講解分子技術在腫瘤靶向藥物治療的應用演示文稿

講解分子技術在腫瘤靶向藥物治療的應用演示文稿當前第1頁\共有64頁\編于星期一\14點（優(yōu)選）講解分子技術在腫瘤靶向藥物治療的應用當前第2頁\共有64頁\編于星期一\14點熒光原位雜交（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH

）技術

當前第3頁\共有64頁\編于星期一\14點簡介FISH=FluorescenceInSituHybridization利用熒光標記的DNA探針檢測組織或細胞內(nèi)與其互補的DNA片段應用：遺傳病診斷血液腫瘤實體瘤樣本：羊水、絨毛、流產(chǎn)組織、外周血、骨髓、體液及各種腫瘤組織等當前第4頁\共有64頁\編于星期一\14點用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位熒光標記探針探針變性樣本DNA變性雜交工作原理當前第5頁\共有64頁\編于星期一\14點FISH檢測染色體易位（Translocation）在淋巴瘤分型中的應用FISH技術在淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中的應用當前第6頁\共有64頁\編于星期一\14點檢測技術特點不同類型的淋巴瘤染色體易位類型不同優(yōu)點適用于形態(tài)學上難以診斷且IHC結果不理想的標本；適用于細胞數(shù)量少，形態(tài)不典型的活檢及穿刺組織。必須結合組織形態(tài)學和免疫組化結果作最后診斷?。。‘斍暗?頁\共有64頁\編于星期一\14點FISH基因檢測在淋巴瘤的應用淋巴瘤FISH檢測基因臨床應用套細胞淋巴瘤IGH/CCND1融合基因輔助診斷濾泡性淋巴瘤BCL2/IGH融合基因輔助診斷、判斷預后彌漫性大B細胞淋巴瘤BCL6基因斷裂重組輔助診斷、判斷預后伯基特淋巴瘤C-MYC基因斷裂重組輔助診斷粘膜相關淋巴組織淋巴瘤MALTI基因斷裂輔助診斷胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤API2-MALTI融合基因指導治療當前第8頁\共有64頁\編于星期一\14點彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）

按免疫組化亞型分為

CD5陽性DLBCL

生發(fā)中心B細胞樣變型(GCB)、非生發(fā)中心B細胞樣變型(non-GCB)3類可根據(jù)CD10、BCL6、MUM1的表達區(qū)分生發(fā)中心B細胞樣變型、非生發(fā)中心B細胞樣變型。>30%瘤細胞表達CD10或CD10(-)、BCL-6(+)、MUM-1(-)診斷為GCB;其他病例則為non-GCB。

當前第9頁\共有64頁\編于星期一\14點◆BCL6基因斷裂---輔助診斷彌漫性大B細胞淋巴瘤◆BCL6基因斷裂重排----判斷預后目前研究確定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。

一項針對102名DLBCL患者的BCL6重排情況及其與預后關系的研究顯示，BCL6陽性患者診斷治療36個月后，疾病停止發(fā)展的比率為82%，攜帶有BCL6重排的病例預后較好。BCL6基因斷裂與彌漫性大B細胞淋巴瘤當前第10頁\共有64頁\編于星期一\14點當前第11頁\共有64頁\編于星期一\14點Offit,K.NEnglJMed,1994.331(2):p.74-80.結果判讀當前第12頁\共有64頁\編于星期一\14點IGH/CCND1融合基因可見于95%的套細胞淋巴瘤，是套細胞淋巴瘤與其他淋巴瘤鑒別的重要指標。IGH/CCND1融合基因--輔助診斷套細胞淋巴瘤。IGH/CCND1融合基因與套細胞淋巴瘤當前第13頁\共有64頁\編于星期一\14點l正常細胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l異常細胞：一個紅色信號，一個綠色信號，兩個融合信號。當前第14頁\共有64頁\編于星期一\14點API2/MALT1基因檢測試劑盒

探針：GLPAPI2/GLPMALT1凋亡抑制因子2基因（apoptosisinhibitor-2,API2）,位于11號染色體;粘膜相關淋巴組織基因（Mucosa-associatedlymphoidtissue1,MALT1

），位于18號染色體。

API2基因與MALT1基因的融合導致凋亡抑制的增加，引起細胞不依賴于抗原刺激的生存優(yōu)勢。

當前第15頁\共有64頁\編于星期一\14點

API2/MALT1融合基因的檢測可以指導抗HP治療胃MALT淋巴瘤與幽門螺旋桿菌（HP）感染導致的慢性胃炎有關，MALT1/API2融合基因陰性的患者抗HP治療有效，陽性患者抗HP治療無效。API2/MALT1融合基因檢測意義

當前第16頁\共有64頁\編于星期一\14點l正常細胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l異常細胞：一個紅色信號，一個綠色信號，兩個融合信號。當前第17頁\共有64頁\編于星期一\14點BCL2/IGH重排發(fā)生在約80%-85%的FL患者中，檢測BCL2/IGH基因重排可以輔助診斷FL。

BCL2/IGH陰性的FL患者3年生存率為100%，而陽性者只有54%；陰性者3年疾病無進展為87.5%，而陽性者只有13%。BCL2/IGH融合基因與濾泡性淋巴瘤

BCL2/IGH融合基因-----輔助診斷濾泡性淋巴瘤

BCL2/IGH融合基因-----判斷預后當前第18頁\共有64頁\編于星期一\14點l正常細胞：兩個紅色信號，兩個綠色信號。l異常細胞：一個紅色信號，一個綠色信號，兩個融合信號。當前第19頁\共有64頁\編于星期一\14點結果判讀-陽性結果當前第20頁\共有64頁\編于星期一\14點結果判讀-陽性結果當前第21頁\共有64頁\編于星期一\14點

約80%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(8；14)（q24;q32）；約15%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(2；8)(p11;q24)；約5%發(fā)生t(8；22)（q24;q11）。

染色體易位導致C-MYC基因斷裂重組可能是伯基特淋巴瘤的一個標志，可以應用于臨床上伯基特淋巴瘤的輔助診斷。C-MYC基因斷裂與伯基特淋巴瘤輔助診斷伯基特淋巴瘤

當前第22頁\共有64頁\編于星期一\14點當前第23頁\共有64頁\編于星期一\14點結果判讀-陽性結果當前第24頁\共有64頁\編于星期一\14點FISH技術在乳腺癌靶向治療應用當前第25頁\共有64頁\編于星期一\14點乳腺癌

Her-2基因

致癌基因：Her-2基因；位點：17q11.2-q12；編碼蛋白：跨膜蛋白（與表皮生長因子受體部分同源）；

25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴增；

HER-2基因擴增是決定Herceptin治療是否有效的關鍵性指標。HER2擴增的乳腺癌更具有侵襲性生長能力。當前第26頁\共有64頁\編于星期一\14點乳腺癌Her-2基因及蛋白檢測Cerb-B-2:3+

完全強膜陽性細胞>30%

2+,1+,-

FISH檢測是否有基因擴增當前第27頁\共有64頁\編于星期一\14點Her2基因檢測流程石蠟組織標本IHC檢測再用FISH方法檢測—1+3+2+—+Herceptin治療+再用FISH方法檢測Herceptin治療FISH檢測+—再用FISH方法檢測+當前第28頁\共有64頁\編于星期一\14點A.無須計數(shù)的大簇團信號（高度擴增）B.顆粒狀信號（R>10，高度擴增）C.須計數(shù)的顆粒狀信號（R=3.5，低度擴增）ACBHer-2基因擴增狀況當前第29頁\共有64頁\編于星期一\14點>30%的腫瘤細胞全部的細胞膜高強度著色免疫組化（3+）與FISH對比×40×100浸潤性導管癌Ⅱ級IHC：+++FISH：呈簇團狀高度擴增×100當前第30頁\共有64頁\編于星期一\14點免疫組化（－）與FISH擴增陽性浸潤性導管癌Ⅱ級IHC：－FISH：呈簇狀擴增腫瘤細胞不著色×40×100當前第31頁\共有64頁\編于星期一\14點基因突變檢測方法當前第32頁\共有64頁\編于星期一\14點1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage)2.變性梯度凝膠電泳(DGGE)3.雜合雙鏈分析法(HA)4.化學切割錯配(CCM)5.碳化二亞胺檢測(Carbodiimide,CDI)6.酶促切割錯配(EnzymeMismatchCleavage,EMC)7.單鏈構象多態(tài)性(Single-StrandConformation)8.切割片段長度多態(tài)性9.DNA測序(Sequencing)10.雙脫氧指紋圖譜法(DideoxyFinger-printing,ddF)11.錯配接合蛋白檢測12.蛋白截短測試（proteintruncationtest）方法當前第33頁\共有64頁\編于星期一\14點13.變性的高效液相色譜檢測(DenaturingHighPerformanceLiguldChromatographyDHPLC)14.DNA芯片技術(DNAchip)15.等位基因特異性擴增16.等位基因特異性寡核苷酸片段分析(Allele-SpecificOligonucleotide,ASO)17.引物延伸檢測(PrimerExtension,PEX)18.寡核苷酸連接檢測(OligonucleotideLigationAssay,OLA)19.限制性片段分析(RestrictionFragmentAnalysis）20.突變體富集PCR法（mutant-enrichedPCR）21.蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpionsamplificationrefractorymutationsystem）當前第34頁\共有64頁\編于星期一\14點肺癌組織EGFR基因擴增和

突變檢測及其臨床意義當前第35頁\共有64頁\編于星期一\14點研究背景研究顯示吉非替尼對部分晚期NSCLC患者的治療效果非常顯著。存在EGFR基因突變的患者更有可能對吉非替尼的治療敏感。存在EGFR基因擴增的肺癌、腸癌病人對分子靶點藥物更為敏感。檢測大腸癌有無EGFR過度表達，只要>1%的癌細胞的胞膜強陽性染色即判斷為3+，可作為應用西妥昔單抗的指征。當前第36頁\共有64頁\編于星期一\14點

FISH檢測EGFR基因擴增標本類型：石蠟包埋組織（手術、活檢、穿刺）冰凍組織胸、腹水沉渣細胞探針類型：GLPEGFR/CSP7

定量PCR檢測EGFR基因突變分型突變類型：19exon（2235-2249位點）15bp缺失突變

19exon（2240-2257位點）18bp缺失突變

19exon（2240-2251位點）12bp缺失突變

21exon2573位點T>G堿基置換突變

21exon2582位點T>G堿基置換突變

EGFR基因變異檢測當前第37頁\共有64頁\編于星期一\14點當前第38頁\共有64頁\編于星期一\14點雙體性三體性多體性擴增EGFR基因FISH檢測狀況肺癌石蠟當前第39頁\共有64頁\編于星期一\14點當前第40頁\共有64頁\編于星期一\14點

FQ-PCR分型技術檢測EGFR突變當前第41頁\共有64頁\編于星期一\14點存在EGFR突變肺癌樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖71例肺癌組織中檢測出6例突變樣本當前第42頁\共有64頁\編于星期一\14點FQ-PCR檢測15bp缺失陽性病例結果

紅色閾值線以上的擴增曲線即為陽性標本的擴增曲線，按熒光信號值的高低依次為9號、12號、13號、55號、38號和33號標本

當前第43頁\共有64頁\編于星期一\14點15bp缺失突變型DNA的測序圖

senseantisense當前第44頁\共有64頁\編于星期一\14點紅色閾值線以上的擴增曲線即為陽性標本的擴增曲線，按熒光信號值的高低依次為2號、36號、和40號標本FQ-PCR檢測18bp缺失陽性病例結果當前第45頁\共有64頁\編于星期一\14點目前K-RAS突變檢測常用技術當前第46頁\共有64頁\編于星期一\14點方法直接測序焦磷酸測序高分辨率熔解曲線PCR-RFLP芯片雜交Real-TimePCR當前第47頁\共有64頁\編于星期一\14點腫瘤組織的確認和篩選顯微切割腫瘤提取DNA相應的PCR反應或雜交相關的分析和檢測K-ras突變檢測基本流程圖當前第48頁\共有64頁\編于星期一\14點直接測序(DirectSequencing)PCR擴增后產(chǎn)物直接測序雙脫氧核苷酸鏈終止法(Sanger法)DNA片段是熒光標記的，這些片段經(jīng)過平板膠電泳或毛細管電泳得到分離，熒光分子被激發(fā)而發(fā)光，發(fā)出的光信號被檢測系統(tǒng)檢測當前第49頁\共有64頁\編于星期一\14點當前第50頁\共有64頁\編于星期一\14點K-ras突變檢測結果當前第51頁\共有64頁\編于星期一\14點療效預測標志物與預后判斷標志物療效預測標志物：

能夠預測某種特定治療方式療效的標記物KRAS基因突變導致腫瘤對EGFR抑制劑抵抗預后判斷標志物：

在不考慮治療因素的情況下能夠判斷患者結局的標記物18號染色體長臂（18q）缺失

某些分子標志物兼具兩種作用胸腺嘧啶合成酶（Thymidylatesynthase）當前第52頁\共有64頁\編于星期一\14點EGFR作為預后因子的價值EGFRexpressioncorrelateswithpoorprognosisDFS=Disease-freesurvival;OS=overallsurvivalTumortypePrognosisSurvivalRiskofmetastasisReferencesColorectalPoorPoor-DecreasedOSIncreased-Hemming(1992)Mayer,DeJong(1992)Head&Neck(SCCHN)PoorPoorDecreasedDFSDecreasedOS--Grandis(1998)

Maurizi(1996)Lung(NSCLC)PoorPoorDecreasedOS

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IncreasedOhsaki(2000)

Pavelic(1993)當前第53頁\共有64頁\編于星期一\14點Cetuxamab(西妥昔單抗)人源化嵌合單抗（IgG1）靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）阻斷EGF和TGFα與EGFR的結合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的腫瘤生長200４年獲得FDA審批資格治療結直腸癌Panitumumab（帕尼單抗）完全人源化單克隆抗體(IgG2)靶向作用于表皮生長因子受體（EGFR）2005年7月獲得FDA快速通道審批資格治療結直腸癌結直腸癌分子靶向治療藥物

當前第54頁\共有64頁\編于星期一\14點KRAS突變KRAS突變可不依賴EGFR受體途徑，自行激活RAS/MAPK通路導致ERBITUX耐藥KRAS突變與Erbitux療效及患者生存相關KRAS突變并非孤立事件KRAS突變常伴隨BRAF突變，并與CpG島甲基化表型(CIMP)1,2相關KRAS突變常伴隨PI3K突變3

LièvreA,etal.JClinOncol2008;26:374–379MAPK=mitogen-activatedproteinkinase當前第55頁\共有64頁\編于星期一\14點K-ras基因野生型患者能從這類藥物治療中獲益。K-ras基因突變型患者并不能從抗EGFR治療中獲益,反而徒增不良反應危險和治療費用；抗EGFR治療和K-ras突變相互排斥K-ras基因抗EGFR治療關系密切當前第56頁\共有64頁\編于星期一\14點2009年7月FDA批準了對西妥昔單抗和帕尼單抗說明書標簽的修改：

結直腸癌分子靶向治療藥物

注明KRAS基因突變的結直腸癌患者不推薦這使用這兩種用藥物。

當前第57頁\共有64頁\編于星期一\14點

K-ras基因突變:20-60%結直腸癌

K-ras基因突變發(fā)生在腫瘤惡變的早期，原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的K