔板理論速率理論當(dāng)前第24頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)一描述分配過程的參數(shù)分配系數(shù)(Distributionconstant,K)分配系數(shù)是由組分和固定相的熱力學(xué)性質(zhì)決定的，它是每一個(gè)溶質(zhì)的特征值，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關(guān)。在氣相色譜中與兩個(gè)變量有關(guān)：固定相和溫度在液相色譜中與三個(gè)變量有關(guān)：固定相、流動(dòng)相和溫度。描述組分在固定相和流動(dòng)相間的吸附-脫附過程或溶解-揮發(fā)過程（分配）的參數(shù)，稱為分配系數(shù)。當(dāng)前第25頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)2.分配比(Retentionfactororcapacityfactor,容量因子，容量比，k)

在一定溫度和壓力下，組分在兩相間的分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。某組分的k值可由實(shí)驗(yàn)測(cè)得，它等于該組分的調(diào)整保留時(shí)間與死時(shí)間的比值

，即當(dāng)前第26頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)3.K、k與選擇因子α的關(guān)系：兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。稱為相比，它也是反映色譜柱柱型及其結(jié)構(gòu)的重要特性。對(duì)填充柱，=6~35；對(duì)毛細(xì)管柱，=50~1500。當(dāng)前第27頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)結(jié)論：K

或k反映的是某一組分在兩相間的分配，它們都與組分及兩相的性質(zhì)有關(guān)，并隨柱溫、柱壓的變化而變化。K與兩相體積無關(guān)，而k則隨固定相的量而改變。如果兩組分的K或k值相等，則α=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說明無法實(shí)現(xiàn)分離。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。當(dāng)前第28頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)塔板理論（Platetheory)1.塔板理論的假設(shè)2.理論塔板高度和理論塔板數(shù)3.有效塔板高度和有效塔板數(shù)4.塔板理論的不足當(dāng)前第29頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)1952年，Martin和Synge提出。用塔板概念來描述組分在柱中的分配行為。分餾塔：在塔板上多次氣液平衡，按沸點(diǎn)不同而分離。塔板是從精餾塔中借用的，是一種半經(jīng)驗(yàn)理論，但它成功地解釋了色譜流出曲線呈正態(tài)分布。色譜柱：組分在兩相間的多次分配平衡，按分配系數(shù)不同而分離。當(dāng)前第30頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)1.塔板理論的假設(shè)（3）試樣開始時(shí)都在第0號(hào)塔板上，且試樣沿色譜柱方向的縱向擴(kuò)散可略而不計(jì)。（4）分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。（1）在柱內(nèi)一小段長度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡。這一小段長稱為理論塔板高度H。（2）載氣進(jìn)入色譜柱，不是連續(xù)的而是脈動(dòng)式的，每次進(jìn)氣為一個(gè)板體積。當(dāng)前第31頁\共有34頁\編于星期一\14點(diǎn)塔板號(hào)01234567891mg進(jìn)樣(平衡前)0.5mg(平衡后)0.5mg(平衡前)1V0.5mg0.5mg0.25mg(平衡后)1V0.25mg0.25mg0.25mg(平衡前)2V0.25mg0.25mg0.25mg0.25mg0.125mg(平衡后)2V0.25mg0.25mg0.125mg0.125mg0.125mg0.1250.250.125(平衡前)3V0.1250.250.125(平衡后)3V

0.0630.1870.1870.063

0.0630.1870.1870.063(平衡前)4V

0.0630.1870.1870.063

0.0630.1870.1870.063(平衡后)4V

0.0320.1200.1870.120.032

0.0320.1200.1870.120.032(平衡前)5V

0.0320.1200.1870.120.032

0.0320.1200.1870.120.032(平衡后)5V

0.0160.0760.1430.1430.0760.016

0.0160.0760.1430.1430.0760.016(平衡前)6V

0.0160.0760.1430.1430.0760.016

0.0160.0760.1430.1430.0760.016(平衡后)6V

0.0080.04