【】生化實(shí)驗(yàn)思考題參考答案

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生化試驗(yàn)講義思量題參考答案

試驗(yàn)一淀粉的提取和水解

1、試驗(yàn)材料的挑選依據(jù)是什么？

答：生化試驗(yàn)的材料挑選原則是含量高、來源豐盛、制備工藝容易、成本低。從科研工作的角度選材，還應(yīng)該注重詳細(xì)的狀況，如植物的時節(jié)性、地理位置和生長環(huán)境等，動物材料要注重其年齡、性別、養(yǎng)分情況、遺傳素養(yǎng)和生理狀態(tài)等，微生物材料要注重菌種的代數(shù)和培養(yǎng)基成分的差異等。

2、材料的破裂辦法有哪些？

答：(1)機(jī)械的辦法：包括研磨法、組織搗碎法；

(2)物理法：包括凍融法、超聲波處理法、壓榨法、冷然交替法等；

(3)化學(xué)與生物化學(xué)辦法：包括溶脹法、酶解法、有機(jī)溶劑處理法等。

試驗(yàn)二總糖與復(fù)原糖的測定

1、堿性銅試劑法測定復(fù)原糖是直接滴定還是間接滴定？兩種滴定辦法各有何優(yōu)缺點(diǎn)？

答:我們采納的是堿性銅試劑法中的間接法測定復(fù)原糖的含量。間接法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、反應(yīng)條件溫柔，缺點(diǎn)是在生成單質(zhì)碘和轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)物的過程中簡單引入誤差；直接法的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)原理直觀易懂，缺點(diǎn)是操作較復(fù)雜，條件強(qiáng)烈，不易控制。

試驗(yàn)五粗脂肪的定量測定─索氏提取法

（1）本試驗(yàn)制備得到的是粗脂肪，若要制備單一組分的脂類成分，可用什么辦法進(jìn)一步處理？

答：硅膠柱層析，高效液相色譜，氣相色譜等。

（2）本試驗(yàn)樣品制備時烘干為什么要避開過熱?

答：防止脂質(zhì)被氧化。

試驗(yàn)六蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定

1、在分別蛋白質(zhì)的時候，等電點(diǎn)有何實(shí)際應(yīng)用價值？

答:在等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增強(qiáng)，所以處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)最簡單沉淀。在分別蛋白質(zhì)的時候，可以按照待分別的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，有目的地調(diào)整溶液的pH使該蛋白質(zhì)沉淀下來，從而與其他處于溶液狀態(tài)的雜質(zhì)蛋白質(zhì)分別。

試驗(yàn)七氨基酸的分別鑒定－紙層析法

1、如何用紙層析對氨基酸舉行定性和定量的測定？

答:將標(biāo)準(zhǔn)的已知氨基酸與待測的未知氨基酸在同一張層析紙上舉行紙層析，顯色后按照斑點(diǎn)的Rf值，就可以對氨基酸舉行初步的定性，由于同一個物質(zhì)在同一條件下有相同的Rf值；將點(diǎn)樣的未知氨基酸溶液和標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液的體積恒定，按照顯色后的氨基酸斑點(diǎn)的面積與點(diǎn)樣的氨基酸質(zhì)量成正比的原理，通過計(jì)算斑點(diǎn)的面積可以對氨基酸溶液舉行定量測定。

3、紙層析、柱層析、薄層層析、高效液相層析各有什么特點(diǎn)？

答:

(1)簡述紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度的原理及優(yōu)點(diǎn)。

答：原理：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有汲取紫外線的性質(zhì)，汲取高峰在280nm波特長。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光汲取值（OD280）與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。

試驗(yàn)十影響酶活性的因素

（1）本試驗(yàn)中如何通過淀粉液加碘后的色彩的變化來推斷酶促反應(yīng)快慢的？

答：在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解，經(jīng)過一系列被稱為糊精的中間產(chǎn)物，最后生成麥芽糖和葡萄糖。變化過程如下：淀粉→紫色糊精→紅色糊精→麥牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、紅色糊精遇碘后分離呈藍(lán)色、紫色與紅色。麥芽糖和葡萄糖遇碘不變色。因此反應(yīng)后色彩如為藍(lán)色說明酶活力低，淡黃色則說明酶活力高。

（2）如何通過加入班氏試劑后生成沉淀多少來反映酶促反應(yīng)快慢的？

答：淀粉與糊精無復(fù)原性，或復(fù)原性很弱，對本尼迪克特試劑呈陰性反應(yīng)。麥芽糖、葡萄糖

是復(fù)原糖，與本尼迪克特試劑共熱后生成紅棕色氧化亞銅的沉淀。因此，產(chǎn)生紅棕色氧化亞銅的沉淀越多說明酶活力越高。

（3）通過本試驗(yàn)，結(jié)合理論課的學(xué)習(xí)，小結(jié)出哪些因素影響唾液淀粉酶活性？是如何影響的？

答：溫度、pH、激活劑、抑制劑等。高于或低于最適溫度或pH，酶活力都會降低；激活劑和抑制劑不是肯定的，只是相對而言，隨著濃度的變化而變化。

試驗(yàn)十二堿性磷酸酶的分別提取及比活力的測定

(1)試說明用硫酸銨分級分別酶的辦法及應(yīng)注重的大事。

答：用鹽分級沉淀是一種應(yīng)用十分廣泛的辦法。因?yàn)榱蛩徜@在水中溶解度很大（，每升可溶），并且對許多酶沒有很大的影響，因此它是最常用的鹽。例如：某酶（或蛋白質(zhì)）發(fā)生鹽析的范圍為35-65%飽和硫酸銨的濃度，因此可先挑選30%飽和硫酸銨濃度，去沉淀雜蛋白，然后挑選70%飽和硫濃度酸銨，留沉淀（含所要的酶）。

注重事項(xiàng)：在用硫酸銨沉淀酶蛋白時，要注重緩沖液的pH值和溫度，鹽的溶解度隨溫度不同而有較大的變化，同時酶的溶解度亦隨溫度的轉(zhuǎn)變而轉(zhuǎn)變。在加硫酸銨時，需事先將硫酸銨粉末研細(xì)。加入過程需緩慢并準(zhǔn)時攪拌溶解。攪拌要緩慢，盡量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面變性。

(2)用正丁醇處理勻漿液可以有效地使堿性磷酸酶酶蛋白釋放，使酶的產(chǎn)量大大提高，這是

為什么？

答：由于堿性磷酸酶酶是一種膜蛋白，正丁醇處理后可使結(jié)合在膜上的蛋白質(zhì)更多地釋放出來。

(3)酶活力測定時，為什么必須先將酶液對緩沖液透析后才測定？

答：去除鹽離子的影響。

試驗(yàn)十三凝膠過濾層析純化堿性磷酸酶

1.在本試驗(yàn)中要注重哪些重要環(huán)節(jié)？

答：

1）注重區(qū)別柱子的上下端。

2）各接頭不能漏氣，銜接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。

3）裝柱要勻稱，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避開因此凝膠。

4）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分蒸發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝

膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流淌。

5）核酸蛋白檢測儀，記錄儀，部分收集器要正確銜接。

6）要控制一定流速。

7）收集得到的液體要舉行酶活力的檢測。

試驗(yàn)十四底物濃度對酶活力的影響（米氏常數(shù)的測定）

1.在測定酶催化反應(yīng)的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vm時，應(yīng)如何挑選底物濃度范圍？答：底物濃度挑選范圍[S]0.2-5.0Km為宜。底物濃度選取還應(yīng)當(dāng)注重其倒數(shù)能勻稱分布。

1/v1/v

01/[S]01/[S]

底物濃度太大底物濃度太小

2.試說明米氏常數(shù)Km的物理意義和生物學(xué)意義。

答：(1)Km是酶的一個極重要的動力學(xué)特征常數(shù)，Km物理含義：ES絡(luò)合物消逝速度常數(shù)與形成速度常數(shù)之比；其數(shù)值相當(dāng)于酶活性部位的一半被底物占領(lǐng)時所需的底物濃度。

(2)可按照Km估量底物濃度的水平。

(3)Km可作為同工酶的推斷依據(jù)。

(4)鑒別最適底物。

(5)有助于在酶學(xué)討論中對底物濃度的挑選。選用[S]>10Km濃度舉行活力測定

3.為什么說米氏常數(shù)Km是酶的一個特征常數(shù)而Vm則不是？

答：某種酶的Km在給定的體系中不隨酶濃度轉(zhuǎn)變而轉(zhuǎn)變，也與酶的純度無關(guān)，因此是酶的一個特征常數(shù)。但Vm隨酶濃度轉(zhuǎn)變而轉(zhuǎn)變。

試驗(yàn)十七SDS電泳

(1)簡述SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量的原理;

答：1）SDS能使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)–SDS復(fù)合物。

2）SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，消退或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使SDS與蛋白質(zhì)的復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷。

3）SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在水溶液中的外形一樣，都是近似于雪茄煙形的長橢圓棒。

4）不同的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，并具有相同外形；因此在一定濃度的凝膠中，因?yàn)榉肿雍Y效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。

(2)是否全部的蛋白質(zhì)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳辦法測定得到的分子量都徹低牢靠？

答：不是。

如電荷異樣或構(gòu)象異樣的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。

例如組蛋白F1，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能徹低掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測定的結(jié)果卻是35,000。

試驗(yàn)十八維生素C的定量測定

（1）簡述本法測定VC的利與弊。

答：碘量法測定VC相比其它辦法傳統(tǒng)的碘滴定法快速、簡捷，但易受到待測物色彩干擾而不易推斷滴定盡頭；只能測定待測溶液還原型的Vc含量，假如溶液中還含有其他還原型較強(qiáng)的物質(zhì)會影響測定結(jié)果；而且待測的還原型Vc易被空氣氧化影響滴定結(jié)果。

（2）為何以顯藍(lán)色在