2015年生物分子類實(shí)驗(yàn)室常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理匯總

生物分子類實(shí)驗(yàn)室常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理匯總

一、GSTpull-down實(shí)驗(yàn)2

二、足印法(Footprinting)2

三、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)2

四、基因芯片(又稱DNA芯片、生物芯片)技術(shù)2

五、高效液相色譜(HPLC)3

六、酵母雙雜交(Y2H)5

七、噬菌體展示技術(shù)8

八、RNA提取(Trizol法)9

九、RT-PCRII

十、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q—PCR)(Real-timeQuantitativePCR)11

H-一、BCA法測蛋白質(zhì)濃度13

十二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(E.coliDH5a)制備13

十三、堿變性提取質(zhì)粒DNA14

十四、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及克隆篩選14

十五、RNA干擾(RNAi)16

十六、cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技術(shù)17

十七、基因文庫和cDNA文庫的構(gòu)建(看課本上的)19

十八、mRNA差異顯示技術(shù)(DD-PCR)19

十九、抑制差減雜交20

二十、蛋白質(zhì)芯片21

二H—、Northernblot21

二十二、Southernblot22

二十四、雙分子熒光技術(shù)26

二十五、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)27

二十六、雙向凝膠電泳(2-DE)33

二十七、mRNA的分離與純化(寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA)33

二十八、His-tag純化蛋白33

三十、免疫組化34

三十一、各種分子標(biāo)記技術(shù)的比較34

一■、GSTpull-down實(shí)驗(yàn)

基本原理:將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親

和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲

蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過SDS電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用

或篩選相應(yīng)的目的蛋白，''誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、

表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡單易行，操作方便。注：GST即谷胱

甘肽筑基轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase)

二、足印法(Footprinting)

足印法(Footprinting)是一種用來測定DNA-蛋白質(zhì)專一性結(jié)合的方法，用于檢測目

的DNA序列與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可展示蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合。其原理

為：DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合后，DNA與蛋白的結(jié)合區(qū)域不能被DNase(脫氧核糖核酸酶)分解，

在對目的DNA序列進(jìn)行檢測時(shí)便出現(xiàn)了一段無DNA序列的空白區(qū)(即蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū))，從而了

解與蛋白質(zhì)結(jié)合部位的核甘酸數(shù)目及其核甘酸序列。

三、染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)(ChromatinImmunoprecipitation,ChIP)是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)

與DNA相互作用的有力工具，利用該技術(shù)不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還

可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾以及轉(zhuǎn)錄因子與基因表達(dá)的關(guān)系。

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是：在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通

過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白

相結(jié)合的DNA片段沉淀下來。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)

免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化及鑒定。

四、基因芯片(又稱DNA芯片、生物芯片)技術(shù)

基因芯片指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測

每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。通俗地說，就是通過微

加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)、乃至百萬計(jì)的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列

固定于2cnT'的硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，被稱為基因芯片。

基因芯片主要用于基因檢測工作。

基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核

酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核甘酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒

光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG,與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補(bǔ)匹配時(shí)，通

過確定熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的探針位置，獲得一組序列完全互補(bǔ)的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸

的序列。

一組八核甘酸探針。由雜交位置確定的一組

ATACGTTA.-'

核酸探針序列，

TACGTTAG-

雜交探針組」

重組的互補(bǔ)序列p

TATGCAATCTAG-靶序列，

基因芯片的測序原理

五、高效液相色譜（HPLC）

高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相

改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典

液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬）；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物

進(jìn)行連續(xù)檢測。

高壓泵將貯液罐的流動(dòng)相經(jīng)進(jìn)樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，這時(shí)整個(gè)

系統(tǒng)就被流動(dòng)相充滿。當(dāng)欲分離樣品從進(jìn)樣器進(jìn)入時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器的流動(dòng)相將其帶入色譜柱

中進(jìn)行分離，分離后不同組分依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將進(jìn)入檢測器的信號(hào)記錄下來,

得到液相色譜圖。

吸附色譜分配色譜離子色譜體積排阻色譜親和色譜

固定全多孔固體固定液載常在固高效微粒離子具有不同孔徑的多孔多種不同性能的配位體鍵聯(lián)

相斕捌相基體上交換劑性凝膠在固相基體上

流動(dòng)不同極性有不同極性有機(jī)溶不同PH值的有機(jī)溶劑或一定PH值不同PH值的緩沖溶液，可加

相機(jī)溶劑劑和水緩沖溶液的緩沖溶液入改性劑

分離可逆性的禽子多孔凝膠的滲透或過具有鎖匙結(jié)構(gòu)絡(luò)合物的可逆

吸附與解吸溶解與揮發(fā)

原理交換漉性離解

六、酵母雙雜交（Y2H）

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)

識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。

80年代的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的，即這

些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中有DNA結(jié)

合結(jié)構(gòu)域（DNAbindingdomain＞簡稱為BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域

（activationdomain＞簡稱為AD）,BD可識(shí)別DNA_b的特異序

歹（J,并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游；AD可同轉(zhuǎn)錄

復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)的BD雖然

能和啟動(dòng)子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。

不同轉(zhuǎn)錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激

活轉(zhuǎn)錄的功能（如帝母細(xì)胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域

B42融合得到的雜合蛋且仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄）

如果誘餌蛋白和靶蛋白能夠相互作用，那么GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)

域和GAL4激活結(jié)構(gòu)域就會(huì)相互作用，從而激活lacZ報(bào)道基因的表達(dá)。

所以我們可以通過轉(zhuǎn)化的酵母的表型來確定誘餌蛋白和靶蛋白是否有相

互作用。

CALICAS|子irZ(orHlSJ)>S?*W

TGALIIASI目成于Itoez<auiaj4凰革因|—

圖5-31酵母雙雜交體系原理示意圖.（a）GAL4的D'A-BD和蛋白質(zhì)X結(jié)合形成的雜

種蛋白，同GAL1的UAS序列結(jié)合，但由于沒有同AD結(jié)合，故不能啟動(dòng)報(bào)道基因轉(zhuǎn)

錄；（b）GAL的AD同蛋白質(zhì)Y結(jié)合形成的雜種蛋白，沒有同【AS序列結(jié)合，故不能

啟動(dòng)報(bào)道基因轉(zhuǎn)錄；（C）通過這兩個(gè)雜種蛋白中的X蛋白和Y蛋白之間的相互作用，

在細(xì)胞內(nèi)重建了GAL4的功能，結(jié)果啟動(dòng)報(bào)道基因進(jìn)行表達(dá).%]P卜'&PC卜

X蛋白與Y蚤白有相互作用X蛋白與Y蛋白無相互作用

酵母雙雜交系統(tǒng)通過兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對報(bào)

告基因的轉(zhuǎn)錄激活來捕獲新的蛋白質(zhì)，其大致步驟為：

1、視已知蛋白的cDNA序列為誘餌(bait),將其與DNA結(jié)合域融合，

構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。

2、將待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒。

3、將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中。

4、酵母細(xì)胞中，已分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會(huì)相互作用，

但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報(bào)告基

因的轉(zhuǎn)錄；反之，則不能。利用報(bào)告基因的表達(dá)，便可捕捉到新的蛋白質(zhì):

酵母單雜交系統(tǒng)的原理

用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子。研

究表明GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近叛基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵

母半乳糖苜酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)；而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或

轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA鬃合酶的活性。在這一過程中，DNA

結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄檄活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。

據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域曾換為其他蛋白，只要他能與

我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活

RNA聚合酶，從而啟動(dòng)對下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。

酵母三雜交的原理

酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細(xì)胞的GAL4

蛋白調(diào)節(jié)目的基因(半乳糖苦酶基因及His3基因)轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)。GAL4蛋白

具有兩個(gè)可分離的功能區(qū)，N端是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)

域。只要這兩個(gè)相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠

近(如借助其他分子的相互結(jié)合使其足夠靠近)，即使它們之間沒有共價(jià)結(jié)

合也可激活轉(zhuǎn)錄，這為研究蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用提供了可能。

圖1解母三雜交系統(tǒng)的原理

七、噬菌體展示技術(shù)

噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適

當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示

到噬菌體表面的生物技術(shù)。

噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白

結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽

或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展

示的多肽或蛋白可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。肽

庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體

或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下

一輪洗脫，經(jīng)過3輪?5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度

富集。所得的噬菌體制劑可用來做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。

噬菌體展示技術(shù)

原理

噬菌體展示技術(shù)是將外源DNA通過基因工程技術(shù)克隆到適當(dāng)?shù)?/p>

噬菌體載體上，使外源DNA片段對應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的衣

殼蛋白上形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可

保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。然后利用靶分子，采用適當(dāng)?shù)奶韵?/p>

方法洗去非特異結(jié)合的噬菌體，最終從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合靶

分子的目的噬菌體；外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面,而其編

碼基因作為噬菌體基因組中的一部分可通過噬菌體DNA序列測序出

來。

該技術(shù)的顯著特點(diǎn)是建立了基因型和表現(xiàn)型之間的對應(yīng)關(guān)系.

八、RNA提?。═rizol法）

Trizol試劑中的主要成分為異硫氟酸呱和苯酚，其中異硫氟酸胭可裂解細(xì)胞，促使核

蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸

性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍

留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA,有機(jī)層（黃色）主要為

DNA和蛋白質(zhì)。

TRIzol法抽提總RNA

組織10Omg

X

加ImITRIzol

I

勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管）

（組織勻漿量＞100mg時(shí)分裝1ml/每EP管）

I

顛倒混勻10下，室溫5分鐘（30%：孵育）

I

加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）

I

顛倒混勻15S,室溫2-5分鐘（3（TC孵育）

I

4℃,離心12000g,15分鐘

轉(zhuǎn)上層水相（約400A1）于另一1.5mlEP管中

加等體積異丙醇（約400-500uI）,混勻室溫10分鐘

4℃,離心12000g,10分鐘（30%：孵育）

i

棄上清

i

加冰預(yù)冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml

4℃離心7500g,5分鐘

i

棄上清，空氣干燥570分鐘（不能完全干燥）

I

溶于DEPC水中至20u?（10uI-20uI）

（可在55-60℃水中，＜10分鐘助溶）

實(shí)驗(yàn)流程圖

pH5.7

九、RT-PCR

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首

先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄醐的作用從RNA合成cDNA,再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可

以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、RNA的提??；

2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

3、PCR擴(kuò)增；

4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。

十、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q—PCR)(Real-timeQuantitativePCR)

利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每?個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct

值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析。

閾值：是循環(huán)開始3?15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，設(shè)定在擴(kuò)增曲線指數(shù)

增長期。

C(t)值：熒光信號(hào)(擴(kuò)增產(chǎn)物)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。

Q-PCR分四個(gè)階段

平臺(tái)期

線性增長期

指數(shù)增長期

基線期

如何定量?

g值

?Ct值的概念

-Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)

開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對

應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

H^一、BCA法測蛋白質(zhì)濃度

K二實(shí)驗(yàn)原理

EGA(bicinchoninicacid,二辛可酸)法

舸定蛋白質(zhì)即在堿性條件下蛋白質(zhì)與

匕12+絡(luò)合，并將其還原成Cul+。Cul+和

BCA試劑反應(yīng)，使其由原來的蘋果綠形成

穩(wěn)定的復(fù)合物，在562nm有強(qiáng)

烈的光吸收，且吸光值和蛋白質(zhì)濃度在

廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此可

用于蛋白質(zhì)濃度測定。

方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說明

靈敏度低，適于費(fèi)時(shí)M蛋白凝(可用用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含

凱氏定氮法

0.2-l.0mg氮，870小凝，用酸吸收后滴三氯乙酸沉淀量的準(zhǔn)確測定：干

(Kjedahl法)

誤差為±2%時(shí)定蛋白質(zhì)而分離)擾少：費(fèi)時(shí)太長。

中速硫酸筱：測定快速.但不太

雙縮服法只敏度低多肽健+緘性Cu2+

20-30分Tris緩沖液：靈敏：不同蛋白旗

(Biuret法)1~20mgT紫色絡(luò)合物

鐘某些女基酸顯色相似。

快速蛋白旗中的酪氨酸各種嚓吟和喀用于層析柱流出液

較為靈敏

紫外吸收法5-10分和色額酸殘基在喻的檢測：核酸的吸

50-1OOpg

鐘280nm處的光吸收各種核甘酸收可以校正.

硫酸筱：耗費(fèi)時(shí)間長：操作

慢速雙縮肥反應(yīng)：磷粗

Folin?的試劑法靈敏度高Tris懾沖液：要嚴(yán)格計(jì)時(shí)：

4a60酸?磷鈣酸試劑被

(Lowry法)?5四甘氨酸:顏色深淺隨不同蛋

分鐘Tyr和Phc還原

各種硫醇白班變化.

考馬斯充道染料與最好的方法：干擾

快速強(qiáng)堿性緩沖液：

考馬斯亮藍(lán)法靈敏度最高蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定：

5~15分TritonX-100;

(Bradford法)5Hg/.max由465nm變?yōu)轭伾顪\隨不同蛋

鐘SDS

595nm白灰變化。.

十二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(E.coliDH5a)制備

1、前夜接種受體菌(DH5或DH10B),挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜

(約16小時(shí))；

2、取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3

小時(shí)(250-300rpm)；

3、將0.IMCaClz溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作；

4、吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘;

5、4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

6、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0.lMCaC12溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)

胞重新懸浮，在冰放置20分鐘：

7、4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

8、棄去上清，加入100微升預(yù)冷0.IMCaC12溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使

細(xì)胞重新懸浮；

9、細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑（15%-20%甘油）后超低溫冷

凍貯存?zhèn)溆茫?70℃）。

十三、堿變性提取質(zhì)粒DNA

堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目

的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒

DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8

的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液

中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分

子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

十四、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化及克隆篩選

（1）總過程：

分一-PCR分離目的基因

切一限制性內(nèi)切酶切割

接-一目的基因與載體相連

轉(zhuǎn)--轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞

篩--篩選陽性重組體

（2）分一-PCR分離目的基因：PCR克隆、同源克隆、文庫篩選

（3）切--限制性內(nèi)切酶切割：粘性末端、平末端

（4）接一-目的基因與載體相連

原理：利用DNA聚合酶反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個(gè)或者幾個(gè)A堿基的

特性和利用T載體3'末端的T堿基和PCR產(chǎn)物的A堿基互補(bǔ)配對，經(jīng)連接酶作用,完成與載

體的連接。

2.與T載體直接連接

（1）PCR產(chǎn)物兩個(gè)3,端一般都有一個(gè)A

TaqDNA聚合酶的特性：在DNA雙

鏈的3,端再加上一個(gè)多余的核甘酸

（優(yōu)先加A）o

（2）T載體的兩個(gè)3,端人為地各加一個(gè)T

利用TaqDNA聚合酶，當(dāng)原料中只

有dTTP時(shí)，被迫在平端載體上添加

T!

（5）轉(zhuǎn)--轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞

感受態(tài)細(xì)胞：經(jīng)過電擊、CaC12、RuCl等化學(xué)試劑處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化,

成為能容許外源DNA分子通過時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)流程勿工

（動(dòng)J

感受態(tài)細(xì)菌連接產(chǎn)物混勻.429水浴-

?**

lOOul10ul冰浴中30s90s

涂板加入500plLB培養(yǎng)液

4*冰浴1-2min

培養(yǎng)過夜37。（3振蕩培養(yǎng)60min

（6）篩--篩選陽性重組體

篩一一篩選陽性重組體

藍(lán)白斑試驗(yàn)（IPTG-Xgal試驗(yàn)）——

原理：

pMD?18-TVector含有編碼B-半乳糖昔禽基因（LacZ

基因）的調(diào)控序列和N端146個(gè)氨基酸的編碼序列，在編

碼序列中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，但不破壞閱讀框架，

不影響功能.當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入的宿主細(xì)胞是含有B-半

乳糖昔酹津編碼序列時(shí)，此薰的蝴序列和事序列可

以互補(bǔ)（稱為Q互補(bǔ)），產(chǎn)生具有篝活性的蛋白質(zhì)（B

一半乳糖昔酶），從而使宿主細(xì)菌在含有IFIG（強(qiáng)謂導(dǎo)

劑）?X-gal（生色底物）的培養(yǎng)基上呈藍(lán)色.然而外源

DNA片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，破壞原有的閱讀

框，因此同樣情況下，帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落.

十五、RNA干擾（RNAi）

一些小的雙鏈RNA（siRNA）可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內(nèi)

特定基因表達(dá)，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱為RNA干擾（RNAi）。

dsRNA

Dicer

在起始步腮加入的dsRNA被Dicer能切割為

21-23核甘酸長的小分子干擾RNAJ；段

siRNA

2protein

pon*nts

在RNAi效應(yīng)階段,siRNA妝鉞”，合個(gè)核

陸或合物從而出成所謂RNA濟(jì)導(dǎo)沉默U介物

RNA-lnducedsilencingcomplex,or^5"RISC

RNAiRISC）

機(jī)制siRNAunwinding

激活RISC樂要?個(gè)ATP依敕的/siRNA解雙Activated

模式圖鍵的過程RISC

Associationwfth

targetmRNA

激活的RISC混過【威基配對定位到同源mRNA

轉(zhuǎn)錄本上

并在距離siRNA3'端12個(gè)堿邛的位置切割

.TargetmRNA

mRNAdeavoge

***">?^?Sense^***???TargetmRNA

Antisense

RNA干擾研究的一般流程

確定目的基因

根據(jù)相對應(yīng)的核酸序列設(shè)計(jì)出siRNA的序列

獲得siRNA

用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

分析RNA干擾的效果

十六、cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNA

ends,RACE)技術(shù)

cDNA末端快速擴(kuò)增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技術(shù)是一種基于mRNA

反轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)建立起來的、以部分的已知區(qū)域序列為起點(diǎn)，擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄木的未知區(qū)域,

從而獲得mRNA(cDNA)完整序列的方法。簡單的說就是一種從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速增長

CDNA5'和CDNA3'末端，進(jìn)而獲得獲得全長cDNA簡單而有效的方法，該方法具有快捷、方

便、高效等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)獲得多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。因此近年來RACE技術(shù)已逐漸取代了經(jīng)典的cDNA

文庫篩選技術(shù),成為克隆全長cDNA序列的常用手段。

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PCRWVtTrCOMA

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AMm()?fy(MtmarFPCRproduct

MMrtgAlMP.orUAP.Mtd

AMMQSP

rtMtod

圖25'RACE的原理圖

3,RACE-PCR

AAAAAAAA”

L]_RTwrtbAnchor

primer

AAAAAAA

Denature.annMil

intefnol&petmer

圖13,RACE的原理圖

十七、基因文庫和cDNA文庫的構(gòu)建（看課本上的）

十八、mRNA差異顯示技術(shù)（DD-PCR）

mRNA差異顯示技術(shù)是將mRNA逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。

每一種細(xì)胞（包括同一組織細(xì)胞經(jīng)過不同的處理）都有其特異表達(dá)的不同于其他組織細(xì)胞的

基因譜（有差異基因表達(dá)），即特異的RNA指紋圖譜。差異基因表達(dá)是細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，正

是這些基因在細(xì)胞中的特異表達(dá)與否，決定了生命歷程中細(xì)胞的發(fā)育和分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、

細(xì)胞衰老和凋亡等。mRNADDRT-PCR技術(shù)正是對組織特異性表達(dá)基因進(jìn)行分離的一種快速

而行之有效的方法。其基本原理是從基因背景相同的2個(gè)或幾個(gè)被比較的細(xì)胞系或組織中

提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用不同引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)加入同位素標(biāo)記的核

甘酸。利用測序膠電泳技術(shù)分離PCR產(chǎn)物，經(jīng)放射自顯影即可找到差異表達(dá)的基因。

實(shí)驗(yàn)組總RNA提取對照組總RNA提取

II

「2M錨定引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA「2M錨定引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

II

隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析

I

差異性條帶地回收，二次PCR擴(kuò)增后克隆入載體

I

序列測定，Genbank查詢

I

NorthernBlot和DotBlot雜交確定差異性條帶的真實(shí)性

I

以差異表達(dá)條帶為探針從cDNA文庫中克隆到全氏cDNA

I

基因功能鑒定

基因敲除真核細(xì)胞抗體制備酵母雙雜交

表達(dá)、轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)定位探討作用途徑

十九、抑制差減雜交

抑制差減雜交技術(shù)原理抑制差減雜交技術(shù)(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR

和DNA差減雜交方法相結(jié)合的方法。其依據(jù)的主要技術(shù)有兩點(diǎn)：(1)消減雜交；(2)抑制PCR。

經(jīng)抑制差減雜交后的cDNA群體不僅富集了差異表達(dá)基因(目的基因)，而且目的基因間豐度

的差異經(jīng)過均等化作用已基本消除，使消減后的cDNA群體為豐度一致的目的基因群體。

抽提兩種不同來源組織的mRNA(tester和driver),反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用4堿基識(shí)別酶

(Rsal)或HaelII酶切兩種cDNA產(chǎn)生平端片段;將testercDNA分成均等的兩份,分別接上

dapterl和adapter2兩種接頭，并與過量的經(jīng)Rsal消化的driver樣本變性后退火雜交。第

一次雜交后有4種產(chǎn)物:a是單鏈testercDNA;b是自身退火的testercDNA雙鏈;c是tester

和driver的異源雙鏈；d是drivercDNA。

根據(jù)復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理，豐度高的單鏈cDNA退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交速度快于豐度低的單鏈

cDNA,因此第一次雜交使得豐度有差別的cDNA的單鏈分子的相對含量趨向一致?；旌蟽煞蓦s

交樣品，同時(shí)加入新的變性drivercDNA進(jìn)行第二次消減雜交。雜交完全后補(bǔ)平末端，加入

合適引物(即adapterl和adapter2的部分特異序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,只有含不同接頭的雙鏈

DNA分子(e)才可進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物即為目的片段。利用adapter上的酶切位點(diǎn)可進(jìn)行

克隆、測序等。

由RNA合成cDNA

RsaI的切

cDNA接

第_次請減條交

第二5^0^

第一次PCR擴(kuò)增

第nepCR擴(kuò)增

宣集差異表達(dá)基因

二十、蛋白質(zhì)芯片

蛋白質(zhì)芯片，又稱蛋白質(zhì)陣列

或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)

分子作為配基，將其有序地固定

在固相載體的表面形成微陣列：

用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它

分子與之作用，洗去未結(jié)合的成

分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定

芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來分析

蛋白之間或蛋白與其它分子之間

的相互作用關(guān)系。

二H—、Northernblot

Northernblot印跡雜交原理示意圖

二十二、Southernblot

二十三、熒光共振能量轉(zhuǎn)移

1、SYBRGreen法

SYBR

Green

□SYBRGreen只有和雙錢DNA結(jié)合后才發(fā)貨光

口變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無貨光

-□在延伸結(jié)束階段采集美光信號(hào)。

口SYBRGreen也能和非特異的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以

必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做壕解曲錢.分析。

SYBRGreenI染料法——作用機(jī)理

熱變性引物FF受光物質(zhì)

III⑥卷⑥

IIIIIIIIIIIIIIII

引物退火DNA聚合舞^

TTT

??―后,IIIO'.-??

,：IIIIIIIIlli

延伸反應(yīng)一

T；：：

F：F：*F*F：F：[yTTII

Taqman探針法工作機(jī)理

探針

熱變性年1r報(bào)告疑居毅甄

IIIIIIIIIIIIIII

引物和探針與模板退火

延伸反應(yīng)

TaqMan5探針

圖4TaqMan探針的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制

2、TaqMan探針法

TaqMan一水解型雜交探針

RReporter

Probe9,Quencher

與目標(biāo)序列互補(bǔ)

?5'181(Reporter.R),如FAM、VIC等

?：?3'舄林記有關(guān)光評文基團(tuán)(Quencher,Q)

?:?林針克矍，R所發(fā)M的美光能受世Q泉團(tuán)雙收，無美無，R與Q分開，發(fā)貨光

?Taq薛木5'-*3/外切版酸硅活柱，可夫斛探什

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類——分子信標(biāo)

寶標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針

H環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ)

E莖由互補(bǔ)配對序列組成

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的分類二一分子信標(biāo)

MolecularBeaconPrinciple

FRET

二十四、雙分子熒光技術(shù)

四、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(bimolecular

fluorescencecomplementation,BIFC；

BiFC技術(shù)是將熒光蛋白(GFP、YFP、DFP)

分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段，再“別

與目標(biāo)蛋白連接。如果1、II機(jī)主白因?yàn)橛衘］互

作用而接近，就使得熒光蛋)I

空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基因和發(fā)

出熒光。在‘、下，就能直接觀察到第n

標(biāo)蛋白是否具有相互作用，對研究蛋白質(zhì)相

用有重要意義。

7雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)BiFC

雙分子熒光互補(bǔ)(bimolecularfluorescence

complementation,BiFC)分析技術(shù),利用綠色熒光

蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)及其突變

體(YFP,CFP,BFP)的特性作為報(bào)告基因，將熒光蛋白

分割成兩個(gè)不具有熒光活性的分子片段，再分別與目

標(biāo)蛋白連接.如果兩個(gè)目標(biāo)蛋白因?yàn)橛邢嗷プ饔枚?/p>

近，就使得熒光蛋白的兩個(gè)分子片段在空間上相互靠

近，重新形成活性的熒光基團(tuán)而發(fā)出熒光.在熒光顯

微鏡下，就能直接觀察到兩目標(biāo)蛋白是否具有相互作

用，并旦在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其

相互作用發(fā)生的時(shí)間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白質(zhì)復(fù)

合體的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號(hào)分子對其相互作用的影

響等，這些信息對研究蛋白質(zhì)相互作用有一定意義。

PrincipleoftheBiFCassay

AbsorptionEmission

C-terminal

YFPfragment

AfterBiFC

二十五、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

ELISA是一種免疫測定(immunoassay,IA)。基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗

體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物

質(zhì)的量直接相關(guān)，山此進(jìn)行定性或定量分析。

用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要福義建

幾種類型：WW

一雙抗體夾心法測盤原’(常婿

?夾心法

雙抗原夾心法測抗體

?間接法測抗體(常用)

競爭法測抗原

?競爭法工［

競爭法測抗體

?捕獲包被法測抗體

?親和素?生物素ELISA法

雙包被特異性抗體

抗

洗

條

、

/、

體

夾加入待測樣品

二

育

?O洗滌

HD

子

心7T

法

測加酶標(biāo)特異性抗體

如盲

洗

:條

抗/

原

底物顯色

a改體《心仇副士仇兒

間接法測抗體

☆間接法是檢測抗體最常用的方法。

☆原理：利用酶標(biāo)記的抗體檢測已與固相結(jié)合的

受檢抗體，故稱為間接法。

檢抗體覆標(biāo)記的抗體

+

?會(huì)同相抗原為廠

）加底物

7顯色

間接法測定抗體示意圖

血

清

1.包被抗原稀

釋

度

2.洗滌

2

3.加待檢抗體4

8

4.洗滌

168

32

5.