食品安全檢測技術

第一節(jié)食品安全檢測技術概論

食品安全檢測技術主要包括如下幾個方面的內(nèi)容:①光譜分析技術;②電子傳感器技術;③生物傳感技術;④生物芯片檢測技術;⑤免疫學檢測技術;⑥聚合酶鏈檢測技術(PCR技術)。當前第1頁\共有68頁\編于星期二\15點一、色譜分析技術

色譜技術是幾十年來分析化學中最富活力的領域之一。作為一種物理化學分離、分析方法，色譜技術最初僅僅是作為一種分離手段。到20世紀50年代，隨著生物技術的迅猛發(fā)展，人們才開始把這種分離手段與檢測系統(tǒng)連接起來，成為在環(huán)境、生化、藥物、精細化工產(chǎn)品及食品污染物分析等領域中廣泛應用的物質(zhì)分離和分析的一種重要手段。當前第2頁\共有68頁\編于星期二\15點色譜法有多種類型，可分為以下幾種：(1)按流動相的物態(tài)可分為氣相色譜法(流動相為氣體)和液相色譜法(流動相為液體)。(2)按固定相的物態(tài)可分為氣固色譜法(固定相為固體吸附劑)、氣液色譜法(固定相為涂在固相載體上或毛細管壁上的液體)、液固色譜法和液液色譜法。(3)按固定相的使用形式可分為柱色譜法(固定相裝在色譜柱中)、紙色譜(固定相為濾紙〉和薄層色譜法(固定相為吸附粉末制成的薄層)。(4)按分離過程的機制可分為吸附色譜法(利用吸附劑表面對不同組分物理吸附性能的差異進行分離)、分配色譜法(利用不同組分在兩相中有不同的分配系數(shù)來進行分離)、離子交換色譜法(利用離子交換原理)和排阻色譜法(利用多孔性物質(zhì)對不同大小的排阻作用)等。當前第3頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第4頁\共有68頁\編于星期二\15點二、氣相色譜法（GC）

氣相色譜（gaschromatography簡稱GC）是二十世紀五十年代出現(xiàn)的一項重大科學技術成就。氣相色譜是采用氣體作為流動相的一種色譜法。在此方法中，載氣(不與被測物作用，用來載送試樣的惰性氣體，如氫氣、氮氣等)承載著待分離或檢測的試樣通過色譜柱中的固定相，使試樣中各組分分離，然后分別檢測。具有分離效能高、靈敏度高、分析速度快、應用范圍廣等重要特點。當前第5頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第6頁\共有68頁\編于星期二\15點安捷倫氣相色譜儀6890N當前第7頁\共有68頁\編于星期二\15點氣相色譜的組成和工作流程當前第8頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第9頁\共有68頁\編于星期二\15點氣相色譜法用于食品添加劑的檢測

氣相色譜用于食品中致病菌的檢測當前第10頁\共有68頁\編于星期二\15點三、高效液相色譜法

高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，

HPLC)是指流動相為液體的色譜技術，也叫高壓液相色譜。它是在經(jīng)典液相色譜法的基礎上，于20世紀60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的一項高效、快速的分離分析技術，具有高壓、高速、高效和高靈敏度的特點?？捎糜诟叻悬c、熱穩(wěn)定性好、相對分子量較大(大于400以上)的有機物的分離和檢測。當前第11頁\共有68頁\編于星期二\15點高效液相色譜的組成和工作流程當前第12頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第13頁\共有68頁\編于星期二\15點氨基甲酸脂類農(nóng)藥是一類應用范圍廣、藥效高、對哺乳動物毒性較有機磷低的農(nóng)藥，由于這類農(nóng)藥多數(shù)為熱不穩(wěn)定，因此不適合采用氣相色譜測定。有機磷農(nóng)藥中大多數(shù)化合物的吸收都在遠紫外，故用氣相色譜分析比較方便。但該類農(nóng)藥中有些農(nóng)藥性質(zhì)不很穩(wěn)定，故可使用高效液相色譜技術進行分析。高效液相色譜可用于食品中獸藥殘留檢測。當前第14頁\共有68頁\編于星期二\15點計算機技術對

食品安全檢測技術產(chǎn)生的影響體現(xiàn)1.計算機技術提高了食品安全檢測系統(tǒng)的數(shù)據(jù)處理能力2.計算機促進食品安全檢測技術自動化程度的提高3.計算機使食品安全檢測更趨智能化當前第15頁\共有68頁\編于星期二\15點第二節(jié)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術

一、GC-MS系統(tǒng)的組成

計算機系統(tǒng)交互式地控制氣相色譜、接口和質(zhì)譜儀，進行數(shù)據(jù)采集和處理，是GC-

MS的中央控制單元。當前第16頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第17頁\共有68頁\編于星期二\15點二、GC-MS聯(lián)用中主要的技術問題1.儀器接口

氣相色譜儀的入口端壓力高于大氣壓，在高于大氣壓力的狀態(tài)下，樣品混合物的氣態(tài)分子在載氣的帶動下，因在流動相和固定相上的分配系數(shù)不同而產(chǎn)生的各組分在色譜柱內(nèi)的流速不同，使各組分分離，最后和載氣一起流出色譜柱。當前第18頁\共有68頁\編于星期二\15點質(zhì)譜儀中的樣品氣態(tài)分子在具有一定真空度的離子源中轉化為樣品氣態(tài)離子。這些離子在高真空的條件下進入質(zhì)量分析器運動。在質(zhì)量掃描部件的作用下，檢測器記錄這些離子流強度及其隨時間的變化。當前第19頁\共有68頁\編于星期二\15點儀器接口接口技術中要解決的問題是氣相色譜儀的大氣壓的工作條件和質(zhì)譜儀的真空工作條件的連接和匹配。接口要把氣相色譜柱流出物中的載氣盡可能多地除去，保留或濃縮待測

物，協(xié)調(diào)色譜儀和質(zhì)譜儀的工作流量。當前第20頁\共有68頁\編于星期二\15點2.掃描速度

沒有與色譜儀連接的質(zhì)譜儀一般對掃描速度要求不高。和氣相色譜儀連接的質(zhì)譜儀，由于氣相色譜峰很窄，有的僅幾秒時間。一個完整的色譜峰通常需要至少6個以上數(shù)據(jù)點。這樣就要求質(zhì)譜儀有較高的掃描速度，才能在很短的時間內(nèi)完成多次全質(zhì)量范圍的質(zhì)量掃描。另一方面，要求質(zhì)譜儀能很快地在不同的質(zhì)量數(shù)之間來回切換，以滿足選擇離子檢測的需要。當前第21頁\共有68頁\編于星期二\15點三、GC-MS聯(lián)用儀和氣相色譜儀的主要區(qū)別

GC-MS聯(lián)用后，氣相色譜儀部分的氣路系統(tǒng)和質(zhì)譜儀的真空系統(tǒng)幾乎不變，僅增加了接口的氣路和接口真空系統(tǒng)。氣質(zhì)聯(lián)用法和氣相色譜法一些性能和操作上的區(qū)別：

①GC-MS方法定性參數(shù)增加，定性遠比GC方法可靠。②GC-MS方法靈敏度卻遠高于GC方法。③采用氣質(zhì)聯(lián)用中的提取離子色譜、選擇離子檢測等技術可降低化學噪聲的影響④氣質(zhì)聯(lián)用儀的定量精度優(yōu)于氣相色譜儀。⑤氣質(zhì)聯(lián)用中檢測器不需要經(jīng)常清洗，最常需要清洗的是離子源或離子盒。當前第22頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第23頁\共有68頁\編于星期二\15點四、GC-MS聯(lián)用儀器的分類GC-MS儀器的分類：按照質(zhì)譜技術：

GC-MS通常是指四極桿質(zhì)譜或磁質(zhì)譜，GC-ITMS通常是指氣相色譜-離子阱質(zhì)譜，GC-TOFMS是指氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜等。按照質(zhì)譜儀的分辨率：可以分為高分辨(通常分辨率高于5000)、中分辨(通常分辨率在1000----5000之間)、低分辨(通常分辨率低于1000)氣質(zhì)聯(lián)用儀。當前第24頁\共有68頁\編于星期二\15點GC-MS在食品污染物檢測中的應用

1.GC-MS用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測2.GC-MS用于食品中獸藥殘留的檢測3.GC-MS在食品添加劑檢測4.GC-MS在食品中環(huán)境污染物檢測當前第25頁\共有68頁\編于星期二\15點第三節(jié)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)及接口

色譜與質(zhì)譜(MS)的聯(lián)用集高效分離、多組分同時定性和定量為一體，是分析混合物最為有效的工具。但由于許多有機化合物的高極性、熱不穩(wěn)定性、高分子量和低揮發(fā)度等原因，它們其中的90%以上需要用液相色譜(LC)分離，因此，LC和MS的聯(lián)用在有機混合物分析中具有明顯的優(yōu)越性。當前第26頁\共有68頁\編于星期二\15點液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用接口

自開始研究LC-MS以來，前后至少提出過27種以上的接口技術，但能夠商品化并被廣泛或在一定程度上使用的只有如下幾種。

1.移動帶技術2.直接液體導人接口3.熱噴霧接口4.粒子束接口5.快原子轟擊因此，對于一個現(xiàn)代化并從事多方面分析的實驗室，需要具備幾種LC-MS接口技術，以適應LC分離化合物的多樣性。當前第27頁\共有68頁\編于星期二\15點LC-MS在食品污染物檢測中的應用

LC-MS在食品中農(nóng)藥殘留檢測LC-MS在食品中獸藥殘留檢測LC-MS在食品添加劑檢測當前第28頁\共有68頁\編于星期二\15點第三節(jié)生物芯片檢測技術

生物芯片(biochip)是指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物(如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體)的表面，組成密集二維分子排列。然后與己標記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器，比如激光共聚焦掃描或電荷耦聯(lián)攝影機(CCD)對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程模擬計算機芯片的制備技術，所以稱之為生物芯片技術。當前第29頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第30頁\共有68頁\編于星期二\15點一、生物芯片分析步驟

當前第31頁\共有68頁\編于星期二\15點二、生物芯片在微生物檢測中的應用

采用基因芯片技術建立的水中常見致病菌的檢測與鑒定方法:致病菌污染飲用水可導致多種疾病的暴發(fā)與流行，嚴重威脅著人類的健康。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法及生化鑒定，操作繁瑣，且需要數(shù)天才能得到結果。常規(guī)PCR一次只能檢出一種致病菌，對水中分離的未知菌，或有多種細菌污染的樣品則顯得無從下手。利用在細菌學分類上具有重要意義的16SrRNA基因作為檢測的靶分子，并在其間設計檢測探針，建立一套水中致病菌的基因芯片快速檢測技術(4h)。（可以定性和半定量地檢出致病菌。用這種芯片可以特異地檢出水中副溶血弧菌、李斯特菌、耶爾森菌、變形桿菌及銅綠假單胞菌等）。當前第32頁\共有68頁\編于星期二\15點基因芯片與傳統(tǒng)方法相比其先進性①基因芯片可以對水中致病菌實現(xiàn)高通量、并行檢測，一次實驗即可得出全部結果;②操作簡便、快速，整個檢測4h基本可以得到結果，而傳統(tǒng)的方法(包括儀器分析)一般需要4-7天;③特異性強、敏感性高，可以檢測水中常見的致病菌。當前第33頁\共有68頁\編于星期二\15點三、基因芯片檢測致病菌的特點①基因芯片可以實現(xiàn)對樣品的高通量檢測：

（可以同時對成千上萬個樣品進行檢測與分析）②芯片技術可以對大量樣品進行“并行”檢測。③在基因芯片分析中可以采用熒光對樣品進行標記。④反應體積小，降低了試劑的消耗。⑤反應物在單位體積內(nèi)濃度高，反應快，縮短檢測時間。⑥特異性較強基因芯片檢測的特異性與傳統(tǒng)的PCR結合探針雜交檢測的特異性一致。⑦基因芯片可以完全實現(xiàn)自動化及快速檢測。當前第34頁\共有68頁\編于星期二\15點四、基因芯片技術檢測致病微生物存在的問題1.基因序列信息缺乏2.基因及基因芯片技術專利的限制3.相關技術亟須改進與提高4.檢測費用過高基因芯片技術是一項多學科交叉、基礎研究與應用開發(fā)研究密切結合的技術，必須依靠各相關學科科學家的鼎力合作才能取得突破?；蛐酒夹g本身面臨許多問題需要解決。當前第35頁\共有68頁\編于星期二\15點五、基因芯片技術的發(fā)展前景基因芯片技術一經(jīng)出現(xiàn)就受到各領域的高度重視，并迅速在生命科學領域、醫(yī)藥衛(wèi)生領域，尤其是食品安全領域得到快速發(fā)展。沙門菌、李斯特菌、大腸桿菌O157等致病菌已成為危害食品安全及消費者健康的主要病原菌?？焖俣鴾蚀_地檢測這些致病菌是確保食品安全的首要任務，而基因芯片技術則為快速檢測這些致病菌提供了廣闊的應用前景目前，以生物芯片技術為核心的相關產(chǎn)業(yè)在全球迅速崛起，國際上已有數(shù)百家公司在做相關研究與開發(fā)。基因芯片從實驗室走向工業(yè)化當前第36頁\共有68頁\編于星期二\15點POTOMAC

滲濾式蛋白芯片的設計當前第37頁\共有68頁\編于星期二\15點將應用物品先準備好。檢測實例當前第38頁\共有68頁\編于星期二\15點在晶片盒視窗內(nèi)滴加3滴試劑A，必要時用手輕晃晶片，使膜表面完全浸濕。當前第39頁\共有68頁\編于星期二\15點待完全滲入後，室溫放置1分鐘，加待檢樣品100μl。當前第40頁\共有68頁\編于星期二\15點待血清完全滲入後，再滴加6滴試劑B。當前第41頁\共有68頁\編于星期二\15點待試劑C完全滲入後，最後滴加6滴試劑D。當前第42頁\共有68頁\編于星期二\15點反應完畢後0.5小時內(nèi)，將晶片放入晶片閱讀系統(tǒng)進行閱讀分析。當前第43頁\共有68頁\編于星期二\15點大淵的PBT-X2-02型生物芯片識別儀器組成。當前第44頁\共有68頁\編于星期二\15點第五節(jié)生物傳感器檢測技術生物傳感器的基本原理生物傳感器是由固定化的具有分子識別功能的生物材料、換能器和信號處理放大裝置組成的分析工具或系統(tǒng)。當前第45頁\共有68頁\編于星期二\15點生物傳感器的結構一般有兩個主要組成部分:其一是生物分子識別元件(感受器)，是具有分子識別能力的生物活性物質(zhì)(如組織切片、細胞、細胞器、細胞膜、酶、抗體、核酸、有機物分子等);其二是信號轉換器(換能器)，主要有電化學電極(如電位、電流的測量)、光學檢測元件、熱敏電阻、場效應晶體管等。當待測物與分子識別元件特異性結合后，所產(chǎn)生的復合物(或光、熱等)通過信號轉換器轉變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘枴⒐庑盘柕?，從而達到分析檢測的目當前第46頁\共有68頁\編于星期二\15點換能器（Transducer）感受器（Receptor）測量信號（MeasurableSignal）=分析物（Analyte）溶液（Solution）選擇性膜（Thinselectivemembrane）識別元件（RECOGNITION）生物傳感器工作機理當前第47頁\共有68頁\編于星期二\15點生物傳感器按生物分子識別元件敏感物質(zhì)分類

當前第48頁\共有68頁\編于星期二\15點一、生物傳感器的分類(1)根據(jù)傳感器輸出信號的產(chǎn)生方式可分為生物親和型傳感器、代謝型生物傳感器和催化型生物傳感器。(2)根據(jù)生物傳感器中生物分子識別元件的敏感性物質(zhì)可分為酶傳感器、微生物傳感器、組織傳感器、基因傳感器、免疫傳感器等。(3)依據(jù)生物傳感器的信號轉換器可分為電化學生物傳感器、半導體生物傳感器、測熱型生物傳感器、測光型生物傳感器、測聲型生物傳感器等。當前第49頁\共有68頁\編于星期二\15點生物傳感器在食品污染物檢測中的應用

1.農(nóng)藥和抗生素殘留分析檢測

(1)農(nóng)藥殘留的生物傳感器檢測目前，有機磷農(nóng)藥中的馬拉松、甲基馬拉松、速效磷、久效磷和百治磷等，以及氨基甲醋類農(nóng)藥中的滴滅威、西維因、滅蟲多和殘殺威等農(nóng)藥在食品中殘留量的生物傳感器檢測都有相應的研究報道。

(2)抗生素殘留分析2.生物傳感器在食品添加劑檢測3.生物傳感器在食品微生物污染檢測食品中常見沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、產(chǎn)氣英膜梭菌和蠟樣芽抱桿菌等目前都可用光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和DNA生物傳感器進行檢測。4.生物傳感器在食品生物毒素污染檢測

細菌和真菌毒素的檢測當前第50頁\共有68頁\編于星期二\15點三、生物傳感器的發(fā)展趨勢1.開發(fā)新材料2.采用新工藝3.研究多功能集成傳感器4.研究智能型傳感器5.研究仿生傳感器由于生物傳感器具有方便、快捷、選擇性高、可用于復雜體系等突出的優(yōu)越性，它在分析儀器市場中所占的份額越來越大，并已開始大量取代相同領域內(nèi)的其他分析儀器。當前第51頁\共有68頁\編于星期二\15點快速葡萄糖(glucose)分析儀生物傳感器應用舉例當前第52頁\共有68頁\編于星期二\15點德國研發(fā)的環(huán)境廢水BOD分析儀當前第53頁\共有68頁\編于星期二\15點一種血糖乳酸自動分析儀當前第54頁\共有68頁\編于星期二\15點第六節(jié)酶聯(lián)免疫(ELISA)吸附測定免疫酶技術(ELISA)是將抗原一抗體反應的特異性與酶的高效催化作用有機結合的一種方法。它以酶作為標記物，與抗體或抗原連接，與相應的抗原或抗體作用后，通過底物的顏色反應做抗

原一抗體的定性和定量。目前應用最多的免疫酶技術是酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，它是使抗原或抗體吸附于固相載體，使隨后進行的抗原、抗體反應均在載體表面進行，從而簡化了分離步驟，提高了靈敏度，既可檢測抗原，也可檢測抗體。當前第55頁\共有68頁\編于星期二\15點一、酶聯(lián)免疫吸附測定原理以間接法測定抗體為例簡要說明其原理:利用聚苯乙烯微量反應板作為固相免疫吸附劑，吸附抗原，使之固定化，此過程稱之為包被。之后加待測抗體，再加相應的酶標記抗抗體進行兩次抗原-抗體的特異性免疫反應，生成抗原-抗體-酶標記抗抗體復合物。最后加入酶的底物，進行酶促反應，生成有色產(chǎn)物，待測抗體的量與有色產(chǎn)物的顏色成正比，用特定波長測定產(chǎn)物的光吸收值即可得到待測抗體的量。當前第56頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第57頁\共有68頁\編于星期二\15點當前第58頁\共有68頁\編于星期二\15點DNM-9602G酶標分析儀DNM-9602標配酶標分析儀

DNM-9602A酶標分析儀幾種酶標分析儀當前第59頁\共有68頁\編于星期二\15點二、酶免疫測定法的特點酶免疫測定法是利用抗原一抗體的免疫學反應的實驗技術，具有高度特異性，要求參加反應的抗原和抗體純度高，消除非特異性反應和假陽性反應，避免交叉反應，去除內(nèi)源性酶活性等。酶免疫測定法是利用抗原抗體的初級免疫學反應和酶的高效催化底物反應的特點，具有生物放大作用，所以反應靈敏，可檢出濃度在納克級水平。酶免疫測定法中所使用的試劑都比較穩(wěn)定，按照一定的實驗程序進行測定，實驗結果重復性較好，有較高的準確性。酶免疫測定法成本低，操作簡便，可同時快速測定多個樣品，不需要特殊的儀器設備。當前第60頁\共有68頁\編于星期二\15點三、幾種常用類型的ELISA測定法1.間接法測抗體效價2.雙抗體夾心法測定抗原量3.競爭法測定抗原量當前第61頁\共有68頁\編于星期二\15點免疫標記技術放射物標記技術酶標技術免疫熒光技術其他標記技術酶聯(lián)免疫吸附技術酶免疫組化技術雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法間接法雙位一點法當前第62頁\共有68頁\編于星期二\15點ELISA在食品污染物檢測中的應用主要集中在以下幾方面(1)真菌毒素的檢測

（1977年，LaWell首次采用了ELISA法來檢測黃曲霉毒素）。近十幾年來國內(nèi)外用于生物毒素檢測的ELISA方法得到迅速發(fā)展，已有多種ELISA診斷試劑盒用于分析不同的毒素。可檢測的真菌毒素有黃曲霉毒素B1、M1，赫曲霉毒素A(OA)等。當前第63頁\共有6