三妙丸中牛膝引藥作用的機理研究

三妙丸中牛膝引藥作用的機理研究【摘要】目的通過藥代動力學組織分布研究法，研究牛膝在正常大鼠體內(nèi)對三妙丸中主要有效成分小檗堿組織分布的影響，以探討其引藥的作用。方法大鼠均分成兩組，分別灌胃給予含或不含牛膝的三妙丸水提物，給藥后2h，4h，6h和7d處死動物，取血漿和心臟、后肢關(guān)節(jié)組織的勻漿，用高效液相色譜法測定組織中小檗堿的濃度。結(jié)果含牛膝三妙丸組動物給藥后關(guān)節(jié)藥物濃度在2h時與去牛膝三妙丸組相近，4h明顯高于去牛膝組，6h與去牛膝組相近，多次給藥后明顯高于去牛膝組。含牛膝組的關(guān)節(jié)/心臟藥物濃度比始終明顯大于去牛膝組。結(jié)論牛膝有促進三妙丸中有效成分小檗堿向關(guān)節(jié)組織分布的作用。

【關(guān)鍵詞】牛膝三妙丸小檗堿組織分布

Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofAchyranthesbidentataBl.inSanmiaopillsonBerberine‘stissuedistributioninnormalrats.MethodsTheratsweredividedintotwogroupsgiventhewaterextractofSanmiaopillwithorwithoutAchyranthesbidentataBl.respectively.2,4,6hoursand7dayslatertheanimalswerekilledandthetissuehomopenateofheart,arthrosisandbloodwasprepared,andtheberberineconcentrationwasdetectedbyHPLC.ResultsThearthrosisconcentrationwasthesameintheratswithandwithoutAchyranthesbidentataBl.in2and6hours,andobviouslyhigherin4hoursand7dayswithAchyranthesbidentataBl.TheconcentrationratioofarthrosisandheartwassignificantlyhigherinratswithAchyranthesbidentataBl.atallbidentataBl.hasenhancingeffectonberberine‘sarthrosisdistribution.

Keywords：AchyranthesbidentataBl.;Sanmiaopills;Berberine;Tissuedistribution

三妙丸是從古代的二妙散演變而來的，方中蒼術(shù)燥濕健脾，黃柏清熱燥濕，牛膝引藥下行，故治濕熱下注等癥。中醫(yī)典籍中記載，牛膝除了具有化瘀通絡(luò)、補肝強腎功效外，還有“引藥下行”的作用，因此多用于治療下肢疾患。如《寒溫條辨》記載：“牛膝,生用其性下走如奔,破血癥,通經(jīng)閉,引諸藥下行?！薄侗窘?jīng)逢原》亦云：“丹溪言牛膝能引諸藥下行,筋骨痛風在下者宜之?！?/p>

牛膝“引藥下行”的作用雖然被諸多醫(yī)書所記載，但其作用機理尚不明確，有研究認為其“引藥下行”作用可能是與蒼術(shù)、黃柏的藥效協(xié)同作用［1］，但是否與現(xiàn)代醫(yī)學中認為的促進有效成分向病灶部位分布有關(guān)尚待研究。本文采用藥物組織分布的研究方法，觀察牛膝對三妙丸中有效成分小檗堿在大鼠口服后組織分布的影響，以探索牛膝在三妙丸中“引藥”的作用機理。

1材料與儀器

藥材黃柏PhellodendronchinenseSchneid.產(chǎn)地四川，牛膝AchyranthesbidentataBl.產(chǎn)地河南，蒼術(shù)Atractylodeslancea(Thunb)DC.產(chǎn)地安徽，均購自本地藥房。符合《中國藥典》Ⅰ部標準。

化學對照品鹽酸小檗堿對照品，購于中國藥品生物制品檢定所。

試劑乙腈色譜級，美國TEDIA公司生產(chǎn)；磷酸二氫鉀、三乙胺均為分析純。

儀器島津LC-10ATvp高效液相色譜儀，配SPD-10Avp紫外－可見檢測器。電動玻璃組織勻漿機，寧波新芝生物科技有限公司提供。

動物SD大鼠，體重180～240g，雌雄各半，由安徽省醫(yī)科大學動物中心提供，實驗前和實驗過程中正常飼養(yǎng)和飲水，并觀察健康狀況。

2方法與結(jié)果

樣品處理方法

血漿樣品處理方法按照參考文獻［2，3］方法，并經(jīng)過預(yù)試，確定以下血樣處理方法：抗凝血離心后吸取血漿ml，加入乙腈4ml，渦旋混勻3min，3000r·min-1離心10min，取盡上清液40℃氮氣吹干，精密加入流動相1ml使溶解，進樣20μl，進行HPLC測定。

心臟組織樣品處理方法取心臟剪開后用生理鹽水沖洗干凈，用手術(shù)剪刀剪碎，取1g加蒸餾水2ml，于勻漿機上勻漿，勻漿液離心后取上清液1ml，加入乙腈4ml，渦旋混勻3min，3000r·min-1離心10min，取盡上清液40℃氮氣吹干，精密加入流動相1ml使溶解，進樣20μl，進行HPLC測定。

關(guān)節(jié)組織樣品處理方法從大鼠髁關(guān)節(jié)上1cm處剪下大鼠整個后足，剝?nèi)テつw，生理鹽水沖洗干凈，用剪刀剪取從髁關(guān)節(jié)上1cm到下1cm的全部關(guān)節(jié)，并剪碎，稱取1g，置于勻漿管中，加蒸餾水2ml，于勻漿機上勻漿，勻漿液離心后取上清液1ml，加入乙腈4ml，渦旋混勻3min，3000r·min-1離心10min，取盡上清液40℃氮氣吹干，精密加入流動相1ml使溶解，進樣20μl，進行HPLC測定。

小檗堿測定方法的考察

色譜條件ODSC18色譜柱，流動相為乙腈∶M磷酸二氫鉀溶液＝27∶73，流速1ml·min-1,檢測波長為345nm。

特異性分別對空白血清樣品、空白心臟樣品、空白關(guān)節(jié)樣品、小檗堿對照品，實測樣品進行處理和進樣，血樣處理方法同上。記錄色譜圖，見圖1～7。

標準曲線和靈敏度準確吸取小檗堿對照品溶液一定量，加入ml空白血漿，制成含小檗堿濃度為，，，，mg·L-1的標準溶液，同樣品處理方法操作，進行HPLC測定。將測得的峰面積對濃度作回歸曲線，所得的標準曲線為：A=2+，最低檢測限為ng。

圖7關(guān)節(jié)樣品HPLC圖

準確吸取小檗堿對照品溶液一定量，加入1ml空白心臟組織勻漿上清液中，制成含小檗堿濃度為，，，，mg·L-1的標準溶液，同樣品處理方法操作，進行HPLC測定。將測得的峰面積對濃度作回歸曲線，所得的標準曲線為：A=+，最低檢測限為ng。

準確吸取小檗堿對照品溶液一定量，加入1ml空白關(guān)節(jié)組織勻漿上清液中，制成含小檗堿濃度為，，，，，mg·L-1的標準溶液，同樣品處理方法操作，進行HPLC測定。將測得的峰面積對濃度作回歸曲線，所得的標準曲線為：A=4+，最低檢測限為ng。

回收率和精密度測定以血液mg·L-1，心臟和關(guān)節(jié)組織mg·L-1兩種濃度考察測定回收率和精密度。結(jié)果回收率和精密度均符合要求。

大鼠給藥和組織分布的研究大鼠隨機分成兩組，一組灌胃給予三妙丸的水提液，劑量為18g生藥·kg-1，另一組灌胃給予不含牛膝的三妙丸水提液，劑量為10g生藥·kg-1。給藥后2，4，6h每組分別處死大鼠6只，取血、心臟和關(guān)節(jié)進行測定。動物繼續(xù)給藥，1次/d，共7d，于第7天給藥后6h每組分別處死大鼠6只，取血、心臟和關(guān)節(jié)進行測定。結(jié)果見表1～2。表1單次給藥2h后小檗堿的組織分布與不含牛膝三妙丸組比較，*；**；#為關(guān)節(jié)濃度與心臟或血漿濃度的比值；n＝6

從表1結(jié)果看，含牛膝組動物血液和心臟的藥物分布明顯減少，關(guān)節(jié)分布與未含牛膝組一致。關(guān)節(jié)/心臟比和關(guān)節(jié)/血漿比均明顯高于不含牛膝組。表2單次給藥4h及6h后小檗堿的組織分布同一時間點的不含牛膝三妙丸組比較，*；**；#為關(guān)節(jié)濃度與心臟或血漿濃度的比值；n＝6

從表2結(jié)果看，給藥4h后含牛膝組關(guān)節(jié)組織濃度明顯升高，且遠高于不含牛膝組，關(guān)節(jié)/心臟藥物濃度比明顯大于不含牛膝組。給藥6h后含牛膝三妙丸組組織濃度下降，低于不含牛膝組，但關(guān)節(jié)/心臟藥物濃度比仍高于不含牛膝組。

從表3結(jié)果來看，含牛膝的三妙丸組大鼠給藥后關(guān)節(jié)組織小檗堿蓄積濃度高于去牛膝三妙丸組，關(guān)節(jié)/心臟藥物濃度比值含牛膝三妙丸組明顯高于不含牛膝的三妙丸組。表3多次給藥后小檗堿的組織分布與不含牛膝三妙丸組比較，*,**；#為關(guān)節(jié)濃度與心臟或血漿濃度的比值；n＝6

3討論

郭順根等［4］研究表明，中藥的歸經(jīng)與有效成分的作用靶器官分布有著一定的聯(lián)系。因此通過探討作用靶器官有效成分的分布可在一定程度上驗證中藥的引經(jīng)歸經(jīng)理論。

本實驗選擇心臟作為藥物的非作用靶器官進行參照，后肢足關(guān)節(jié)為藥物作用的靶器官，血液為貫穿全身的組織。三妙丸中的小檗堿具有抗炎消腫的作用，是三妙丸中的有效成分之一，以其作為研究對象具有檢測可靠性強，作用代表性明確的優(yōu)點。

文獻研究［5］表明，大鼠靜脈注射小檗堿后，藥物迅速分布到組織，其中分布最高的為心，其次為腎、肺和腸。血液中的藥物濃度僅為心臟中的1/23。這與本文中后期血藥濃度低到不可測，而心和關(guān)節(jié)的濃度仍可測得相一致。

從給藥后的情況來看，含牛膝三妙丸組2h時心臟和血液小檗堿分布少，但關(guān)節(jié)分布與去牛膝組的相當；4h時去牛膝三妙丸組心臟和關(guān)節(jié)小檗堿濃度開始明顯下降，而含牛膝三妙丸組心臟和關(guān)節(jié)中小檗堿濃度均明顯增加，且顯著大于去牛膝組；6h后含牛膝組和不含牛膝三妙丸組小檗堿濃度均下降。從單次給藥后各時間點的關(guān)節(jié)/心臟小檗堿濃度比數(shù)據(jù)來看，含牛膝組小檗堿在關(guān)節(jié)中的分布比例始終高于不含牛膝組，表明了牛膝有將藥物引向關(guān)節(jié)的趨勢。多次給藥后小檗堿的組織分布趨于平衡，含牛膝組的關(guān)節(jié)組織分布濃度明顯高于去牛膝組，而關(guān)節(jié)/心臟比值較單次給藥時降低。

從以上結(jié)果可初步推斷牛膝在三妙丸中的引藥作用與促進有效成分向靶器官—足關(guān)節(jié)的分布有關(guān)。本研究嘗試性地采用藥代動力學研究方法研究牛膝的引藥理論，為中藥的引經(jīng)研究提供新思路，也為開發(fā)中藥引導(dǎo)藥物做些基礎(chǔ)工作。

【參考文獻】

［1］尹蓮，徐立，時樂，等加味四妙丸有效部位群的篩選研究［J］.世界科學技術(shù)－中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2005，7：28.

［2］趙玉男，邢東明，丁怡，等解熱藥YL2000中小檗堿在正常和發(fā)熱大鼠體內(nèi)的藥物動力學比較［J］.中國藥理學通報，2003，19