第4章氨基酸發(fā)酵生產工藝課件

生物制藥工程

第四章氨基酸發(fā)酵生產工藝4.1概述4.2谷氨酸發(fā)酵生產工藝4.3賴氨酸發(fā)酵生產工藝4.1.1氨基酸種類與命名羧酸中α碳上的一個原子被氨基取代而成的一類化合物，屬于氨基取代羧酸。R為其他基團，不同氨基酸在于R不同。手型碳原子，旋光性和D、L兩種異構體。（除了甘氨酸，R=H）氨基酸常用其英文三字母或單字母縮寫。組成蛋白質的氨基酸有20種，多數為L-型，也是人體能吸收利用的活性形式COOHRH2NHC初級代謝產物根據R基團的化學結構不同，分為：15種脂肪族的，2種芳香族的，2種雜環(huán)的，以及1種亞基氨基酸。根據R基團的極性，分為：12種極性與8種非極性根據酸堿性，分為：2種酸性的，3種堿性的，以及15種中性氨基酸。根據人體生理生化過程能否合成，分為：(8+2)種必需和10種非必需氨基酸應用：藥品、食品、飼料、化工等4.1.2氨基酸的理化性質無色晶體，熔點200~300℃，一般溶于水、稀酸稀堿，不溶于乙醚、氯仿等有機溶劑，常用乙醇沉淀氨基酸。除甘氨酸外，有旋光性，測定比旋度可鑒定氨基酸的純度。芳香族氨基酸在紫外有吸收峰，可用于鑒別、合成、定性和定量分析中。氨基酸是弱的兩性電解質，在酸性環(huán)境，帶正電荷；堿性環(huán)境，帶負電荷；凈電荷為0時的pH值為等電點pI。由于靜電作用，等電點時，溶解度最小，容易沉定，可用于氨基酸的制備。氨基酸分子量pK1（-COOH）pK2（-NH2）pK3（-R）pI溶解度a%物理性狀甘氨酸75.072.539.785.9724.99單斜晶丙氨酸89.102.359.876.0016.51菱形晶纈氨酸117.152.299.745.968.89片晶或柱晶亮氨酸131.182.339，745.982.19片晶異亮氨酸131.182.329.766.024.12片晶絲氨酸105.092.199.215.685.02片晶或柱晶蘇氨酸119.122.099.106.161.59斜方晶半胱氨酸121.161.9210.708.375.07晶粉甲硫氨酸149.212.139.285.743.38六角形片晶天門冬氨酸133.111.999.903.902.770.05菱形片晶谷氨酸147.132.109.474.073.220.84四角形晶賴氨酸146.192.169.0610.549.7473.9單斜晶精氨酸174.201.828.9912.4810.7685.56柱晶或片晶谷氨酰胺146.152.179.135.650.72斜方晶天門冬酰胺132.122.148.725.412.85針狀晶苯丙氨酸165.192.209.315.482.96片晶酪氨酸181.192.209.2110.465.660.045絲粉針晶色氨酸204.232.469.415.891.13六角形片晶組氨酸155.161.809.336.047.594.29片晶脯氨酸115.131.9510.646.3062.30柱晶或針狀晶a25℃水中溶解度4.1.3氨基酸的FDA相關法規(guī)主成分藥（非牛來源）

口服制劑，全輸液注射營養(yǎng)品，大體積輸液用藥輔料緩沖液（甘氨酸、組氨酸），穩(wěn)定劑（甘氨酸），抗氧化劑（甲硫氨酸、半胱氨酸）試劑

緩沖液的成分，多肽合成的成分，細胞培養(yǎng)基成分不同用途對氨基酸的來源和生產方法有法規(guī)的制約；純度和安全性至關重要注：FDA指食品和藥物管理局4.1.4氨基酸生產工藝研究氨基酸的制造始于1820年，用蛋白質酸水解工藝生產氨基酸。1950年，化學合成。1956年，分離到谷氨酸棒狀桿菌，日本首次微生物發(fā)酵成功。1957年，谷氨酸鈉（味精）商業(yè)化。1973年，固定化酶成功生產天門冬氨酸。目前已能生產20余種氨基酸，絕大多數氨基酸應用發(fā)酵法或酶法生產，極少數為天然提取或化學合成法生產。⑴微生物發(fā)酵生產工藝五類菌種：野生型菌株、營養(yǎng)缺陷突變株、氨基酸結構類似物抗性突變株、營養(yǎng)缺陷兼結構類似物抗性突變株成本較低，周期較長。能生產占總量60%左右的氨基酸；

對于難以直接發(fā)酵生產的，可通過生物轉化途徑生產。⑵酶法轉化工藝

利用酶的離體專一性反應，催化底物生產有活性的氨基酸。

D-氨基酸和DL-氨基酸的手性拆分工藝簡便、轉化率高、副產物少、容易精制。占總量的10%左右⑶全化學合成生產工藝

不受氨基酸品種的限制，理論上可生產天然氨基酸和非天然氨基酸。

產物是DL-型外消旋體，必須拆分才得單一對映體。不對稱合成工藝可制備得到L-氨基酸占總量20%左右⑷蛋白質水解工藝

以毛發(fā)、血粉等原料蛋白質，通過酸、堿或酶水解形成多種氨基酸的混合物，再經過分離純化制備各種氨基酸。

存在費酸污染環(huán)境嚴重；堿水解易產生消旋作用，工業(yè)上少采用；酶水解往往不徹底，也少用于氨基酸的生產。氨基酸種類生產方法L-谷氨酸，L-蘇氨酸，L-異亮氨酸，L-丙氨酸，L-絲氨酸，L-谷氨酰胺，L-脯氨酸，L-瓜氨酸，L-鳥氨酸，L-天（門）冬酰胺發(fā)酵L-賴氨酸發(fā)酵，酶法L-纈氨酸，L-色氨酸發(fā)酵，化學合成L-亮氨酸，L-精氨酸，L-組氨酸提取，發(fā)酵L-半胱氨酸，L-酪氨酸，L-羥脯氨酸提取L-天門冬氨酸酶法L-甲硫氨酸酶法，化學合成DL-甲硫氨酸，甘氨酸，DL-丙氨酸，L-苯丙氨酸化學合成4.1.5氨基酸工業(yè)現狀生物體內已發(fā)現氨基酸幾百種，藥用氨基酸及其衍生物品種達100多種。谷氨酸鈉占全球氨基酸總量75%左右，其次為賴氨酸，占總產量10%左右。日本的產品在國際上占有重要地位。我國1922年用酸法水解面筋生產味精，1964年分離選育出北京棒狀桿菌和鈍齒棒狀桿菌，采用發(fā)酵法生產谷氨酸，目前至少有16種氨基酸均以投產，谷氨酸鈉2004年年產量150萬噸，賴氨酸12萬噸，甘氨酸3000多噸，其他幾種產量幾百噸。4.2.1谷氨酸及其理化性質英文名稱：glutamicacid;Glu定義：學名：2-氨基-5-羧基戊酸。構成蛋白質的20種常見α氨基酸之一。作為谷氨酰胺、脯氨酸以及精氨酸的前體。L-谷氨酸是蛋白質合成中的編碼氨基酸，哺乳動物非必需氨基酸，在體內可以由葡萄糖轉變而來。D-谷氨酸參與多種細菌細胞壁和某些細菌桿菌肽的組成。符號：E。谷氨酸有左旋體、右旋體和外消旋體。左旋體，即L-谷氨酸，是一種鱗片狀或粉末狀晶體，呈微酸性，無毒。微溶于冷水，易溶于熱水，幾乎不溶于乙醚、丙酮及冷醋酸中，也不溶于乙醇和甲醇。在200℃時升華，247℃~249℃分解密度1.538g/cm3旋光度+37～+38.9(25℃)

谷氨酸是生物機體內氮代謝的基本氨基酸之一，在代謝上具有重要意義。L-谷氨酸是蛋白質的主要構成成分，谷氨酸鹽在自然界普遍存在的。多種食品以及人體內都含有谷氨酸鹽，它即是蛋白質或肽的結構氨基酸之一，又是游離氨基酸，L型氨基酸美味較濃。

L-谷氨酸又名“麩酸”或寫作“夫酸”，發(fā)酵制造L-谷氨酸是以糖質為原料經微生物發(fā)酵，采用“等電點提取”加上“離子交換樹脂”分離的方法而制得。

1908年的一天，日本東京大學教授池田菊苗做完一天的實驗后，回到家中。妻子端上做好的晚飯，早已饑腸轆轆的教授吃得特別香，尤其是湯，盡管湯里只有幾片黃瓜和海帶，卻異常鮮美。黃瓜絕不會這么鮮美，教授心想，這個奧妙一定出自海帶。于是教授決定揭示其中的秘密。

通過對海帶中含有的化學物質提取研究后，池田菊苗終于發(fā)現海帶里含有一種叫“谷氨酸鈉”的物質。它非常鮮美，放進湯里，能使湯的味道更佳。池田菊苗教授給它取了個名字，叫“味精”。池田菊苗1864—1936池田和商人鈴木的合作很快就結出了碩果。不久后，一種叫“味之素”的商品出現在東京淺草的一家店鋪里。日本人的“味之素”很快就傳進了中國。這種奇妙的白色粉末打動了一位名叫吳蘊初的化學工程師的心。經過一年多的研究，他獨立發(fā)明出一種生產谷氨酸鈉的方法：在小麥麩皮（面筋）中，谷氨酸的含量可達40%，他先用34%的鹽酸加壓水解面筋，得到一種黑色的水解物，經過活性炭脫色，真空濃縮，就得到白色結晶的谷氨酸。再把谷氨酸同氫氧化鈉反應，加以濃縮、烘干，就得到了谷氨酸鈉。吳蘊初把他制得的“味之素”叫做味精，他是世界上最早用水解法來生產味精的人。1923年，吳蘊初在上海創(chuàng)立了天廚味精廠，向市場推出了中國的“味之素”——“佛手牌”味精。以后，佛手牌味精不僅暢銷于中國市場，還打進了美國市場。吳蘊初也獲得了一個“味精大王”的稱號。吳蘊初1891-1953天上人間，佛手為鮮家有味之素，白水變雞汁19.9/1kgJD16.8/1kgtaobao醫(yī)學上谷氨酸主要用于治療肝性昏迷，還用于改善兒童智力發(fā)育。食品工業(yè)上，味精是常用的增鮮劑，其主要成分是谷氨酸鈉鹽。過去生產味精主要用小麥面筋（谷蛋白）水解法進行，現改用微生物發(fā)酵法來進行大規(guī)模生產。安全與毒性1975年美國營養(yǎng)和食品工藝學詞典記載，在空腹時食用味精25毫克/公斤體重，25~35分鐘后就發(fā)生頭痛、出汗、惡心、體軟、口渴、面頰潮紅、腹部疼痛等癥狀，但這些癥狀一般在數小時之內就會消失，所以在空腹時不要吃味精。谷氨酸及谷氨酸鈉的分解物質中含有很強的變異原物質（傷害遺傳細胞的毒性），如果將植物油與味精混在一起，加熱約20分鐘，變異原物質會進一步增加。因此在烹調時味精不宜在高溫的炒菜過程中添加，而應在烹調終了時加入作調味用。4.2.2谷氨酸生產菌的特性

L-谷氨酸發(fā)酵微生物的優(yōu)良菌株多在棒狀桿菌屬、小短桿菌屬、節(jié)桿菌屬和短桿菌屬中。具有下述共同特性：①細胞形態(tài)為短桿至棒狀；②無鞭毛，不運動；③不形成芽孢；④革蘭氏陽性；⑤要求生物素（利用石蠟為碳源的要求硫胺素——維生素B1）；⑥在通氣培養(yǎng)條件下產生大量L－谷氨酸。此外，其他細菌、放線菌和真菌中的一些屬種也有產L-谷氨酸的菌株，但產酸率較低。

生物素缺陷型在谷氨酸發(fā)酵中，如果能夠改變細胞膜的通透性，使谷氨酸不斷地排到細胞外面，就會大量生成谷氨酸。研究表明，影響細胞膜通透性的主要因素是細胞膜中的磷脂含量。因此，對谷氨酸產生菌的選育，往往從控制磷脂的合成或使細胞膜受損傷入手，如生物素缺陷型菌種的選育。生物素（維生素H）是不飽和脂肪酸合成過程中所需的乙酰CoA的輔酶。生物素缺陷型菌種因不能合成生物素，從而抑制了不飽和脂肪酸的合成。而不飽和脂肪酸是磷脂的組成成分之一。因此，磷脂的合成量也相應減少，這就會導致細胞膜結構不完整，提高細胞膜對谷氨酸的通透性。脲酶活性強能將尿素（脲）分解為氨和二氧化碳或碳酸銨的酶。發(fā)酵后期補充尿素作為氮源改變代謝途徑谷氨酸的生物合成途徑大致是：葡萄糖經糖酵解(EMP途徑)和己糖磷酸支路(HMP途徑)生成丙酮酸，再氧化成乙酰輔酶A(乙酰CoA)，然后進入三羧酸(TCA)循環(huán)，生成α-酮戊二酸。α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下，生成谷氨酸。選育TCA循環(huán)、HMP途徑突變，耐高濃度谷氨酸并向胞外分泌的菌種。國內外生產工藝比較國外：甘蔗糖蜜或淀粉水解糖為原料強制發(fā)酵，產酸率13%~15%，糖酸轉化率60~65%。國內：淀粉水解糖或甜菜糖蜜為原料，生物素亞適量發(fā)酵，產酸率10%~12%，轉化率60%。Corynebacteriumglutamicum谷氨酸棒狀桿菌非致病菌高產性：>100g/L谷氨酸改造后用于其它氨基酸的生產，如L-賴氨酸GenomicDNA測序2003年完成，3.08Mbp4.2.3谷氨酸發(fā)酵工藝過程生長與生產部分關聯型谷氨酸的生物合成淀粉糖化種子制備發(fā)酵培養(yǎng)分離純化精制成鹽4.2.3.1淀粉糖化工藝酸水解工藝液化：淀粉原料加鹽酸，pH1.5糖化：蒸汽加熱，300kPa左右，25min冷卻：80℃中和：加堿，pH4~5，析出蛋白質和膠體脫色：除去色素和雜質（抑制發(fā)酵）--活性炭吸附和樹脂過濾：得到糖液，制備培養(yǎng)基，進入發(fā)酵階段酶水解工藝糊化：水浴加熱并不斷攪拌，淀粉漿逐漸糊化液化：70~80℃，α-淀粉酶不斷攪拌使其液化，滅酶過濾，濾液冷卻加糖化酶在60~65℃恒溫水浴糖化。所形成的混合型糖汁，主要是麥芽糖，還有葡萄糖，低聚糖、糊精等其他單糖和低聚糖的混合物。4.2.3.2生產種子制備工藝斜面菌種：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、NaCl等。pH7.0~7.2，30~34℃上，18~24h一級種子：葡萄糖、尿素、硫酸銨、玉米漿、磷酸氫二鉀，少量硫酸亞鐵和硫酸錳。恒溫通氣培養(yǎng)12h，OD達0.5，殘?zhí)?.5%以下。目標：繁殖細胞質量控制：無污染，細胞健壯。二級種子：水解糖取代葡萄糖等，pH6.5~7.0。接種量0.8%~1.0%，7~8h，通氣比1:(0.3~0.5)。OD凈增加0.5，殘?zhí)?.0%以下。質量控制：無污染，細胞健壯，密度108~109/ml4.2.3.3發(fā)酵生產工藝接種量：0.5%~1.0%溫度：前期33~35℃，中后期提高為36~38℃供氧：高氧量，高產率。通氣比1:(0.11~0.13)pH：前期，7.5左右；中后期，7~7.5左右，下降時，少量多次流加尿素。在中性和微堿性，積累產物；酸性時形成谷氨酰胺。延遲期：2~4h對數期：pH上升，然后下降，溶解氧急劇下降，然后維持，菌體濃度增大，12h生產期：菌體濃度基本不變，產物大量合成。放罐：呈近中性pH，淺黃色，谷氨酸以鹽形式存在，濕菌體占5~8%，其它氨基酸1%以下，銨離子0.6~0.8%，殘?zhí)?%以下。整個發(fā)酵周期：30h左右4.2.3.4發(fā)酵培養(yǎng)過程控制特點典型的代謝控制發(fā)酵：人為打破正常代謝調節(jié)機制，使代謝按預期方向進行，過量積累產物。生物素（維生素H）的影響：當生物素缺乏時，菌種生長十分緩慢；當生物素過量時，則轉為乳酸發(fā)酵。因此，一般將生物素控制在亞適量條件下（2~5μg/L），才能得到高產量的谷氨酸。氧：谷氨酸產生菌是好氧菌，通風和攪拌不僅會影響菌種對氮源和碳源的利用率，而且會影響發(fā)酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在發(fā)酵后期，加大通氣量有利于谷氨酸的合成。溫度：菌種生長的最適溫度為30~32℃。當菌體生長到穩(wěn)定期，適當提高溫度有利于產酸，因此，在發(fā)酵后期，可將溫度提高到34~37℃。pH：谷氨酸產生菌發(fā)酵的最適pH在7.0～8.0。但在發(fā)酵過程中，隨著營養(yǎng)物質的利用，代謝產物的積累，培養(yǎng)液的pH會不斷變化。如隨著氮源的利用，放出氨，pH會上升；當糖被利用生成有機酸時，pH會下降。氮源要充足，根據pH變化，流加尿素。一般在12h后，菌體密度不增加，pH有所下降，此時及時流加尿素，補充氮源，同時調節(jié)pH，維持在7~7.2左右。磷酸鹽：它是谷氨酸發(fā)酵過程中必需的，但濃度不能過高，否則會轉向纈氨酸發(fā)酵。發(fā)酵結束后，常用離子交換樹脂法等進行提取。4.2.4谷氨酸分離純化工藝過程等電點沉淀法：pH3.22谷氨酸以過飽和狀態(tài)直接從發(fā)酵液中結晶析出。操作過程：鹽酸調pH4.0~4.5，出現晶核，育晶2h。酸調pH3.0~3.2，攪拌20h。降溫至5℃，使結晶沉淀，即等電點結晶。靜置6h，吸去上層菌體和其他氨基酸，下層沉淀得粗谷氨酸（俗稱麩酸）。關鍵在于控制適宜等點沉淀操作溫度，一次沉淀收率達80%以上。純化：活性炭脫色，熱水洗滌，收集谷氨酸。也可采用離子交換樹脂進行脫色。成鹽：谷氨酸溶液中加入碳酸鈉進行中和，形成谷氨酸單鈉。粗品：減壓蒸發(fā)，除水，過飽和結晶析出。純品：除去鐵、脫色和精致結晶。4.3.1賴氨酸及其理化性質英文名稱：lysine;Lys定義：學名：2，6-二氨基己酸。蛋白質中唯一帶有側鏈伯氨基的氨基酸。L-賴氨酸是組成蛋白質的常見20種氨基酸中的一種堿性氨基酸，是哺乳動物的必需氨基酸和生酮氨基酸。在蛋白質中的賴氨酸可以被修飾為多種形式的衍生物。符號：K。賴氨酸，也稱為L-賴氨酸鹽酸鹽，是一種必需氨基酸。賴氨酸是幫助其它營養(yǎng)物質被人體充分吸收和利用的關鍵物質，人體只有補充了足夠的L-賴氨酸才能提高食物蛋白質的吸收和利用，達到均衡營養(yǎng)，促進生長發(fā)育。它是肉堿生產的一個重要組成部分。肉堿負責將一些不飽和脂肪酸轉化為能量，還有助于降低膽固醇水平。它和其他營養(yǎng)一起形成膠原蛋白。膠原蛋白在結締組織，骨骼，肌肉，肌腱和關節(jié)軟骨中扮演了重要角色。此外，賴氨酸也有助于身體吸收鈣。它是控制人體生長的重要物質抑長素(Somatotation,ss)中最重要的也是最必需的成份，對人的中樞神經和周圍神經系統(tǒng)都起著重要作用。已知賴氨酸的功效包括治療單純皰疹病毒和帶狀皰疹引起的唇皰疹。攝入賴氨酸可以大大縮短治愈的時間。研究已經表明，它具有改善免疫系統(tǒng)，抵制單純皰疹和帶狀皰疹病毒的功效，研究還顯示，賴氨酸與某些非甾體抗炎藥結合，能夠成功的治療與經前綜合癥和月經初潮相關的偏頭痛和腹部絞痛。飲食中缺乏賴氨酸的情況是比較罕見的。通常情況下吃素的人發(fā)生率較高，一些運動員如果沒有采取適當的飲食也會出現賴氨酸缺乏的問題。蛋白質攝入量低（如豆類植物，豌豆，小扁豆等）也可能導致賴氨酸攝入量低。缺乏賴氨酸的癥狀包括疲勞，虛弱，惡心，嘔吐，頭暈，沒有食欲，發(fā)育遲緩，貧血等?？梢栽卺t(yī)療專業(yè)人員建議下采取賴氨酸營養(yǎng)補品。4.3.2賴氨酸生產菌的特性產其他氨基酸的微生物，主要是對上述產L－谷氨酸的優(yōu)良菌株進行人工誘變后選育出的各種突變株：①營養(yǎng)缺陷型突變株。利用營養(yǎng)缺陷型突變株發(fā)酵生產氨基酸的關鍵是限制某種反饋抑制物或阻遏物的量，以解除代謝調節(jié)機制而有利于代謝中間體或最終產物的過量積累。因此，不同氨基酸缺陷型生長在含有限量的所要求氨基酸的培養(yǎng)基中，往往能產生和積累大量某種氨基酸。例如,L-賴氨酸的生產菌株多采用高絲氨酸缺陷型突變株。②調節(jié)突變株。采用調節(jié)突變株發(fā)酵生產氨基酸是成功的工藝之一，因為這類突變株一旦對氨基酸結構類似物具備了抗性之后，其正常代謝調節(jié)機制即被解除，因而能夠積累大量的相應的氨基酸；③營養(yǎng)缺陷型與抗反饋調節(jié)多重突變株。采用這類多重突變株對提高某些氨基酸的發(fā)酵產率有明顯的效果。例如，生產L－精氨酸、L－色氨酸、L－苯丙氨酸、L－酪氨酸、L－白氨酸和L－蘇氨酸等就常采用多重突變株。菌種遺傳特性生產能力（g/L）轉化率（%）黃色短桿菌Thr-,Met-3434黃色短桿菌AECR3232黃色短桿菌AECR,Hse-50-5530-35谷氨酸棒桿菌Hse-1313谷氨酸棒桿菌AECR,Hse-,Leu-,Pant-4242乳糖發(fā)酵短桿菌AECR,AHVR2929乳糖發(fā)酵短桿菌AECR,Ala-,CCLR,MLR,EPS4848乳糖發(fā)酵短桿菌AECR,Ala-,MLR,EPS7050注：R抗性；S敏感；-缺陷氨基酸缺陷型：Ala，丙氨酸；Hse，高絲氨酸；Leu，亮氨酸；Met，甲硫氨酸；Thr，蘇氨酸賴氨酸結構類似物：AEC，S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸；CCL，α-氯己內酰胺；ML，γ-甲基賴氨酸蘇氨酸結構類似物：AHV，α-氨基-β-羥基戊酸；EP，β-氟代丙酮酸；Pant，泛酸人工控制微生物代謝的措施包括改變微生物遺傳特性、控制生產過程中的各種條件（即發(fā)酵條件）等。例如，黃色短桿菌能夠利用天冬氨酸合成賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。在黃色短桿菌的代謝過程中，當賴氨酸和蘇氨酸都累計過量時，就會抑制天冬氨酸激酶的活性，使細胞內難以積累賴氨酸；而賴氨酸單獨過量就不會出現這種現象。目前，賴氨酸生產主要采用短桿菌屬和棒桿菌屬的突變菌種，表現為氨基酸營養(yǎng)缺陷、敏感性和抗結構類似物。國內產酸率12%~14%，轉化率42%~46%國外產酸率15%~16%，轉化率50%，提取率達90%~92%4.3.3.1賴氨酸生產種子的制備工藝斜面種子：牛肉膏、蛋白胨、NaCl和葡萄糖，pH7.0~7.2，30~32℃，18~24h一級種子：葡萄糖、玉米漿、豆餅水解液為主，添加硫酸銨、磷酸氫二鉀、尿素和硫酸鎂等，30~32℃，15~16h二級種子：淀粉水解液替代葡萄糖，30~32℃，通氣比1:0.2，8~11h。接種量5%~10%。對于大規(guī)模發(fā)酵，可采用三級種子罐培養(yǎng)4.3.3.2賴氨酸發(fā)酵工藝1、淀粉水解采用雙酶法（液化酶、糖化酶）以減少對生物素、有機氮的破壞。糖蜜雜質多，需要預處理后，才能使用。氮源可以使用玉米漿、豆餅水解液和硫酸銨、尿素等。無機鹽包括磷酸、鉀、鎂、鐵、錳等根據不同菌種的營養(yǎng)缺陷型特性，添加生物素（維生素H）、硫胺素（維生素B1）、丙氨酸等生長因子。二步發(fā)酵法（又稱前體添加法）

50年代初開發(fā)的二步發(fā)酵法以賴氨酸的前體二氨基庚二酸為原料，借助微生物生產的酶（二氨基庚二酸脫羧酶